单克隆抗体制备之细胞融合

单克隆抗体制备之细胞融合
细胞融合：⼴义上的细胞融合指两个或者多个细胞的原⽣质体融合形成⼀个杂种细胞的过程。

⼴义上的细胞融合可以是同种属的细胞发⽣，也可以是不同种属的细胞发⽣。

在单抗制备过程中的细胞融合专指瘤细胞与脾细胞的融合。

在介绍融合技术之前，有必要先了解⼀下⾻髓瘤细胞。

⾻髓瘤细胞的选择在前⾯概述部份就讲到，为了便于筛选出成功融合的杂交瘤细胞，需要选择DNA合成主要途径缺陷型的⾻髓瘤细胞（HGPRT-或TK-）与脾细胞融合，通常是HGPRT-的⾻髓瘤细胞。

要得到这种细胞需要做两件事，第⼀是得到⾻髓瘤细胞，第⼆步是诱导和筛选出HGPRT-的⾻髓瘤细胞。

⼀般可以通过向⼩⿏腹腔内注射碳氢化合物、⽯蜡或者油类物质⽽诱发其产⽣⾻髓瘤细胞，通常的做法是注射降植烷（Pristane，⼜称姥鲛烷）。

诱导出⾻髓瘤后，在⽆菌条件下取出此⾻髓瘤，⽤完全培养基培养⼀段时间后，再⽤8-氮杂鸟嘌呤或者5-溴脱氧尿嘧啶核苷酸进⾏筛选即可得到HGPRT-的⾻髓瘤细胞。

对于第⼀步的诱导过程，⽬前只有BALB/C和N2B品系的⼩⿏才具有⾼度的敏感性。

⽬前最常⽤的⾻髓瘤是来⾃BALB/C⼩⿏的，为了减⼩远亲属种系之间的排斥反应，单抗制备中⽤来免疫的动物品系应该与⾻髓瘤来源的品系相同。

1972年，Potter第⼀次从Balb/C⼩⿏中分离⾻髓瘤细胞株MOPC,第⼀次⽤于脾细胞融合的⾻髓瘤细胞株为P3-X63-Ag8,简称X63或P3，它由Milstain 实验室将P3K(源⾃MOPC)细胞系经8-Aza筛选得到。

X63⾃⾝不能分泌完整的免疫球蛋⽩，但是可以合成并分泌γ1重链和κ轻链，因此如果⽤X63⾻髓瘤细胞与脾脏融合，得到的融合细胞除分泌脾细胞的抗体外，还可以分泌X63的γ1链和κ链。

后来⼜从P3K细胞系选育出另⼀变种P3-NS1-Ag4-1,简称NS-1,它不能合成γ1重链，能合成κ轻链，但是合成之后在细胞内降解⽽不能被分泌出来。

后来⼈们⼜陆续地筛选出完全不产⽣⾃⾝Ig的⾻髓瘤细胞系，如最常见的SP2/0。

⽬前可⽤于融合的⼩⿏⾻髓瘤细胞系种类见下表：
细胞系简称来源染⾊体数分泌Ig链
P3-X63-Ag8P3或X63Balb/C⼩⿏MOPC2165γ1,κ
P3-NS1/1-Ag4-1NS1P365κ(⾮分泌型)
SP2/0-Ag14SP2/0P3和Balb/C脾细胞杂
交
72-
P3-X63-Ag8.653P3-653P358-
P3-X63-Ag8-UI P3UI P3-
FO SP2/0-Ag14克隆72-
S194/5.XX0.BU1S194Balb/C⼩⿏κ(⾮分泌)
MPC11-X45.6TG MPC11Balb/C⼩⿏62IgG2b,κ
⽤于融合的⾻髓瘤细胞在使⽤前应先置于含有⼋-氮杂鸟嘌呤或者5-溴脱氧尿嘧啶核苷酸等筛选培养基中培养，以确保⾻髓瘤细胞⽆回复突变，此过程持续两周左右改为正常完全培养基培养。

