分子病理在结直肠癌中应用及进展
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32
检测方法
➢ MMR免疫组化 MLH1/MSH2/MSH6/PMS2
➢ MSI检测
MMR蛋白的关系
MLH1与PMS2， MSH2与MSH6复合物
MLH1 PMS2
MSH2 MSH6
PMS2和MSH6蛋白的稳定性取决于复合物的稳定
MLH1缺失，PMS2通常缺失 MSH2缺失，MSH6通常缺失
反之不同，MSH2和MLH1可以和其他蛋白集合
文献报道 >50%
10%-15% 45% 2-3% 2%
1-2.2% 2-33%
4% 1% 3% 41% 100%
不同肿瘤中的价值不同：诊断、治疗、预后提示作用
BRAF突变发生率
复旦大学附属肿瘤医院资料（2014）
Sanger测序法：
BRAF突变率：3.9% BRAF V600E突变率：3.3%
24
总例数
557
突变例数
225
85 14 45 19 14 1
44 1 1
1
突变率
40.4%(225/557)
15.3%（85/557） 2.5%(14/557) 8.1%(45/557) 3.4%(19/557) 2.5%(14/557) 0.2%(1/557)
7.9%(44/557) 0.2%(1/557) 0.2%(1/557)
ERK
1. De Roock, et al. Lancet Oncol 2010 2. 3. Fernández-Medarde, Santos. Genes Cancer 2011; 4. De Roock, et al. Lancet Oncol 2011
EXON 1
RAS
KRAS
NRAS
RAS-RAF突变热点
16
主要内容
➢ RAS基因突变
➢ BRAF基因突变
➢ MMR\MSI ➢ 遗传性肿瘤筛选 ➢ 其他进展
BRAF基因
7q34， 18个外显子组成，783个氨基酸 由三个保守区组成CR1、CR2、CR3 （激酶区） 编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 是RAS-RAF-MEK-ERK上游调节因子
BRAF激酶——重要的细胞生长介导物
分子病理在结直肠癌中应用及进展
一组异质性肿瘤
家族相关性
➢散发性 ➢遗传性-HNPCC、FAP等
分子机制
Sporadic Familial
➢ 染色体不稳定性 (CIN)：散发、遗传 ➢ 微卫星不稳定性 (MSI) ：散发、遗传
基因组不稳定性 （genomic instability)
➢ CpG岛的甲基子表型 (CIMP)：散发
➢ RAS基因突变 ➢ BRAF基因突变 ➢ MMR\MSI ➢ 遗传性肿瘤筛选 ➢ 其他进展
主要内容
➢ RAS基因突变
➢ BRAF基因突变 ➢ MMR\MSI ➢ 遗传性肿瘤筛选 ➢ 其他进展
RAS在EGFR信号通路中的地位
Target for EGFR-ERBITUX/Panitumumab
BRAF突变的生物学意义
600 活化性突变，V600E转化效率比野生型BRAF增 加了70－138倍。
RAS-RAF-MEK-MAP通路活化，向细胞核传递有丝分裂信号， 持续激活可促进细胞无限制分裂。
参与细胞增殖，分化和凋亡。
发生BRAF突变的肿瘤
黑色素瘤 结直肠癌 甲状腺癌 肺癌 乳腺癌 胃癌 卵巢癌 子宫内膜癌 淋巴瘤 胶质瘤 肝癌 毛细胞白血病
MSI 分析
检测方法 NCI: Bethesda consensus panel: 2个单、3个双； Promega: 单核苷酸重复panel: 5个单；或更多
分别对同一病例的正常和肿瘤组织进行显微切割、核酸提取扩增后作 毛细管电泳分析；
判断方法： 2个及以上不稳定——MSI-H 1个不稳定——MSI-L，或不确定 没有不稳定——MSS
D2S123
主要内容
➢ RAS基因突变 ➢ BRAF基因突变 ➢ MMR\MSI
➢ 遗传性肿瘤筛选
➢ 其他进展
遗传性肿瘤筛选的临床价值
