刺激植物响应蛋白基因Epl1的载体构建及酵母转化

刺激植物响应蛋白基因的载体构建及酵母转化
作者：遇文婧刘志华王志英古丽吉米拉米吉提黄颖刁桂萍
来源：《安徽农业科学》2014年第19期
（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040；2.黑龙江省森林保护研究所，黑龙江哈尔滨 150040）
摘要［目的］构建刺激植物响应蛋白基因的真核表达载体，筛选多拷贝酵母转化子。

［方法］以深绿木霉（）ACCC30153的cDNA为模板进行PCR 获得基因片段，并将目的片段插入表达载体pPIC9K的相应位置，获得重组表达载体，并将转入毕赤酵母（）GS115中，并用不同中终浓度的遗传霉素G418筛选多拷贝重组酵母菌株。

［结果］对重组载体进行PCR及双酶切检测为阳性；在含有终浓度为2 mg/ml遗传霉素G418的YPD平板上筛选得到7株多拷贝的转化子，经PCR鉴定1株转化子呈阳性。

［结论］基因的载体构建及多拷贝酵母转化子筛选为以后大量分离纯化Epl1蛋白并研究其功能奠定基础。

关键词深绿木霉ACCC30153；刺激植物响应蛋白；毕赤酵母
中图分类号文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06163-03
Abstract ［Objective］ To construct eukaryon expression vector of the eliciting plant response
en multicopy yeast transformant. ［Method］
Based on the cDNA
The recombina
transformants was screened by Geneticin 418 with different final concentration. ［Result ］ PCR and
n multicopy yeast
transformants were obtained on the YPD medium containing with final concentration of 2 mg/ml, and one strain was positive by PCR detection. ［Conclusion ］ The vector construction of Epl1 gene and
screening of high expressing yeast transform
基金项目 哈尔滨市科技局青年科技创新人才项目（2013RFQXJ02）资助；中央高校基本科研业务费专项资金项目（2572014 BA08）。

作者简介 遇文婧（1984- ），女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，研究方向：森林保护。

*通讯作者，副教授，从事森林保护研究。

收稿日期
刺激植物响应蛋白Epl1（Eliciting plant response protein 1）是一种小分子分泌型半胱氨酸富含蛋白，属于
家族。

对来源于绿色木霉（
）刺激植物响应蛋白
［1］和深绿木霉（
）的刺激植物响应蛋白Epl1研究表明，2个蛋白均对植物无任何毒性，还具有促进植物生长提高植物对病害的免疫作用
［2］。

王允
等
［3］将棘孢木霉（
）T4菌株的
（Epl1）基因转化到毕赤酵
母（P.pastoris ）中，用重组蛋白Eplt4处理大豆叶片，接种大豆灰斑病（Cercosporidium sofinum ）
后，感病区域（0.75%）明显低于未用EplT4处理的大豆叶片（5.17%）。

＇等研究表明，深绿木霉（
）ATCC 74058 菌株的Epl1蛋白能在
不同碳源诱导下检测到，而且在立枯丝核菌（）细胞壁诱导和立枯丝核
菌对峙培养条件下均高表达
［4］。

Freitas 等对来源于绿色木霉刺激植物响应蛋白SM1
研究发现，用缺失SM1基因的木霉处理感染炭疽病的玉米叶片，叶片病斑明显多于野生型木霉处理过的感病叶片，证明SM1基因能够诱导植物产生系统抗性（ISR ）
［5］。

上述
研究都证实了刺激植物响应蛋白是木霉诱导抗性机制所需要的。

笔者从深绿木霉ACCC30153
菌株中分离出一个刺激植物响应蛋白基因，将其ORF 的cDNA 构建到高效毕赤酵母真核表达载体上，并用电转化方法将基因转化到毕赤酵母GS115中，通过遗传霉素筛
选获得转基因毕赤酵母菌株，以期为后续大量分离纯化Epl1蛋白并研究其功能奠定良好基
础。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与载体。

深绿木霉（）ACCC30153菌株，由中国农业微生物保
藏管理中心提供；毕赤酵母（
）GS115菌株、真核表达载体菌株
和大肠杆菌TOP10 菌株，均由哈尔滨工业大学生物实验室提供。

1.1.2 主要试剂。

内切酶，
，
及T4 DNA 连接酶，购自
Promega 公司；
，购自上海生工公司；DNA Marker DL2000，购自北京泛基诺生物技术公司；酵母基因组DNA 提取试剂盒，购自天为时代公司；
（G418），购自Invitrogen 公司；（）
，购自Amresco 公司。

