211242839_十味口腔溃疡清合剂对口腔溃疡模型大鼠炎症因子及表皮生长因子的影响

基础研究中国民间疗法
C H I N A S N A T U R O P A T H Y ,M a y
.2023,V o l .31N o .9җ基金项目:四川省中医药管理局基金(2020J C 0080)
;南充市科技局2020年市校科技战略合作专项基金(20S X Q T 0096);川北医学院校级科研发展基金(k c s z -040
):谭小尧,E -m a i l :d e n t i s t 888@y e a h .n e t
第一作者:韩新生,E -m a i l :h a n x i n s h e n g
1986@163.c o m 十味口腔溃疡清合剂对口腔溃疡模型大鼠炎症因子
及表皮生长因子的影响җ
韩新生1,贾佳欣1,陈方园1,吴利玲1,2,张 慧1,2,张兴安1,明华伟1,谭小尧1
(1.四川省南充市中心医院,四川南充637000;2.川北医学院,四川南充637000
)ʌ摘要ɔ 目的:探讨十味口腔溃疡清合剂治疗口腔溃疡模型大鼠炎症因子及表皮生长因子的影响㊂方法:选取
60只S D 大鼠,平均分为正常对照组(不造模,不给药)㊁空白模型对照组(采用机械法制备大鼠口腔溃疡动物模型,不给药)㊁西瓜霜阳性对照组(造模,按0.5g /k g 剂量给予桂林西瓜霜灌胃),以及十味口腔溃疡清合剂低㊁中㊁高剂量组(造模,分别按5㊁10㊁15g /k g 剂量给予十味口腔溃疡清合剂灌胃),每日3次,连续7d ㊂观察大鼠的体质量㊁活动量㊁饮水量㊁体温状况,记录溃疡愈合情况;采用酶联免疫吸附测定法(E L I S A 法)检测模型大鼠口腔黏膜组织中肿瘤坏死因子-α(T N F -α)㊁白细胞介素-6(I L -6)㊁白细胞介素-10(I L -10)
㊁表皮生长因子(E G F )的表达㊂结果:十味口腔溃疡清合剂中剂量组(按10g /k g 剂量给药)能显著改善大鼠口腔溃疡组织损伤,与空白模型对照组比较,差异有统计学意义(P <0.05)㊂结论:十味口腔溃疡清合剂能抑制口腔溃疡炎性反应,调节表皮生长因子水平,具有治疗口腔溃疡的作用㊂
ʌ关键词ɔ 十味口腔溃疡清合剂;复发性口腔溃疡;肿瘤坏死因子-α;白细胞介素-6;白细胞介素-10;
表皮生长因子中图分类号:R 289
文献标识码:A
D O I :10.19621/j
.c n k i .11-3555/r .2023.0927 口腔溃疡,
又称为口疮,是指发生在口腔黏膜上的溃疡性病损,以红㊁肿㊁热㊁痛为特征,其发病率较高,且
呈升高趋势[1
]㊂目前,该病具体的发病机制仍不明确,
治疗上西医多采用对症支持疗法㊂中医认为,该病多由阴虚火旺㊁心脾积热㊁气血两虚㊁脾肾阳虚上攻口腔所致㊂十味口腔溃疡清合剂的制方参照陈士铎‘辨证
录“中的引火汤,并对原方进行加减,由生地黄㊁黄连㊁黄柏㊁泽泻㊁茯苓㊁党参㊁麦冬㊁白术㊁肉桂及川牛膝10味中药制成,
理论上可以治疗复发性口腔溃疡㊂为了验证本方的治疗效果,本研究采用动物口腔溃疡模型实验评价其对大鼠口腔溃疡的治疗作用,现报道如下㊂1 实验材料
1.1 仪器设备 J A 1003A 型电子天平(上海垒固仪器有限公司);J Y 10001型电子天平(上海垒固仪器有限公司);倒置生物显微镜(奥林巴斯I X p
l o r e 显微镜);B S -600M 全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司);M i c r o f u g
e20小型离心机(B e c k m a n
)㊂1.2 药品与试剂 十味口腔溃疡清合剂(药物组成:生地黄30g ,黄连片10g ,黄柏3g ,泽泻10g