约5%-6%CRC有遗传倾向：相关基因的胚系突变 ➢及时明确遗传性综合征的风险 ➢高危人群有机会定期检查、干预、治疗、管理
主要遗传综合征
➢Lynch syndrome ➢FAP,attenuated FAP ➢MUTYH-相关性息肉病 ➢家族性CRC X型
If Loss of MLH1 by IHC: MLH1 Methylation Test BRAF Mutation Test
（可在外周血检测之前）
Normal MLH1 Methylation Test
AG CTG
MMR蛋白一个或多个缺失 MSI-L/% 结直肠癌 3%-5% 遗传性：MMR突变（MLH1/MSH2/MSH6/PMS2)
10%-12%散发性： MLH1甲基化、BRAF突变、 与CIMP表型重叠
MSI及MMR检测的临床价值
BRAF基因突变位点
➢ 80%以上：激酶功能域V600E
Bollag G. Nat Rev Cancer 2007 Apr;7(4):295
BRAF基因突变功能区
CR1：密码子235-280，CR2：密码子314-343，CR3：密码子457-714
突变发生在CR3区 其中大部分在：外显子15， V600E
➢每一个CRC诊断时都应评估其遗传可能性 ➢评估内容：病史、遗传学检测
HNPCC筛选策略
肿瘤组织 PCR for MSI \IHC for MMR proteins
MSI test: MSI-H IHC: 一个或二个缺失
MSI test: MSI-L or MSS IHC: 阳性
外周血： Germline Testing for MMR
分子分型
表观遗传不稳定性 （epigenetic instability)
各种组合方式：5组、4组、7组等 主要涉及：KRAS、NRAS、BRAF、MSI和CIMP状态 尚无国际通用的标准的分子分型
分子病理在CRC中的主要应用
根据基因异常 与发生、进展
的关系
应用分子生物学 相关技术
遗传筛选
早期诊断
最常见的突变
EXON 2
12 13
Additional MT found in KRAS WT
3% (22/641)
EXON 3
61 4% (24/641)
4% (26/641)
EXON 4
117 146 6% (36/641)
0% (0/641)
RAF*
BRAF
EXON 15
600 8% (53/641)
Douillard JY et al. N Engl J Med 2013;369:1023-1034
RAS(KRAS+NRAS) 野生型预后更好
KRAS or NRAS
Douillard JY et al. N Engl J Med 2013;369:1023-1034
RAS突变位点及其分布
红色框内为KRAS突变的外显子和密码子
0.2%(1/557)
RAS的突变率及分布
复旦大学附属肿瘤医院资料（2014）
RAS
211/464
45.50%
KRAS-E2 KRAS-E3 KRAS-E4 NRAS-E2 NRAS-E3 NRAS-E4
173/464 16/464 10/464 7/464 8/464 1/464
37.20% 3.40% 2.20% 1.50% 1.70% 0.20%
MSI分析方法
PCR-毛细管电泳
图
分 抽
正常和肿瘤组织 DNA提取 PCR反应 毛细管电泳 结果分析
68F 直肠腺癌， T4N0M0
MSS
D5S346
Bat26 Bat25
D17S250
D2S123
73M， 左半结肠腺癌，T3N0M0， MSI-H
D5S346
Bat26 Bat25
D17S250
26
BRAF突变的检测
➢DNA测序 ➢荧光PCR ➢V600E 突变抗体IHC
据报道有较好的符合率， 简单、快速、经济
EGFR通路其他基因异常 • PIK3CA： E9/E20 突变 预后差 • PTEN： 缺失表达 预后差 其预后价值尚需证实，未被治疗指南推荐
28
主要内容
➢ RAS基因突变 ➢ BRAF基因突变
MMR蛋白免疫组化
表达模式