1.2 方法
1.2.1 深绿木霉基因高效毕赤酵母真核表达载体构建。

在深绿木霉Epl1的ORF 序
列两端引入和
酶切位点，进行PCR 扩增并回收目的片段。

采用
I 和
双酶切，将目的片段连入pPIC9K 载体，获得
重组质粒，并对
重组质粒进行PCR 和双酶切检测。

根据基因序列和酵母表达载体的多克隆位点设计
并合成的引物序列如下：
上游引物Ep1y ：
（划线部分为
酶切位点）；
下游引物Ep2y
：
（划线为
酶切位点）。

1.2.2 毕赤酵母转化及其转化子的筛选。

采用电转法将重组质粒转化到感受态酵母细胞中，涂于RDB （
山梨醇，10 g/L 琼脂粉，100 ml/L 10×Dextrose ，100
酵母氮源碱，2 ml/L 500×Biotin ，10 ml/L 100×50 含
谷氨酸，
蛋氨酸，
赖氨酸，
亮氨酸和
异亮氨酸的氨基酸）平板，30 ℃培养。

挑取单菌落摇菌，然后
分别取10 μl 菌液点在含遗传霉素0、0.5、0.75、1.0、1.75和2.0 mg/ml YPD 平板上培养，挑
取含高浓度遗传霉素G418的YPD平板上的转化子，于BMGY培养基中30 ℃振荡培养，提取酵母基因组DNA，并进行PCR 检测［6］。

2 结果与分析
2.1 刺激植物响应蛋白基因真核表达载体的构建对所构建的深绿木霉
基因真核表达载体进行了PCR和双酶切验证。

用载体构建引物可从转化子中扩增出大小为400~500 bp左右的目的片段（图1），初步验证了目的基因已经于载体pPIC9K链接成功。

用和进行双酶切同样可获得目的基因条带（图2），说明基因已经正确连入载体pPIC9K 中。

注：M为DNA marker DL2000；1-4为PCR 产物。

图1 重组质粒的PCR检测
注：M为DNA marker DL2000；1~3为重组载体双酶切产物；4为空载体
pPIC9K
双酶切产物。

图2 重组质粒双酶切检测
2.2 高效毕赤酵母转化子的筛选及鉴定通过电转化将重组质粒转入毕赤酵母GS115感受态细胞，用不含组氨酸的RDB基本培养基对转化子进行筛选，以未转化酵母菌株GS115作为对照（图3）。

从RDB转化平板上选取50个重组子分别接种到含有不同终浓度遗传霉素G418的YPD培养基上，30 ℃培养5 d。

图4表明，在不添加G418的YPD平板上所有转化子均继续生长；在含有终浓度为0、0.5、0.75和1.0 mg/ml G418 的YPD平板上少量转化子不生长；在含有终浓度为1.75 mg/ml G418的YPD 平板上少量转化子生长；而在含有终浓度为
的YPD平板上仅有1株转化子生长。

PCR检测结果可从终浓度为2.0 mg/ml G418的YPD平板上的转化子中扩增出大小约为869 bp的目的片段（包含452 bp 载体长度），与重组载体的目的条带一致，呈阳性；而对照空载体转化子的PCR条带大小约为452 bp，与载体pPIC9K的PCR条带
一致（图5）。

以上结果表明，已成功获得1株高效表达的毕赤酵母转化菌株。

注：A为转入重组载体的毕赤酵母；B为未转化酵母菌株GS115。

图3 毕赤酵母转化
3 结论与讨论
刺激植物响应蛋白Epl1是来源于生物防治菌木霉（）的诱导植物系统防御响应的小分子疏水蛋白，能够刺激植物生长并提高其免疫能力。

由于我们很难从木霉中
直接分离大量天然的Epl1蛋白，因此Epl1
重组蛋白的表达是研究的首选方向。

目前而言，一种是利用大肠杆菌原核表达载体进行重组表达。

大肠杆菌表达的重组蛋白优势在于重组菌株构建容易，重组蛋白产量高，发酵条件即经济又可控制，唯一的缺点是重组蛋白往往形成包涵体，无活性，必须经过复性后才能后续应用。

现已成功在大肠杆菌中表达的蛋白及酶类有：哈茨木霉（）内切几丁质酶Chit33和［7］，以及深绿木霉（）P1的内切几丁质酶ech30均在大肠杆菌中成功表达［8］。

另外棘孢木霉（）T203促进植物生长的氨基环丙烷-羧酸脱氨酶ACCD 在大肠杆菌中表达出有活性的酶［9］，此外还包括李氏木霉
（）的等多种具有活性的酶类及蛋白类［10］。