,茯苓30g ,党参片30g ,麦冬30g ,白术20g ,肉桂10g ,川牛膝10g ),质量浓度为1.5g /m L (由南充市中心医院中药剂科制备);桂林西瓜霜(桂林三金药业股份有限公司,国药准字Z 10950005,3.5g /瓶);10%水合氯醛溶液(医院自制);1%羧甲基纤维素钠溶液(医院自制);大鼠白细胞介素(I L )-6㊁肿瘤坏死因子-α(T N F -α)㊁I L -10㊁表皮生长因子(E G F )酶联免疫试剂盒(购自武汉博士德生物有限公司)
㊂1.3 动物 S D 大鼠,体质量为200~220g ,雌雄各半,由川北医学院实验动物中心购买提供,合格证批
号:S Y X K (川)2020-100㊂
2 实验方法
2.1 实验环境 川北医学院动物实验中心,根据实验动物管理条例,实验环境为室内温度20~24ħ,
相对湿度为50%~60%,12h 明暗交替照明,
自由饮水[2]
㊂78
中国民间疗法2023年5月第31卷第9期
基础研究中国民间疗法
C H I N A S N A T U R O P A T H Y,M a y.2023,V o l.31N o.9
喂养的标准饲料由川北医学院实验动物中心提供㊂2.2口腔溃疡大鼠模型选取S D大鼠60只,置于室内适应环境7d㊂其中10只大鼠不做处理,为正常对照组;其余50只进行造模㊂造模前1日大鼠禁食24h,正常饮水;次日用10%水合氯醛溶液(按300m g/k g剂量给药)对大鼠腹腔进行注射麻醉,大鼠口腔溃疡模型制备方法参照文献[3]中的机械制备方法制备[3],用手术剪直接剪除大鼠口腔右侧黏膜类似圆形的上皮组织,直径5~8mm,深约1mm,形成开放性创伤㊂第2日创面由假膜覆盖,即成功制备口腔溃疡大鼠模型㊂
2.3动物实验将造模成功的50只大鼠随机平均分为5组,即空白模型对照组㊁西瓜霜阳性对照组㊁十味口腔溃疡清合剂高剂量组㊁十味口腔溃疡清合剂中剂量组㊁十味口腔溃疡清合剂低剂量组㊂十味口腔溃疡清合剂高㊁中㊁低剂量组分别按15㊁10㊁5g/k g剂量给予十味口腔溃疡清合剂灌胃,留约1m L药液用代金氏管缓慢注入大鼠口腔,使溃疡面和药液充分接触㊂西瓜霜阳性对照组按0.5g/k g剂量给予桂林西瓜霜(取桂林西瓜霜药粉5g和1%羧甲基纤维素钠溶液5m L制备成混悬液)灌胃,留约1m L药液用代金氏管缓慢注入大鼠口腔,使溃疡面和药液充分接触㊂空白模型对照组㊁正常对照组分别给予1%羧甲基纤维素钠溶液5m L灌胃㊂每日3次,连续7d㊂
2.4观察及检测指标 ①大鼠症状与体征观察㊂用药过程中观察并记录大鼠的体质量㊁饮水量㊁体温㊁排泄物及活动㊂②大鼠口腔溃疡表面愈合情况㊂评估口腔溃疡程度分级,统计给药后不同时间溃疡愈合数㊁溃疡愈合率㊁溃疡修复评分㊂口腔溃疡程度及溃疡愈合情况分级标准如下:0级:无溃疡,黏膜正常,溃疡损伤修复计分为100分;Ⅰ级:有溃疡,溃疡表面无明显假膜,无组织坏死,溃疡损伤修复计分为80分;Ⅱ级:有溃疡,溃疡表面有薄的一层黄白色假膜,少量组织坏死,溃疡损伤修复计分为60分;Ⅲ级:溃疡表面假膜较厚,且周围有炎性水肿并有较多组织坏死,溃疡损伤修复计分为40分;Ⅳ级:溃疡表面假膜厚,周围有明显炎性水肿并伴有大量组织坏死,溃疡损伤修复计分为20分[4]㊂最后1次给药2h后处死所有大鼠,取标本,用4%甲醛固定,石蜡包埋,切片,苏木精-伊红染色法(H E)染色观察,在镜下观察溃疡处黏膜结构和炎症情况㊂口腔溃疡病理组织学分级标准如下:观察溃疡形成程度㊁组织坏死程度㊁炎症细胞浸润情况㊁新生肉芽组织形成情况,按无㊁轻㊁中㊁重度依次计0㊁1㊁2㊁3分,得分范围为0~12分[5-6]㊂③模型大鼠T N F-α㊁I L-6㊁
E G F㊁转化生长因子-β1(T G F-β1)定量检测㊂
2.5统计学方法采用S P S S20.0统计软件处理数据㊂计量资料用均数ʃ标准差(xʃs)表示;计数资料用百分率(%)表示,采用χ2检验㊂P<0.05为差异有统计学意义㊂
3结果