——MLH1+PMS2共缺失 ——MSH2+MSH6共缺失 ——PMS2缺失 ——MSH6缺失
注意对照 为定性检测
35
hMLH1阳性
hMLH1阴性
hMSH6阳性
hMSH6阴性
微卫星不稳定 (MSI)
Normal
Microsatellite instability
Addition or loss of nucleotide repeats
➢ MMR\MSI
➢ 遗传性肿瘤筛选 ➢ 其他进展
MMR 基因功能缺陷
Base pair mismatch
MLH1 PMS2
MSH2 MSH6
Normal DNA repair
TTC
AG CTG
x Defective DNA PMS2 repair (MMR+) SH6
TC GAC AG CTG
TTC
可能不是 HNPCC/Lynch Syndrome
Germine Mutation in MMR gene(s) Identified: HNPCC/Lynch Syndrome
No Germline Mutation in MMR gene(s) Identified
MMR胚系突变检测 ➢DNA测序 ➢大片段缺失
BRAF突变与结直肠癌的关系
5%-9% ➢与临床病理高危因素相关：近端、T4、低分化 ➢晚期CRC突变：提示预后差 ➢BRAF突变提示作用——体细胞MLH1甲基化，而非胚系基因突变
是排除HNPCC的指标之一 ➢可能BRAF靶向治疗靶点？ ➢目前尚无充分证据证明其对EGFR靶向治疗的指导作用
更新：如RAS无突变，考虑BRAF突变检测 无论RAS状态如何，均应作BRAF突变检测
NCCN指南更新
所有转移性结直肠癌都应该做肿瘤组织的RAS突变检测（KRAS+NRAS)， 至少KRAS-E2，如有可能，检测KRAS-E2+KRAS-non-E2+NRAS
12
有待更新
13
KRAS基因突变率及其类型分布
复旦大学附属肿瘤医院资料(2012)
组别
KRAS基因 突变类型 Codon12 GGT>GAT (G12D) GGT>GAT (G12S) GGT>GTT (G12V) GGT>TGT (G12C) GGT>GCT (G12A) GGT>TTT (G12R) Codon13 GGC>GAC(G13D) GGC>TGC(G13R) GGC>CGC(G13C) Codon34 CCA>CTA (P34L)
5例有双突变，其中4例伴有KRAS-E2突变； KRAS E3+E4+RAS=9.1%；Non-KRASE2+RAS=8.2%
RAS突变检测中的注意点
➢检测方法的选择 ➢检测过程中的质控 ➢RAS基因突变类型 ➢突变的临床价值
——不规范的检测方法将导致部分RAS突变型患者接受错
误的抗EGFR抑制剂治疗，影响患者的生存获益
KRAS 基因
外显子 1
密
NRAS 基因
外显子1
红框外的突变率是在KRAS E2 WT中的百分率：18%
10
KRAS exon 2突变率 n=440/1,096 (40.1%)
KRAS exon 2野生率 n=656/1,096 (59.9%)
RAS突变率 n=548/1,060 (51.7%)
RAS野生率 n=512/1,060 (48.3%)
HNPCC筛选：
——所有小于70岁病人或是大于70岁、满足Bethesda指南的病人MMR检测。 ——若IHC-MLH1蛋白缺失，还需检测BRAF突变
II期病人的价值：
——分化差的病理类型如果伴有MSI-H则不认为是高危因素 ——II期病人伴有MSI-H时预后好 ——不会从5-FU辅助治疗中获益，。
治疗预测 （靶向、化疗）
化疗毒副作用
预后预测
➢MMR蛋白 ➢MSI ➢MMR胚系突变 ➢BRAF突变 ➢MLH1甲基化
多基因甲基化 多基因突变 血红蛋白
➢RAS （KRAS+NRAS） ➢MMR蛋白 ➢MSI
➢UGT1 ➢DPD
➢BRAF ➢MMR蛋白 ➢MSI ➢PIK3CA ➢基因表达
主要内容
The Cancer Journal. 2011;17:114-26.
