电化学和电化学发光核酸适体传感器

电化学和电化学发光核酸适体传感器
摘要核酸适体具有亲合力强、选择性高、稳定性好、易于修饰等优点，广泛用于对目标物如蛋白质、小分子等的灵敏检测。

电化学具有成本低、灵敏度高、仪器小巧等优点。

近年来，构建基于核酸适体的电化学传感器，已经成为一个热门的研究领域。

本文重点评述了2005年以来核酸适体的电化学传感器的研究进展，并展望其发展前景。

关键词核酸适体；电化学；传感器；电化学发光；综述
2011-01-25收稿；2011-05-11接受
本文系国家自然科学基金（No.20875086）、科技部项目（No.2006BAE03B08）和吉林省科技厅项目（No. 20082104）资助
* E-mail: guobaoxu@
1 引言
核酸适体是通过指数式富集法配体进化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术从人工合成的DNA 或RNA 随机库中筛选出来的，能够与目标分子进行高亲和性和高特异性结合的寡核苷酸序列［1,2］。

与抗体相比，核酸适体具有体外合成、选择性高、稳定性好、
易于修饰等很多优点。

构建基于核酸适体的电化学传感器在药物筛选、临床诊断、环境检测等方面具有广阔的应用前景。

常见的设计电化学传感器的方法包括免标记法和标记法，前者的核酸适体不用电化学信号物标记，成本相对低廉，一般多是阻抗型的核酸适体传感器；后者常用亚甲基蓝、二茂铁等电化学活性物作标记，成本相对较高，一般多用电流型的核酸适体传感器。

依据核酸适体与目标物结合前后的构象变化，可以设计Signal-off和Signal-on两种传感模式，前
者是基于核酸适体与目标物结合后的信号降低进行检测，灵敏度一般低于后者。

本文对这几种方法作简要对比，重点评述了2005年以来核酸适体在电化学传感器研究领域的进展。

2 核酸适体的电化学生物传感器的应用
2.1 蛋白质的检测
蛋白质是一类重要的生物大分子，许多蛋白质在生物体中有着特殊的地位。

如凝血酶是一种特殊的丝氨酸内蛋白酶，它的含量与白血病、动脉血栓及肝脏疾病密切相关［3］。

对凝血酶灵敏检测的电化学传感器多有报道，如Signal-off型［4,5］，Signal-on型［6～10］等。

2005年，Xiao等［11］
报道了一个Signal-off型电化学传感器用于凝血酶的检测。

他们将末端修饰亚甲基蓝（MB）的凝血酶核酸适体固定在金电极上。

当没有目标物时，核酸适体以展开的结构存在，电化学信号物MB能够与电极进行有效电子传递，产生较大的电
流信号。

当目标物存在时，核酸适体与凝血酶结合形成刚性结构，导致MB远离电极表面，这种构象改变使电流信号明显下降。

该传感器成功实现了对实际样品血液中凝血酶的灵敏检测，检出限达6.4 nmol/L。

该报道提供了一种通用的电
化学检测方法，它实现了快速、灵敏检测核酸适体结合目标物引起的构象改变。

Liu等［12］设计了测定干扰素IFN-γ的Signal -off型电化学传感器。

他们在干扰素的核酸适体末端修饰MB，将它固定在电极上并形成发夹结构，可以实现MB
和电极间的电子传递，电流信号较大。

当核酸适体与干扰素IFN-γ结合后，发夹结构打开，迫使MB远离电极表面，阻
碍了电子传递，电流明显降低。

与传统的免疫检测方法相比，该传感器操作简便，仪器简单，并且灵敏度更高，对干扰素IFN-γ的检出限达到0.06 nmol/L。

然而，Signal-off型电化学传感器有自身的缺点，例如其原理是根据核酸适体与目标物结合所导致的信号降低而进
行检测，存在背景电流大，检出限高的缺点，限制了方法的灵敏度。

为了解决该问题，Xiao等［13］设计了一个Signal-on 型传感器。

他们先将包含凝血酶核酸适体的寡核苷酸链通过金硫键固定在金电极的表面，再与末端标记MB的互补链杂交形成双链，此时MB远离电极表面，电流信号很小。

当凝血酶与其核酸适体结合后，部分双链解开，拉近了MB与电极表面的距离，电流信号变大，对凝血酶的检出限达3 nmol/L。

该Signal-on型传感模式为实现快速灵敏地检测蛋白质及小
分子提供了新的思路。

Lai等［14］设计了一个用于直接检测血液中血小板衍生生长因子（PDGF）的电化学传感器。

他们将末端修饰MB的PDGF核酸适体固定在金电极的表面，此
时核酸适体处于半折叠状态，电流信号较小；当核酸适体与目标物结合后，缩短了MB与电极表面的距离，电流信号变大。

