基因工程酶课件
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1）DNA分子的标记 2）DNA的序列分析 3）DNA的末端修饰 4）合成双链cDNA 5）定点突变 6）基因扩增（PCR技术）
33
三、RNA聚合酶（RNA polymerase） 催化RNA体外合成反应 分类：依赖DNA的RNA聚合酶 不依赖DNA的RNA聚合酶
34
四、DNA连接酶（DNA Ligase）
活性：
(1) 53聚合酶活性
(2) RNaseH活性(即外切RNA酶活性)
主要用途：反转录合成cDNA第一条链
31
7.末端转移酶
作用:无模板的情况下，在DNA或RNA3’羟基上加dNTP 主要用途：(1)载体或cDNA加同聚尾(<100nt)
(2)DNA的3’OH末端同位素标记
32
DNA聚合酶的用途：
23
24
聚合酶：
细菌DNA聚合酶
*E. Coli DNA聚合酶 I（全酶） *Klenow酶
噬菌体DNA聚合酶 T4噬菌体DNA聚合酶
*测序酶（修饰的T7 pol） *Taq DNA聚合酶
*反转录酶
末端脱氧核苷酸转移酶
RNA聚合酶
SP6噬菌体RNA聚合酶 T3噬菌体RNA聚合酶 T4噬菌体RNA聚合酶
39
六、碱性磷酸酶
去除核酸末端磷酸基团的酶. 包括: 细菌碱性磷酸酶(BAP)
牛小肠碱性磷酸酶(CIP) 虾碱性磷酸酶(SAP)
主要用途: 去除DNA、RNA的5磷酸根，防止片段自身连接; 标记（5' 端）前除 DNA 或 RNA 5' 磷酸
40
41
七、核酸酶（nuclease）
以核酸为底物的水解酶
eg: PmeI GTTTAAAC 20小时不能切 GGTTTAAACC 20小时，25%切开
GGGTTTAAACCC 20小时，50%切开
AGCTTTGTTTAAACGGCGGCCGG 20小时， 90%切开
18
星活性(Star Activity)
识别专一性下降
eg: EcoRI GAATTC
EcoRI*
３. Eppendorf管于37℃水浴保温2小时,使酶切反应完全。
21
４. 取１０μl反应液加Loading buffer混 匀，于１％琼脂糖凝胶上电泳。
5. 紫外凝胶成像系统上查看实验结果。
22
application
限制酶的应用： 1. restriction map 2. DNA physical map ：a series of ER 3. gene library construction
无
有
无
SAM: 硫一腺苷甲硫氨酸
10
5. II型限制酶的识别特点
A. 识别顺序一般为4-7 bp B. 识别切割位点具有旋转对称性(回文结构)
4bp HpaⅠ HaeⅢ
5bp Ava Ⅱ EcoRⅡ
6bp BamHⅠ SmaⅠ
C CGG GG CC G GWCC
CCWGG G GATTC CCC GGG
的理想用酶。
30
5. Taq酶等
活性：（1）53聚合酶活性 （2）35外切核酸酶活性
主要用途：耐热，最适温度75 C，专用于PCR 出错率1.1×10-4
此外，PCR经常用用到各种高保真酶如：
Pfu DNA 聚合酶 和Pyrabest聚合酶 等
6.逆转录酶：
源于AWV (鸟成髓细胞白血病病毒)， 或Mo-MLV(Moloney鼠白血病病毒)
29
3. T4 噬菌体DNA聚合酶
活性：（1）53聚合酶活性 （2）35外切核酸酶活性, 比 Klenow强200倍
主要用途: 3’突出端切平
4. T7噬菌体DNA聚合酶
活性： （1） 53聚合酶活性（很强） （2） 3‘--5’ 外切活性，为 Klenow的1000 倍
主要用途：修饰后用于测序 Sequenase（测序酶）：切除了 99% 以上的 3‘--5’ 外切活性。 Sequenase Version 2 ：切除了所有的 3‘--5’ 外切活性，是测序
亚基
三种不同的亚基 两个相同的亚基 两种
活性
限制酶、修饰酶 限制酶 限制酶、修饰酶
酶反应辅助因子
ATP.mg++ SAM mg++
ATP.mg++SAM
识别位点特性
/
4-6bp回文对称
/
识别位点
TGAN8TGCT GGATCC
AGACC
切割位点
可变，距离>1kb 识别位点中 距3端24-26bp
克隆工作中用途
12
7. 识别位点与切割方式之间的关系
A.识别不同，切割不同
eg: BamHI
EcoRI
-G GATC C-
- A GATCT-
-C CTAG G-
- T CTAG A-