RAS基因家族
RAS基因家族
EGFR (HER1)
EGF TGFHB-EGF Epireguli
n
K-RAS: E2,3,4
RAS
RAS突变导致持续信号激活，
RAF
与是否EGFR抑制无关
N-RAS: E2,3,4 MEK
H-RAS ：
检测方法
➢ MMR免疫组化 MLH1/MSH2/MSH6/PMS2
➢ MSI检测
MMR蛋白的关系
MLH1与PMS2， MSH2与MSH6复合物
MLH1 PMS2
MSH2 MSH6
PMS2和MSH6蛋白的稳定性取决于复合物的稳定
MLH1缺失，PMS2通常缺失 MSH2缺失，MSH6通常缺失
反之不同，MSH2和MLH1可以和其他蛋白集合
文献报道 >50%
10%-15% 45% 2-3% 2%
1-2.2% 2-33%
4% 1% 3% 41% 100%
不同肿瘤中的价值不同：诊断、治疗、预后提示作用
BRAF突变发生率
复旦大学附属肿瘤医院资料（2014）
Sanger测序法：
BRAF突变率：3.9% BRAF V600E突变率：3.3%
24
总例数
557
突变例数
225
85 14 45 19 14 1
44 1 1
1
突变率
40.4%(225/557)
15.3%（85/557） 2.5%(14/557) 8.1%(45/557) 3.4%(19/557) 2.5%(14/557) 0.2%(1/557)
7.9%(44/557) 0.2%(1/557) 0.2%(1/557)
ERK
1. De Roock, et al. Lancet Oncol 2010 2. 3. Fernández-Medarde, Santos. Genes Cancer 2011; 4. De Roock, et al. Lancet Oncol 2011
EXON 1
RAS
KRAS
NRAS
RAS-RAF突变热点
16
主要内容
➢ RAS基因突变
➢ BRAF基因突变
➢ MMR\MSI ➢ 遗传性肿瘤筛选 ➢ 其他进展
BRAF基因
7q34， 18个外显子组成，783个氨基酸 由三个保守区组成CR1、CR2、CR3 （激酶区） 编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 是RAS-RAF-MEK-ERK上游调节因子
BRAF激酶——重要的细胞生长介导物
分子病理在结直肠癌中应用及进展
一组异质性肿瘤
家族相关性
➢散发性 ➢遗传性-HNPCC、FAP等
分子机制
Sporadic Familial
➢ 染色体不稳定性 (CIN)：散发、遗传 ➢ 微卫星不稳定性 (MSI) ：散发、遗传
基因组不稳定性 （genomic instability)
➢ CpG岛的甲基子表型 (CIMP)：散发
➢ RAS基因突变 ➢ BRAF基因突变 ➢ MMR\MSI ➢ 遗传性肿瘤筛选 ➢ 其他进展
主要内容
➢ RAS基因突变
➢ BRAF基因突变 ➢ MMR\MSI ➢ 遗传性肿瘤筛选 ➢ 其他进展
RAS在EGFR信号通路中的地位
Target for EGFR-ERBITUX/Panitumumab
BRAF突变的生物学意义
600 活化性突变，V600E转化效率比野生型BRAF增 加了70－138倍。
RAS-RAF-MEK-MAP通路活化，向细胞核传递有丝分裂信号， 持续激活可促进细胞无限制分裂。
参与细胞增殖，分化和凋亡。
发生BRAF突变的肿瘤
黑色素瘤 结直肠癌 甲状腺癌 肺癌 乳腺癌 胃癌 卵巢癌 子宫内膜癌 淋巴瘤 胶质瘤 肝癌 毛细胞白血病
MSI 分析
检测方法 NCI: Bethesda consensus panel: 2个单、3个双； Promega: 单核苷酸重复panel: 5个单；或更多
分别对同一病例的正常和肿瘤组织进行显微切割、核酸提取扩增后作 毛细管电泳分析；
判断方法： 2个及以上不稳定——MSI-H 1个不稳定——MSI-L，或不确定 没有不稳定——MSS
D2S123
主要内容
➢ RAS基因突变 ➢ BRAF基因突变 ➢ MMR\MSI
➢ 遗传性肿瘤筛选
➢ 其他进展
遗传性肿瘤筛选的临床价值