在融合前，⾻髓瘤细胞必须保持⾮常良好的状态才可以保证有较⾼的融合率，⼀般保证⽣长⾄60-80%左右密度时认为是对数⽣长强壮期。

另⼀种⽐较好的解决⽅案是（以SP2/0细胞为例）：将复苏培养数天的⾻髓瘤接种于⼩⿏⽪下，约两周后⼩⿏⽪下就会⽣长出可见的⾁瘤，将此⾁瘤⽆菌取出研磨成单个细胞，计数后也可⽤于融合。

脾脏单细胞悬液的制备完成⼩⿏的免疫流程后，间接法ELISA测定⾎清效价在1:8000以上或免疫扩散实验效价在1:16以上时即可进⾏冲击免疫（详见单抗制备动物免疫⼀节），冲击免疫完成后96⼩时内处死⼩⿏，（也有少数时候例外的时候，站长⾃⼰做过⼀次⾎清ELISA效价在1：2000时就进⾏冲击免疫也获得成功），处死⼩⿏可采⽤断颈处死，也可以采⽤摘眼球放⾎处死。

处死⼩⿏后，将⼩⿏浸泡于75%酒精中5分钟，然后⽤⼤头针将其四肢固定在⼲净⽊板或纸板上（腹部向上），放进超净台，⽤⽆菌镊⼦和剪⼑依次剪开⽪肤和腹膜，换⽤另⼀套镊⼦和剪⼑⽆菌取出脾脏，放⼊⼀⼩⽫中（⼩⽫中事先放好⼀⼩块200⽬细胞滤⽹），加⼊⼏滴不完全培养基，然后⽤⼀注射器针芯将脾脏磨成单个细胞，⽤巴⽒管将此细胞转⼊离⼼管后，加⼊适量培养基，离⼼（1200RPM左右，下同）洗去脾脏中带⼊的⿏源⾎清。

重复洗⼀次再⽤不完全培养基重悬即得到脾细胞悬液。

细胞融合的介导⾃然状态下，细胞之间很难发⽣融合。

1958年，⽇本冈⽥善雄利⽤仙台病毒成功介导动物细胞融合，但是其诱导效率低，⽽且诱导不稳定，可重复性差。

⾃20世纪70年代起，不断有⼈发现许多化学试剂也可以使细胞进⾏融合。

主要包括盐类（如NaNO3、KNO3、NaCl、MgCl2、CaCl2）、聚⼄⼆醇（PEG）、⼆甲亚砜（DMSO）、⽢油-醋酸脂、脂质、Ca2+络合物等。

后来，⼈们⼜发明了电融合和激光融合，更进⼀步提⾼了细胞融合的效率。

与化学试剂融合相⽐较，电融合和激光融合效率更⾼，但是成本也⾼，操作复杂。

因此，⽬前在单抗制备中都选择化学试剂进⾏细胞融合，⽬前最常⽤的则是聚⼄⼆醇（PEG）融合法，其原理是PEG剥夺细胞周围的⽔分⼦，使细胞⾼度脱⽔⽽原⽣质形成凝集，细胞膜发⽣扭曲，同时膜内蛋⽩颗粒易位并凝聚，⽽膜脂的流动性发⽣较⼤改变，相邻的细胞之间细胞膜局部发⽣融合，之后逐渐扩⼤，最终发⽣融合（对PEG融合原理也有⼈持不同意见，请参考相关⽂献）。