B.识别不同，切割产生末端相同(同尾酶)
eg: BamHI
Bg1Ⅱ
- A GATCT
-G GATCC
- T CTAG A
依赖于DNA的DNA聚合酶: DNA聚合酶Ⅰ(全酶); klenow大片段;
耐热DNA聚合酶 (Taq 酶)
依赖于RNA的DNA聚合酶: 逆转录酶。 不依赖于DNA的DNA聚合酶: 末端转移酶。
27
1. E. Coli DNA聚合酶
早期基因工程常用
活性: （1）53DNA聚合酶活性 （2）35核酸外切酶活性 （3）53核酸外切酶活性
AATT
原因：甘油浓度过高，酶浓度太大，
离子强度不适，pH不适(Ph>8.0)
存在有害试剂(>1%乙 醇, DMSO, 乙二醇)
阳离子变化:Mn++, Co++, Zn++, Cu++代替mg++
19
酶的灭活
➢ 65℃加热15分钟 ➢ 加入EDTA至终浓度10mM终止反应
琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳
phage 侵入 E.coli 可繁殖 phage 侵入 另一种E.coli 不可繁殖
瑞士塞尔生物研究中心Arber提出限制一修饰理论： 核酸内切酶降解细菌外源DNA, 修饰酶保护自身DNA
5
➢ 1968年，Meselson从E．coli K株中分离出了第一个 限制酶EcoK；同年Linn和Arber从 E．coli B株中分离 到限制酶EcoB。
定义：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3’ 羟基和5’磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键， 使断开的DNA•裂口连接起来。
对底物的要求：dsDNA分子，具3’-OH末端和5’-P 末端
用途：具有修复单链或双链的能力,在DNA重组、复 制
和损伤后的修复中都起关键作用。
35
1. T4 DNA Ligase
11
6. 限制酶的切割末端
平端：缺口在识别序列对称轴上（Hind I I ） 5粘端：缺口在对称轴5’端一侧（EcoR I） 3粘端：缺口在对称轴3’端一侧（Pst I）
限制酶产生的末端的连接
A. 匹配粘端: 直接连接
B. 平末端:
万能连接
C. 不匹配粘端： S1 Nuclease切去突出端或Klenow补平
一条多肽链(Mr=68000)，还可作用于 RNA,但 效率低得多,需ATP作辅因子 反应条件：1）温度 粘端4℃，平端25℃
2）pH7.5-8.0 3）阳离子 Mg2+ 4）辅因子 ATP
36
2. E.coli DNA Ligase
Mr=74000, NAD+可促进该催化反应 分子克隆使用不多，亦不能连接RNA。 用途: cDNA第二链合成。
-CCTAG G
பைடு நூலகம்13
C.识别相同，切割不同
eg: SmaI
XmaI
-CCC GGG-
-C CCGGG -
-GGG CCC-
-G GGCC C-
D.识别相同，切割相同──同工酶 同裂酶
eg: HpaⅡ
Msp Ⅰ
-CCGG-
-C * C GG-
-GG CC-
-G G CC-
甲基化后不可切割
25
连接酶： E. Coli DNA连接
*T4 DNA连接酶 T4噬菌体 RNA连接酶
修饰酶：
激酶 T4噬菌体多核苷酸激酶
磷酸酶 *碱性磷酸酶 核酸酶 Ba131核酸酶 S1核酸酶 绿豆核酸酶
甲基化酶
RNaseA RNaseT1 DNaseI 噬菌体外切核酸酶
EXoⅢ
26
二、DNA聚合酶（DNA polymerase）
第一节 基因工程工具酶
工具酶
基因工程技术中能用于DNA和RNA 的合成、连接 、切割和修饰的各种酶。 包括： 限制酶, 聚合酶, 连接酶, 修饰酶(激酶, 磷酸酶， 核酸酶, 甲基化酶)，蛋白酶，溶菌酶 等。
4
一、限制性内切酶 （Restriction Endonuclease）
1. 细菌的限制一修饰现象被发现
B. 构型：切超螺旋需更多的酶 例: lg DNA, EcoRI 切, 1U 超螺旋 pUCl9, EcoRI 2.5U HindⅢ 5U Sal I 10U Nar I 20U
16
酶单位的定义：
1U：指在适当的温度和缓冲液条件下，1小时内完全酶解 １ug特定ＤＮＡ底物所需要的酶量。
缓冲液 NaCl Tris-HCl MgCl2 DTT BSA
基因工程的定义
应用DNA重组技术，按照人们的意愿 ，在基因水平上改变生物遗传性，创造新 生物物种，通过工程化为人类提供有用产 品和服务的技术。