约5%-6%CRC有遗传倾向：相关基因的胚系突变 ➢及时明确遗传性综合征的风险 ➢高危人群有机会定期检查、干预、治疗、管理
主要遗传综合征
➢Lynch syndrome ➢FAP,attenuated FAP ➢MUTYH-相关性息肉病 ➢家族性CRC X型
If Loss of MLH1 by IHC: MLH1 Methylation Test BRAF Mutation Test
（可在外周血检测之前）
Normal MLH1 Methylation Test
AG CTG
MMR蛋白一个或多个缺失 MSI-L/% 结直肠癌 3%-5% 遗传性：MMR突变（MLH1/MSH2/MSH6/PMS2)
10%-12%散发性： MLH1甲基化、BRAF突变、 与CIMP表型重叠
MSI及MMR检测的临床价值
BRAF基因突变位点
➢ 80%以上：激酶功能域V600E
Bollag G. Nat Rev Cancer 2007 Apr;7(4):295
BRAF基因突变功能区
CR1：密码子235-280，CR2：密码子314-343，CR3：密码子457-714
突变发生在CR3区 其中大部分在：外显子15， V600E
➢每一个CRC诊断时都应评估其遗传可能性 ➢评估内容：病史、遗传学检测
HNPCC筛选策略
肿瘤组织 PCR for MSI \IHC for MMR proteins
MSI test: MSI-H IHC: 一个或二个缺失
MSI test: MSI-L or MSS IHC: 阳性
外周血： Germline Testing for MMR
分子分型
表观遗传不稳定性 （epigenetic instability)
各种组合方式：5组、4组、7组等 主要涉及：KRAS、NRAS、BRAF、MSI和CIMP状态 尚无国际通用的标准的分子分型
分子病理在CRC中的主要应用
根据基因异常 与发生、进展
的关系
应用分子生物学 相关技术
遗传筛选
早期诊断
最常见的突变
EXON 2
12 13
Additional MT found in KRAS WT
3% (22/641)
EXON 3
61 4% (24/641)
4% (26/641)
EXON 4
117 146 6% (36/641)
0% (0/641)
RAF*
BRAF
EXON 15
600 8% (53/641)
Douillard JY et al. N Engl J Med 2013;369:1023-1034
RAS(KRAS+NRAS) 野生型预后更好
KRAS or NRAS
Douillard JY et al. N Engl J Med 2013;369:1023-1034
RAS突变位点及其分布
红色框内为KRAS突变的外显子和密码子
0.2%(1/557)
RAS的突变率及分布
复旦大学附属肿瘤医院资料（2014）
RAS
211/464
45.50%
KRAS-E2 KRAS-E3 KRAS-E4 NRAS-E2 NRAS-E3 NRAS-E4
173/464 16/464 10/464 7/464 8/464 1/464
37.20% 3.40% 2.20% 1.50% 1.70% 0.20%
MSI分析方法
PCR-毛细管电泳
图
分 抽
正常和肿瘤组织 DNA提取 PCR反应 毛细管电泳 结果分析
68F 直肠腺癌， T4N0M0
MSS
D5S346
Bat26 Bat25
D17S250
D2S123
73M， 左半结肠腺癌，T3N0M0， MSI-H
D5S346
Bat26 Bat25
D17S250
26
BRAF突变的检测
➢DNA测序 ➢荧光PCR ➢V600E 突变抗体IHC
据报道有较好的符合率， 简单、快速、经济
EGFR通路其他基因异常 • PIK3CA： E9/E20 突变 预后差 • PTEN： 缺失表达 预后差 其预后价值尚需证实，未被治疗指南推荐
28
主要内容
➢ RAS基因突变 ➢ BRAF基因突变
MMR蛋白免疫组化
表达模式
——MLH1+PMS2共缺失 ——MSH2+MSH6共缺失 ——PMS2缺失 ——MSH6缺失
注意对照 为定性检测
35