3.1大鼠症状与体征情况比较造模后各组模型大鼠均出现烦躁不安㊁活动频繁㊁体质量逐渐减轻㊁饮水量逐渐增多及体温升高的现象,在体质量㊁饮水量㊁体温方面,与正常对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);西瓜霜阳性对照组及十味口腔溃疡清合剂低㊁中㊁高剂量组与空白模型对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)㊂随着给药时间的延长,各组模型大鼠的一般情况均得到改善㊂给药10d后,与空白模型对照组比较,西瓜霜阳性对照组及十味口腔溃疡清合剂中㊁高剂量组大鼠的体质量明显增加,组间差异均有统计学意义(P<0.05);各给药组大鼠的饮水量较10d前均有所减少,体温下降;十味口腔溃疡清合剂中㊁高剂量组分别各有两只大鼠拉稀便,组间差异无统计学意义(P>0.05)㊂
3.2大鼠口腔溃疡愈合情况比较西瓜霜阳性对照组与十味口腔溃疡清合剂中剂量组的溃疡愈合程度分级较优,与空白模型对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);十味口腔溃疡清合剂低㊁高剂量组大鼠口腔黏膜溃疡恢复情况较空白模型对照组均有一定改善,但差异均无统计学意义(P>0.05)㊂见表1㊂镜下组织观察:与正常对照组比较,空白模型对照组大鼠溃疡修复评分显著降低(P<0.01);与空白模型对照组比较,各给药组大鼠溃疡修复评分明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)㊂见表2㊂以上结果表明,十味口腔溃疡清合剂能减轻口腔溃疡程度,缩短溃疡痊愈时间,提高溃疡愈合率㊂
88中国民间疗法2023年5月第31卷第9期
基础研究中国民间疗法
C H I N A S N A T U R O P A T H Y,M a y.2023,V o l.31N o.9表1十味口腔溃疡清合剂对口腔溃疡模型大鼠溃疡愈合情况的影响
组别只数
(只)
口腔溃疡程度分级(只)
0ⅠⅡⅢⅣ
给药后不同时间溃疡愈合数(只)
68101214
溃疡愈合率
(%)
溃疡修复评分
(分,xʃs)
正常对照组1010----------100.00ʃ0.00空白模型对照组10223120000220.0043.00ʃ9.25әә西瓜霜阳性对照组10730000132170.0084.00ʃ11.32һһ十味口腔溃疡清合剂低剂量组10522100122050.0062.00ʃ10.18һ十味口腔溃疡清合剂中剂量组10811000341080.0084.00ʃ12.72һһ十味口腔溃疡清合剂高剂量组10622000222060.0061.00ʃ10.65һ注:1.-,表示未给予十味口腔溃疡清合剂灌胃㊂
2.与正常对照组比较,әәP<0.01;与空白模型对照组比较,һP<0.05,һһP<0.01㊂
表2十味口腔溃疡清合剂对口腔溃疡模型大鼠
溃疡愈合情况的病理组织学分级比较
组别只数
(只)
口腔溃疡病理组织学
程度分级(只)
0ⅠⅡⅢⅣ
溃疡愈合率
(%)溃疡修复评分
(分,xʃs)
正常对照组1010-----100.00ʃ0.00
空白模型
对照组102222220.0042.00ʃ9.53әә西瓜霜阳性
对照组107111070.0084.00ʃ10.32һһ十味口腔溃疡清
合剂低剂量组105221050.0062.00ʃ11.13һ十味口腔溃疡清
合剂中剂量组108110080.0085.00ʃ11.72һһ十味口腔溃疡清
合剂高剂量组106211060.0062.00ʃ10.52һ
注:1.-,表示未给予十味口腔溃疡清合剂灌胃㊂
2.与正常对照组比较,әәP<0.01;与空白模型对照组比较,һP< 0.05,һһP<0.01㊂