1
内容
➢ 基因工程工具酶 ➢ 基因工程载体 ➢ DNA提取与基因制备 ➢ 重组DNA向宿主细胞内转移技术 ➢ 重组基因的表达调控
2
➢ 基因工程的技术流程
3
➢ 美Hopkings大学 H.Smith从流感嗜血菌中分离 Ⅱ型 限制酶 HindⅡ Arber, Smith获得1978 年Nobel奖
6
2. 限制性核酸内切酶的定义和生物学功能
定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸 序列的酶，称为限制性核酸内切酶，简称限制酶。
生物学功能： A. 防御外来生物在体内繁殖。 B. 限制-修饰系统决定了噬菌 体、病毒等具有种属特异性。 C. 阻止了生物远距离种属间 杂交优势。
7
3. 限制酶的命名
Hind III
属名 种名 株名 序数
含义：流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzae d)的第三种酶
第1个字母是产生该酶的细菌属名的第一个字母，大写；
第2-3个字母 是细菌种名的前两个字母，小写；
第4个字母是株名的第一个字母，小写；
用罗马数字表示发现的先后次序。
37
3. T4 RNA Ligase
由噬菌体编码 催化单链DNA或RNA连接。 主要用途:对RNA进行3＇末端标记。
38
五、激酶(Kinase)
对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。
T4多聚核苷酸激酶： 催化ATP的 -磷酸基到DNA或RNA的5’ OH 主要用途: 对缺乏 5‘-磷酸的 DNA 或合成接头进行磷酸化; 对5’OH末端进行同位素标记
0, 50, 100mmol/L离子强度 pH7.5-8.0 辅助因子 10mmol/L 抗氧化，保护还原性基团 1mmol/L 使蛋白酶稳定 100ug/mL
17
近末端的切割：
eg: AccI GGTCGACC
切不动
CGGTCGACCG 切不动 CCGGTCGACCGG 切不动
eg: EcoRI GGAATTCC CGGAATTCCG 2小时内90%完全酶切
➢ 琼脂糖凝胶
200bp—50kb 水平装置
➢ 聚丙烯酰胺凝胶 5-500bp
垂直装置
20
酶切操作技术
１. 按下表分别加入各试剂于Eppendorf管中（注意限制性
内切酶最后加入且在冰上操作）。
DNA
１μg
10×buffer 2.5μl
无菌水
内切酶
2μ
总体积： 25μl
２. 将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。
甲基化后仍可切割
14
8.限制酶反应的影响因素
1. 温度：一般37C 有例外,如：SmaI 25C， BclI 50C，TaqI 65C
2. 缓冲液：高、中、低盐之分 3. 时间：1-2小时 4. 反应体积和甘油浓度：酶<1/10体积 5. DNA纯度与构型：
15
A. 纯度：RNA，蛋白，氯仿，SDS，EDTA， EB，酚，乙醇，硫酸根，DNA
8
4. 限制酶系统分类
1985年后大量限制酶被发现， 到 2005 年 1 月，已经发现 3681种限制酶。
限制性内切酶的分类 Ⅰ型: 特异识别、随机切割 Ⅱ型： 特异识别、同点切割 Ⅲ型： 特异识别、异地切割
通常所指的限制酶即Ⅱ类酶
9
限制酶特性比较
I型
II型
III型
举例
EcoB
BamHI
EcoPL
最适pH7.4，需要scDNA为模板
主要用途：切口平移法标记DNA
活性（3）
活性（1）
28
2. Klenow大片段
枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解 E. Coli DNA聚合酶得到的该酶的大片段 活性：（1）53聚合酶活性
（2）35外切核酸酶活性 主要用途：
(1)补平3凹端 (2)补平3凹端，末端标记 (3)合成cDNA第二链 (4)体外诱变中从单链模板合成双链 DNA
33
三、RNA聚合酶（RNA polymerase） 催化RNA体外合成反应 分类：依赖DNA的RNA聚合酶 不依赖DNA的RNA聚合酶
34
四、DNA连接酶（DNA Ligase）
活性：
(1) 53聚合酶活性
(2) RNaseH活性(即外切RNA酶活性)
主要用途：反转录合成cDNA第一条链
31
7.末端转移酶