hMLH1阳性
hMLH1阴性
hMSH6阳性
hMSH6阴性
微卫星不稳定 (MSI)
Normal
Microsatellite instability
Addition or loss of nucleotide repeats
➢ MMR\MSI
➢ 遗传性肿瘤筛选 ➢ 其他进展
MMR 基因功能缺陷
Base pair mismatch
MLH1 PMS2
MSH2 MSH6
Normal DNA repair
TTC
AG CTG
x Defective DNA PMS2 repair (MMR+) SH6
TC GAC AG CTG
TTC
可能不是 HNPCC/Lynch Syndrome
Germine Mutation in MMR gene(s) Identified: HNPCC/Lynch Syndrome
No Germline Mutation in MMR gene(s) Identified
MMR胚系突变检测 ➢DNA测序 ➢大片段缺失
BRAF突变与结直肠癌的关系
5%-9% ➢与临床病理高危因素相关：近端、T4、低分化 ➢晚期CRC突变：提示预后差 ➢BRAF突变提示作用——体细胞MLH1甲基化，而非胚系基因突变
是排除HNPCC的指标之一 ➢可能BRAF靶向治疗靶点？ ➢目前尚无充分证据证明其对EGFR靶向治疗的指导作用
更新：如RAS无突变，考虑BRAF突变检测 无论RAS状态如何，均应作BRAF突变检测
NCCN指南更新
所有转移性结直肠癌都应该做肿瘤组织的RAS突变检测（KRAS+NRAS)， 至少KRAS-E2，如有可能，检测KRAS-E2+KRAS-non-E2+NRAS
12
有待更新
13
KRAS基因突变率及其类型分布
复旦大学附属肿瘤医院资料(2012)
组别
KRAS基因 突变类型 Codon12 GGT>GAT (G12D) GGT>GAT (G12S) GGT>GTT (G12V) GGT>TGT (G12C) GGT>GCT (G12A) GGT>TTT (G12R) Codon13 GGC>GAC(G13D) GGC>TGC(G13R) GGC>CGC(G13C) Codon34 CCA>CTA (P34L)
5例有双突变，其中4例伴有KRAS-E2突变； KRAS E3+E4+RAS=9.1%；Non-KRASE2+RAS=8.2%
RAS突变检测中的注意点
➢检测方法的选择 ➢检测过程中的质控 ➢RAS基因突变类型 ➢突变的临床价值
——不规范的检测方法将导致部分RAS突变型患者接受错
误的抗EGFR抑制剂治疗，影响患者的生存获益
KRAS 基因
外显子 1
密
NRAS 基因
外显子1
红框外的突变率是在KRAS E2 WT中的百分率：18%
10
KRAS exon 2突变率 n=440/1,096 (40.1%)
KRAS exon 2野生率 n=656/1,096 (59.9%)
RAS突变率 n=548/1,060 (51.7%)
RAS野生率 n=512/1,060 (48.3%)
HNPCC筛选：
——所有小于70岁病人或是大于70岁、满足Bethesda指南的病人MMR检测。 ——若IHC-MLH1蛋白缺失，还需检测BRAF突变
II期病人的价值：
——分化差的病理类型如果伴有MSI-H则不认为是高危因素 ——II期病人伴有MSI-H时预后好 ——不会从5-FU辅助治疗中获益，。
治疗预测 （靶向、化疗）
化疗毒副作用
预后预测
➢MMR蛋白 ➢MSI ➢MMR胚系突变 ➢BRAF突变 ➢MLH1甲基化
多基因甲基化 多基因突变 血红蛋白
➢RAS （KRAS+NRAS） ➢MMR蛋白 ➢MSI
➢UGT1 ➢DPD
➢BRAF ➢MMR蛋白 ➢MSI ➢PIK3CA ➢基因表达
主要内容
The Cancer Journal. 2011;17:114-26.
RAS基因家族
RAS基因家族
EGFR (HER1)
EGF TGFHB-EGF Epireguli
n
K-RAS: E2,3,4
RAS
RAS突变导致持续信号激活，
RAF
与是否EGFR抑制无关
N-RAS: E2,3,4 MEK
H-RAS ：