3.3炎症因子及表皮生长因子指标比较与正常对照组比较,模型大鼠口腔黏膜组织中T N F-α㊁I L-6含量明显升高,I L-10㊁E G F含量均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)㊂与空白模型对照组比较,十味口腔溃疡清合剂中剂量组大鼠口腔黏膜T N F-α㊁I L-6含量均明显降低,E G F㊁I L-10含量均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);十味口腔溃疡清合剂高㊁低剂量组大鼠口腔黏膜T N F-α㊁I L-6含量均有降低,I L-10㊁E G F含量稍升高,与空白模型对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)㊂见表3㊂以上结果表明,十味口腔溃疡清合剂中剂量组能显著抑制口腔溃疡组织炎性反应,调节表皮生长因子水平,改善模型大鼠口腔溃疡组织损伤㊂
表3十味口腔溃疡清合剂对口腔溃疡模型大鼠
口腔黏膜组织中炎症因子及表皮生长因子的影响(n g/L,xʃs)
组别只数(只)白细胞介素-6肿瘤坏死因子-α正常对照组107.21ʃ2.3459.56ʃ5.43空白模型对照组1013.62ʃ3.01ә84.27ʃ9.42ә西瓜霜阳性对照组106.89ʃ2.12һ65.54ʃ11.72һ十味口腔溃疡清合剂低剂量组109.52ʃ2.4577.41ʃ10.85十味口腔溃疡清合剂中剂量组106.76ʃ2.59һ61.32ʃ9.64һһ十味口腔溃疡清合剂高剂量组107.82ʃ2.7371.71ʃ11.51组别只数(只)表皮生长因子白细胞介素-10正常对照组102187.35ʃ215.6347.94ʃ6.72空白模型对照组101463.35ʃ232.75әә30.13ʃ4.26ә西瓜霜阳性对照组102002.71ʃ265.43һ45.61ʃ4.75һ十味口腔溃疡清合剂低剂量组101532.18ʃ218.5233.46ʃ5.36十味口腔溃疡清合剂中剂量组101996.54ʃ259.36һһ44.82ʃ5.78һһ十味口腔溃疡清合剂高剂量组101553.83ʃ247.1534.95ʃ6.01
注:与正常对照组比较,әP<0.05,әәP<0.01;与空白模型对照组比较,һP< 0.05,һһP<0.01㊂
4讨论
口腔溃疡是指发生在口腔黏膜或浅或深的圆形或椭圆形的疼痛溃疡性病损,具有反复发作和自限性的特点[7]㊂目前,该病发病机制尚不清楚,现代医学认为可能与家族遗传因素㊁局部创伤㊁精神因素㊁营养不良㊁食
98中国民间疗法2023年5月第31卷第9期
基础研究中国民间疗法
C H I N A S N A T U R O P A T H Y,M a y.2023,V o l.31N o.9
物或药物刺激㊁感染(包括细菌或病毒感染)㊁维生素缺乏及激素水平的改变有关[8-11]㊂中医将口腔溃疡称为
口疮,认为该病的发生原因有外因和内因,内因归于机体积热或阴虚,外因主要是外邪入侵;证型常见阴虚火旺㊁心脾积热㊁气血两虚㊁脾肾阳虚证[12-13]㊂十味口腔溃疡清合剂是在‘辨证录“中引火汤的基础上,由生地黄㊁黄柏㊁黄连㊁泽泻㊁茯苓㊁党参㊁麦冬㊁白术㊁牛膝㊁肉桂组成的新方剂㊂方中黄柏清热祛湿,为君药;黄连清热燥湿,生地黄㊁麦冬滋阴补肾润肺,为臣药;泽泻㊁茯苓健脾利尿,党参㊁白术益气健脾,为佐药;肉桂引火归原,牛膝引火下行,为使药㊂为了便于储存㊁携带和服用,故采用现代中药制备技术将10味中药制成十味口腔溃疡清合剂㊂西医认为,口腔溃疡的发生与炎症介质介导的炎性反应有直接关系㊂在炎性反应过程中,组织产生释放大量的致炎因子,如T N F-α㊁I L-1㊁I L-6等,同时机体也产生大量的抗炎因子,如I L-10㊂致炎因子与抗炎因子的失衡是引起组织和细胞损伤的主要原因㊂本研究结果发现,与正常对照组比较,口腔溃疡模型大鼠口腔黏膜组织中T N F-α㊁I L-6有不同程度的升高,而I L-10有所降低,说明口腔溃疡模型大鼠出现炎性反应,口腔黏膜细胞出现损伤㊂与空白模型对照组比较,十味口腔溃疡清合剂中剂量组T N F-α㊁I L-6含量均明显降低, E G F㊁I L-10含量均明显升高,而十味口腔溃疡清合剂高㊁低剂量组T N F-α㊁I L-6含量均有降低,I L-10含量稍升高,说明十味口腔溃疡清合剂具有抗炎作用,能抑制炎性反应,加速损伤黏膜的修复,且中剂量组(按10g/k g剂量给药)的治疗效果最佳㊂