作用:无模板的情况下，在DNA或RNA3’羟基上加dNTP 主要用途：(1)载体或cDNA加同聚尾(<100nt)
(2)DNA的3’OH末端同位素标记
32
DNA聚合酶的用途：
23
24
聚合酶：
细菌DNA聚合酶
*E. Coli DNA聚合酶 I（全酶） *Klenow酶
噬菌体DNA聚合酶 T4噬菌体DNA聚合酶
*测序酶（修饰的T7 pol） *Taq DNA聚合酶
*反转录酶
末端脱氧核苷酸转移酶
RNA聚合酶
SP6噬菌体RNA聚合酶 T3噬菌体RNA聚合酶 T4噬菌体RNA聚合酶
39
六、碱性磷酸酶
去除核酸末端磷酸基团的酶. 包括: 细菌碱性磷酸酶(BAP)
牛小肠碱性磷酸酶(CIP) 虾碱性磷酸酶(SAP)
主要用途: 去除DNA、RNA的5磷酸根，防止片段自身连接; 标记（5' 端）前除 DNA 或 RNA 5' 磷酸
40
41
七、核酸酶（nuclease）
以核酸为底物的水解酶
eg: PmeI GTTTAAAC 20小时不能切 GGTTTAAACC 20小时，25%切开
GGGTTTAAACCC 20小时，50%切开
AGCTTTGTTTAAACGGCGGCCGG 20小时， 90%切开
18
星活性(Star Activity)
识别专一性下降
eg: EcoRI GAATTC
EcoRI*
３. Eppendorf管于37℃水浴保温2小时,使酶切反应完全。
21
４. 取１０μl反应液加Loading buffer混 匀，于１％琼脂糖凝胶上电泳。
5. 紫外凝胶成像系统上查看实验结果。
22
application
限制酶的应用： 1. restriction map 2. DNA physical map ：a series of ER 3. gene library construction
无
有
无
SAM: 硫一腺苷甲硫氨酸
10
5. II型限制酶的识别特点
A. 识别顺序一般为4-7 bp B. 识别切割位点具有旋转对称性(回文结构)
4bp HpaⅠ HaeⅢ
5bp Ava Ⅱ EcoRⅡ
6bp BamHⅠ SmaⅠ
C CGG GG CC G GWCC
CCWGG G GATTC CCC GGG
的理想用酶。
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5. Taq酶等
活性：（1）53聚合酶活性 （2）35外切核酸酶活性
主要用途：耐热，最适温度75 C，专用于PCR 出错率1.1×10-4
此外，PCR经常用用到各种高保真酶如：
Pfu DNA 聚合酶 和Pyrabest聚合酶 等
6.逆转录酶：
源于AWV (鸟成髓细胞白血病病毒)， 或Mo-MLV(Moloney鼠白血病病毒)
29
3. T4 噬菌体DNA聚合酶
活性：（1）53聚合酶活性 （2）35外切核酸酶活性, 比 Klenow强200倍
主要用途: 3’突出端切平
4. T7噬菌体DNA聚合酶
活性： （1） 53聚合酶活性（很强） （2） 3‘--5’ 外切活性，为 Klenow的1000 倍
主要用途：修饰后用于测序 Sequenase（测序酶）：切除了 99% 以上的 3‘--5’ 外切活性。 Sequenase Version 2 ：切除了所有的 3‘--5’ 外切活性，是测序
亚基
三种不同的亚基 两个相同的亚基 两种
活性
限制酶、修饰酶 限制酶 限制酶、修饰酶
酶反应辅助因子
ATP.mg++ SAM mg++
ATP.mg++SAM
识别位点特性
/
4-6bp回文对称
/
识别位点
TGAN8TGCT GGATCC
AGACC
切割位点
可变，距离>1kb 识别位点中 距3端24-26bp
克隆工作中用途
12
7. 识别位点与切割方式之间的关系
A.识别不同，切割不同
eg: BamHI
EcoRI
-G GATC C-
- A GATCT-
-C CTAG G-
- T CTAG A-
B.识别不同，切割产生末端相同(同尾酶)
eg: BamHI
Bg1Ⅱ
- A GATCT
-G GATCC
- T CTAG A
依赖于DNA的DNA聚合酶: DNA聚合酶Ⅰ(全酶); klenow大片段;
耐热DNA聚合酶 (Taq 酶)
依赖于RNA的DNA聚合酶: 逆转录酶。 不依赖于DNA的DNA聚合酶: 末端转移酶。
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1. E. Coli DNA聚合酶
早期基因工程常用