PEG分⼦量越⼤，对细胞的毒害也越⼤，分⼦量越⼩，融合速度和效率也较低下。

常⽤的PEG分⼦量在200-20000之间，更多地是1000-4000之间，使⽤前⽤⾼温灭菌，再⽤不完全培养基或PBS配制。

影响细胞融合效率的因素影响细胞融合效率的因素有很多，以PEG介导的融合为例，主要的因素有这么⼏个：（1）参与融合的细胞状态。

⽆论是脾细胞还是⾻髓瘤细胞，融合前都必须处于⼀个⾮常良好的状态。

对于脾细胞，要求动物健康，即取即
⽤，即使有⾮常特殊的情况，取出脾脏后需要在体外先进⾏培养⼀段时间的，也不能超过两⾄三天。

⾻髓瘤细胞在使⽤前⾄少两周应停⽌使⽤筛选培养基（如含8-氮杂鸟嘌呤或5-溴尿嘧啶的培养基），使⽤前保证⾻髓瘤的⽣长密度为80%左右为宜。

（2）PEG的分⼦量和浓度。

前⾯说过，PEG的分⼦量越⼤，对细胞的毒害作⽤就越⼤，但是分⼦量越⼩，融合效果也就越⼩。

PEG的浓度也有类似的关系，因此通常使⽤的PEG浓度⼀般在30%-60%之间。

需要注意的是，当脾脏细胞与⾻髓瘤细胞混合离⼼后，⼀定要彻底除掉洗涤液，否则会⼤⼤改变PEG的有效浓度。

（3)PEG的pH以及作⽤时间。

经验告诉我们，PEG 的pH配在8.0-8.2时效果最佳。

PEG的作⽤时间与其分⼦量成反⽐，也与其浓度成反⽐。

⼀般PEG的直接作⽤时间在⼀⾄五分钟。

（4）融合时的温度。

细胞融合本质上要涉及细胞膜的流动，⽽细胞膜的流动速度与环境温度成正⽐。

⼀般融合时的温度都在37-40℃。

（5）离⼦环境。

有⽂献报道，在融合的PEG⾥添加Ca2+有利于提⾼细胞融合的效率。

⽂献报道的Ca2+最佳浓度都在50mmol/ml左右。

（5）操作上的因素。

将脾细胞与⾻髓瘤细胞混合前应将⼆者充分吹打均匀，离⼼时速度不可太⼤也不可太⼩。

如果离⼼速度太⼤，⾻髓瘤细胞会优先沉淀到离⼼管底部，如果离⼼速度太⼩，则脾细胞可能不能完全被沉淀下去。

细胞融合操作步骤以SP2/0为瘤细胞为例，⼀个典型的融合过程如下:
(1) 按前⾯讲述的⽅法免疫⼩⿏，确认免疫成功后，杀死⼩⿏，按上述⽅法制备脾脏单细胞悬液，离⼼之前取少量悬液进⾏细胞计数，计算出整个脾脏所包含的细胞个数。

（2）融合前⼀天将SP2/0细胞传代⼀次，调整好密度，按经验保证在融合时其密度应在80%左右。

融合时，将SP2/0从培养瓶上吹下，离⼼（800RPM左右，下同）弃去培养基，再⽤不完全培养基或PBS洗涤⼀次，弃上清再⽤不完全培养基或PBS 重悬，取少量悬液计数。

如果采⽤⼩⿏制备⾻髓瘤，可按脾脏单细胞悬液制备⽅法制备成单细胞悬液。

取少量悬液计数。

（3）按SP2/0:脾细胞以1:2-1:10的⽐例取合适量的SP2/0悬液，将脾细胞悬液和SP2/0细胞悬液混合离⼼（1200RPM），将上清倒⼲净。

（4）吸取1ml事先预热⾄37℃的PEG，在1min内滴⼊脾脏细胞和⾻髓瘤细胞的混合体系中。

滴加PEG时动作要轻，并且所有操作尽量在37-40℃环境下进⾏。

（5）静置1min后，在5min内加⼊20-30ml不完全培养基，以终⽌PEG的作⽤。

（6）离⼼（1200RPM）去掉上清，再⽤完全培养基（含HTA和胎⽜⾎清）重悬起融合完成的细胞，将其平均地滴在96孔培养板上（培养板上需在融合前⼀天滴⼊饲养层细胞）。

平均每个脾脏融合后滴在5-10块培养板上为宜。

如果使⽤半固体培养基培养，可将融合好的细胞混在43℃左右的培养基上，然后倒在平板⾥培养（这种⽅法的操作详见“交杂瘤细胞的克隆化”⼀⽂。

）
(7)四天后，可以看出培养基颜⾊变黄，此时应该换液⼀次，换液后三天时再换⼀次，显微镜下可以看到克隆形成。

继续培养两⾄三天，便可以检测细胞上清中是否有⽬的抗体出现。