生长因子是一类能调节细胞生长增殖的多肽类物质,参与组织损伤修复的全过程㊂本研究结果发现,与正常对照组比较,模型大鼠口腔黏膜组织中E G F的含量较低㊂与空白模型对照组比较,给予不同剂量的十味口腔溃疡清合剂治疗后,大鼠口腔溃疡组织中的E G F含量均明显增加,说明十味口腔溃疡清合剂可以上调E G F的表达,对口腔黏膜损伤修复具有较好的促进作用㊂
为了验证该方治疗口腔溃疡的疗效,本研究采用动物溃疡模型制备方法中的机械方法制备口腔溃疡大鼠模型,通过正常对照㊁空白模型对照㊁西瓜霜阳性对照评价十味口腔溃疡清合剂对模型大鼠口腔溃疡的治疗作用,观察指标包括大鼠的体质量㊁活动量㊁饮水量㊁体温等一般情况,观察记录模型大鼠的口腔溃疡愈合情况;采用E L I S A法检测模型大鼠T N F-α㊁I L-6㊁I L-
10及E G F的含量㊂本研究结果发现,十味口腔溃疡清合剂能减轻大鼠口腔溃疡程度,缩短溃疡痊愈时间,提高溃疡愈合率㊂针对十味口腔溃疡清合剂对口腔溃疡的具体治疗机制还需要后续的研究㊂
综上所述,十味口腔溃疡清合剂对模型大鼠口腔溃疡均有治疗作用,且十味溃疡清合剂中剂量组(按10g/k g剂量给药)疗效较佳㊂
参考文献
[1]罗茫,刘一平,李元聪,等.4435例口腔黏膜病临床及中医辨治分析[J].中国医药科学,2020,10(4):3-6. [2]国家科学技术委员会.实验动物管理条例[J/C D].实用器官移植电子杂志,2016,4(2):66-67.
[3]中华中医药学会中药实验药理专业委员会.口腔溃疡动物模型制备规范(草案)[J].中药药理与临床,2017,33(6): 162-163.
[4]唐志立,彭贤东,王娅俐,等.知黄溃疡合剂对口腔溃疡模型大鼠的药效学研究[J].中国药业,2019,28(7):6-8. [5]任理,覃仁安,罗健东,等.口炎清颗粒对阴虚型口腔溃疡模型大鼠的作用机制[J].中药新药与临床药理,2018, 29(4):387-392.
[6]中华口腔医学会口腔黏膜病专业委员会.复发性阿弗他溃疡疗效评价的试行标准[J].中华口腔医学杂志,2002, 37(3):234..
[7]T O H I D I N I K H R,R O D RÍG U E Z A,R E G U E I R A-MÉN D E Z C,e t a l.S l e e pq u a l i t y a n d r i s ko f r e c u r r e n t a p h t h o u s u l c e r s:a S p a n i s hc o h o r t s t u d y[J].O r a lD i s,2022,28(7):1882-1890.
[8]黄丽瑾.西帕依固龈液与口炎清颗粒治疗复发性口腔溃疡综合疗效观察[J].当代临床医刊,2021,34(2):92-93. [9]张宝文,李萌梅,苑迅.复发性口腔溃疡病因病机及临床治疗研究进展[J].大连大学学报,2016,37(6):71-75. [10]孙丽艳,李鹏,邹桂克.碘甘油联合曲安奈德口腔软膏治
疗口腔溃疡的临床研究[J].现代药物与临床,2020, 35(9):1835-1838.
[11]岳金涵,王非,辛川,等.自伤性口腔溃疡的病因和临床诊
疗特点[J].国际口腔医学杂志,2020,47(5):595-600. [12]世界中医药学会联合会消化病专业委员会.口疮中医临
床实践指南(2018)[J].中医杂志,2020,61(3):267-276.
[13]张双红.口腔溃疡病证治的古今文献研究[D].成都:成都中医药大学,2009.(收稿日期:2021-12-31)
09中国民间疗法2023年5月第31卷第9期。