活性: （1）53DNA聚合酶活性 （2）35核酸外切酶活性 （3）53核酸外切酶活性
AATT
原因：甘油浓度过高，酶浓度太大，
离子强度不适，pH不适(Ph>8.0)
存在有害试剂(>1%乙 醇, DMSO, 乙二醇)
阳离子变化:Mn++, Co++, Zn++, Cu++代替mg++
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酶的灭活
➢ 65℃加热15分钟 ➢ 加入EDTA至终浓度10mM终止反应
琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳
phage 侵入 E.coli 可繁殖 phage 侵入 另一种E.coli 不可繁殖
瑞士塞尔生物研究中心Arber提出限制一修饰理论： 核酸内切酶降解细菌外源DNA, 修饰酶保护自身DNA
5
➢ 1968年，Meselson从E．coli K株中分离出了第一个 限制酶EcoK；同年Linn和Arber从 E．coli B株中分离 到限制酶EcoB。
定义：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3’ 羟基和5’磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键， 使断开的DNA•裂口连接起来。
对底物的要求：dsDNA分子，具3’-OH末端和5’-P 末端
用途：具有修复单链或双链的能力,在DNA重组、复 制
和损伤后的修复中都起关键作用。
35
1. T4 DNA Ligase
11
6. 限制酶的切割末端
平端：缺口在识别序列对称轴上（Hind I I ） 5粘端：缺口在对称轴5’端一侧（EcoR I） 3粘端：缺口在对称轴3’端一侧（Pst I）
限制酶产生的末端的连接
A. 匹配粘端: 直接连接
B. 平末端:
万能连接
C. 不匹配粘端： S1 Nuclease切去突出端或Klenow补平
一条多肽链(Mr=68000)，还可作用于 RNA,但 效率低得多,需ATP作辅因子 反应条件：1）温度 粘端4℃，平端25℃
2）pH7.5-8.0 3）阳离子 Mg2+ 4）辅因子 ATP
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2. E.coli DNA Ligase
Mr=74000, NAD+可促进该催化反应 分子克隆使用不多，亦不能连接RNA。 用途: cDNA第二链合成。
-CCTAG G
பைடு நூலகம்13
C.识别相同，切割不同
eg: SmaI
XmaI
-CCC GGG-
-C CCGGG -
-GGG CCC-
-G GGCC C-
D.识别相同，切割相同──同工酶 同裂酶
eg: HpaⅡ
Msp Ⅰ
-CCGG-
-C * C GG-
-GG CC-
-G G CC-
甲基化后不可切割
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连接酶： E. Coli DNA连接
*T4 DNA连接酶 T4噬菌体 RNA连接酶
修饰酶：
激酶 T4噬菌体多核苷酸激酶
磷酸酶 *碱性磷酸酶 核酸酶 Ba131核酸酶 S1核酸酶 绿豆核酸酶
甲基化酶
RNaseA RNaseT1 DNaseI 噬菌体外切核酸酶
EXoⅢ
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二、DNA聚合酶（DNA polymerase）
第一节 基因工程工具酶
工具酶
基因工程技术中能用于DNA和RNA 的合成、连接 、切割和修饰的各种酶。 包括： 限制酶, 聚合酶, 连接酶, 修饰酶(激酶, 磷酸酶， 核酸酶, 甲基化酶)，蛋白酶，溶菌酶 等。
4
一、限制性内切酶 （Restriction Endonuclease）
1. 细菌的限制一修饰现象被发现
B. 构型：切超螺旋需更多的酶 例: lg DNA, EcoRI 切, 1U 超螺旋 pUCl9, EcoRI 2.5U HindⅢ 5U Sal I 10U Nar I 20U
16
酶单位的定义：
1U：指在适当的温度和缓冲液条件下，1小时内完全酶解 １ug特定ＤＮＡ底物所需要的酶量。
缓冲液 NaCl Tris-HCl MgCl2 DTT BSA
基因工程的定义
应用DNA重组技术，按照人们的意愿 ，在基因水平上改变生物遗传性，创造新 生物物种，通过工程化为人类提供有用产 品和服务的技术。