另一种是利用巴斯德毕赤酵母（）高效表达系统进行酵母表达。

毕赤酵母表达系统的优势在于可以在廉价的非选择性培养基中生长，具有旺盛的生长力，对发酵过程中产生的乙醇具有耐受性，有较好的发酵基础，非常有利于实现高密度发酵培养。

现已经成功在毕赤酵母中表达的具有活性的酶及蛋白类有：绿色木霉（）诱导子［11］及哈茨木霉（）T34的角质酶Thcut1等［12］。

有关刺激植物响应蛋白的研究已有报道，但其分子作用
机制仍不十分清楚。

试验将深绿木霉刺激植物响应蛋白
注：A为G418终浓度为0 mg/ml；B为G418终浓度为0.5 mg/ml；C为G418终浓度为0.75 mg/ml；D为G418终浓度为1.0 mg/ml；E为G418终浓度为1.75 mg/ml；F为G418终浓
度为2.0 mg/ml。

图4 多拷贝酵母转化子的筛选
注：1为重组菌株基因组DNA的PCR产物；2为Marker DL2000；3为空载体转化子基因组DNA的PCR产物；4为载体pPIC9K的PCR产物；5为重组质粒的PCR 产物对照。

图5 重组菌株的 PCR检测
基
因克隆到分泌性表达载体pPIC9K 上，可以使酵母转化子合成的重组Epl1蛋白直接分泌到培养基中，这种设计可大大简化后期重组Epl1的提取工艺，便于得到高活性Epl1产品。

将阳性重组质粒转化到毕赤酵母菌株GS115中获得多克隆拷贝的重组基因工程菌株，为
基因编码蛋白的大量生产、纯化、蛋白结构和功能研究提供了
理论基础。

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出师表
两汉：诸葛亮
先帝创业未半而中道崩殂，今天下三分，益州疲弊，此诚危急存亡之秋也。

然侍卫之臣不懈于内，忠志之士忘身于外者，盖追先帝之殊遇，欲报之于陛下也。

诚宜开张圣听，以光先帝遗德，恢弘志士之气，不宜妄自菲薄，引喻失义，以塞忠谏之路也。

宫中府中，俱为一体；陟罚臧否，不宜异同。

若有作奸犯科及为忠善者，宜付有司论其刑赏，以昭陛下平明之理；不宜偏私，使内外异法也。

侍中、侍郎郭攸之、费祎、董允等，此皆良实，志虑忠纯，是以先帝简拔以遗陛下：愚以为宫中之事，事无大小，悉以咨之，然后施行，必能裨补阙漏，有所广益。

将军向宠，性行淑均，晓畅军事，试用于昔日，先帝称之曰“能”，是以众议举宠为督：愚以为营中之事，悉以咨之，必能使行阵和睦，优劣得所。

亲贤臣，远小人，此先汉所以兴隆也；亲小人，远贤臣，此后汉所以倾颓也。

先帝在时，每与臣论此事，未尝不叹息痛恨于桓、灵也。

侍中、尚书、长史、参军，此悉贞良死节之臣，愿陛下亲之、信之，则汉室之隆，可计日而待也。

臣本布衣，躬耕于南阳，苟全性命于乱世，不求闻达于诸侯。

先帝不以臣卑鄙，猥自枉屈，三顾臣于草庐之中，咨臣以当世之事，由是感激，遂许先帝以驱驰。

后值倾覆，受任于败军之际，奉命于危难之间，尔来二十有一年矣。

先帝知臣谨慎，故临崩寄臣以大事也。

受命以来，夙夜忧叹，恐托付不效，以伤先帝之明；故五月渡泸，深入不毛。

今南方已定，兵甲已足，当奖率三军，北定中原，庶竭驽钝，攘除奸凶，兴复汉室，还于旧都。

此臣所以报先帝而忠陛下之职分也。

至于斟酌损益，进尽忠言，则攸之、祎、允之任也。

愿陛下托臣以讨贼兴复之效，不效，则治臣之罪，以告先帝之灵。

若无兴德之言，则责攸之、祎、允等之慢，以彰其咎；陛下亦宜自谋，以咨诹善道，察纳雅言，深追先帝遗诏。

臣不胜受恩感激。

今当远离，临表涕零，不知所言。