1
内容
➢ 基因工程工具酶 ➢ 基因工程载体 ➢ DNA提取与基因制备 ➢ 重组DNA向宿主细胞内转移技术 ➢ 重组基因的表达调控
2
➢ 基因工程的技术流程
3
➢ 美Hopkings大学 H.Smith从流感嗜血菌中分离 Ⅱ型 限制酶 HindⅡ Arber, Smith获得1978 年Nobel奖
6
2. 限制性核酸内切酶的定义和生物学功能
定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸 序列的酶，称为限制性核酸内切酶，简称限制酶。
生物学功能： A. 防御外来生物在体内繁殖。 B. 限制-修饰系统决定了噬菌 体、病毒等具有种属特异性。 C. 阻止了生物远距离种属间 杂交优势。
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3. 限制酶的命名
Hind III
属名 种名 株名 序数
含义：流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzae d)的第三种酶
第1个字母是产生该酶的细菌属名的第一个字母，大写；
第2-3个字母 是细菌种名的前两个字母，小写；
第4个字母是株名的第一个字母，小写；
用罗马数字表示发现的先后次序。
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3. T4 RNA Ligase
由噬菌体编码 催化单链DNA或RNA连接。 主要用途:对RNA进行3＇末端标记。
38
五、激酶(Kinase)
对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。
T4多聚核苷酸激酶： 催化ATP的 -磷酸基到DNA或RNA的5’ OH 主要用途: 对缺乏 5‘-磷酸的 DNA 或合成接头进行磷酸化; 对5’OH末端进行同位素标记
0, 50, 100mmol/L离子强度 pH7.5-8.0 辅助因子 10mmol/L 抗氧化，保护还原性基团 1mmol/L 使蛋白酶稳定 100ug/mL
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近末端的切割：
eg: AccI GGTCGACC
切不动
CGGTCGACCG 切不动 CCGGTCGACCGG 切不动
eg: EcoRI GGAATTCC CGGAATTCCG 2小时内90%完全酶切
➢ 琼脂糖凝胶
200bp—50kb 水平装置
➢ 聚丙烯酰胺凝胶 5-500bp
垂直装置
20
酶切操作技术
１. 按下表分别加入各试剂于Eppendorf管中（注意限制性
内切酶最后加入且在冰上操作）。
DNA
１μg
10×buffer 2.5μl
无菌水
内切酶
2μ
总体积： 25μl
２. 将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。
甲基化后仍可切割
14
8.限制酶反应的影响因素
1. 温度：一般37C 有例外,如：SmaI 25C， BclI 50C，TaqI 65C
2. 缓冲液：高、中、低盐之分 3. 时间：1-2小时 4. 反应体积和甘油浓度：酶<1/10体积 5. DNA纯度与构型：
15
A. 纯度：RNA，蛋白，氯仿，SDS，EDTA， EB，酚，乙醇，硫酸根，DNA
8
4. 限制酶系统分类
1985年后大量限制酶被发现， 到 2005 年 1 月，已经发现 3681种限制酶。
限制性内切酶的分类 Ⅰ型: 特异识别、随机切割 Ⅱ型： 特异识别、同点切割 Ⅲ型： 特异识别、异地切割
通常所指的限制酶即Ⅱ类酶
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限制酶特性比较
I型
II型
III型
举例
EcoB
BamHI
EcoPL
最适pH7.4，需要scDNA为模板
主要用途：切口平移法标记DNA
活性（3）
活性（1）
28
2. Klenow大片段
枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解 E. Coli DNA聚合酶得到的该酶的大片段 活性：（1）53聚合酶活性
（2）35外切核酸酶活性 主要用途：
(1)补平3凹端 (2)补平3凹端，末端标记 (3)合成cDNA第二链 (4)体外诱变中从单链模板合成双链 DNA