该Signal-on传感器在实际样品中显示出优越的稳定性，对血样和稀释血样中PDGF的检出限分别达到1 nmol/L和50 pmol/L。

Wang 等［15］通过静电吸附作用将电化学探针［Ru （NH【sub】3【/sub】）【sub】5【/sub】Cl］2＋固定在电极表面，利用金纳米粒子的信号放大效应实现了对PDGF的高
灵敏检测，检出限达0.01 pmol/L。

石英晶体微天平（QCM）能够测量微小质量变化引起的共振频率改变。

它利用石英晶体的压电特性，将电极表面微小的质量变化转化为石英晶体振荡的频率变化，实现对微小质量的测量［16］。

Minunni等［17］将基于QCM的生物传
感器用于HIV-1激活蛋白的测定。

他们利用生物素和亲和素
之间的特异结合作用，将该蛋白的核酸适体RNA固定在金电极上，实现了对该蛋白的特异性灵敏检测。

与传统的免疫传感器相比，该传感器稳定性更好，灵敏度更高。

此外，基于QCM的电化学核酸适体传感器还被用于对溶液中凝血酶［18］和IgE［19］的检测。

电化学阻抗谱（EIS）是研究生物分子间相互作用的重要技术［20］。

Peng等［21］构建了基于EIS的电化学传感器，将溶菌酶的核酸适体及其互补链修饰在金盘电极表面，加入溶菌酶后，核酸适体与目标物特异性结合，导致电化学阻抗减小。

通过测量加入目标物前后电化学阻抗的变化，实现了对溶液中目标物的灵敏检测，检出限达0.07 nmol/L。

电化学发光（ECL）是通过电化学激发反应产生的发光现象［22,23］。

它具有灵敏度高、仪器简单和便于控制等优点，被广泛用于免疫分析、核酸分析、共反应物分析和生物传感器的构建［24～31］。

Bai等［32］构建了一个基于核酸适体的ECL生物传感器，实现了对溶菌酶的高灵敏检测，检出限达0.1 pmol/L。

纳米材料由于具有独特的电化学性质，在电化学传感器构建中备受亲睐［33～38］。

Lin等［39］设计了一种基于ECL的电化学传感器，实现了对凝血酶的高灵敏检测。

他们将凝血酶的核酸适体链分割成两段，其中一段的一端固定在金电极表面，另一段的末端修饰上Ru2＋掺杂的硅纳米球（Ru-SNPs）。

当凝血酶存在时，它与两段核酸适体链结合形成四极子结构，缩短了Ru-SNPs与电极之间的距离，产生发光信号。

这种方法对凝血酶的检出限达到0.2 pmol/L。

2.2 小分子的检测
相对于蛋白质等大分子物质，对小分子检测的电化学传感器发展相对滞后，进展比较缓慢。

这是由于小分子物质与
核酸适体的结合常数比较小，因此限制了对小分子目标物的灵敏检测［40,41］。

常见的用于小分子检测的电化学传感模
式包括免标记型［42］和标记型［43］，常用的标记物有MB ［6］、二茂铁（Fc）［44］及钌的化合物［45,46］。

Zayats等［47］首次报道了一个免标记的电化学传感器用于对小分子腺苷的检测。

利用腺苷结合核酸适体前后，电化学阻抗的变化，对腺苷的检出限达2 ??SymbolmA@ mol/L。

Li等［48］
构建了一个基于EIS的免标记电化学传感器，将腺苷核酸适
体通过其部分互补链固定在金电极表面，当溶液中有腺苷目标物时，腺苷与其核酸适体结合，使双链解开，电化学阻抗减小。

该免标记传感器可重复使用性好，实现了对腺苷的高灵敏检测。

Kim等［49］设计了一个免标记的电化学传感器
用于对腺苷的检测。

当溶液中仅含有Ru（bpy）【sub】3【/sub】
2＋和腺苷的核酸适体时，核酸适体以无规则的卷曲结构存在，Ru（bpy）【sub】3【/sub】2＋能够进入该核酸适体中，电流信号较大。

当加入腺苷时，它与核酸适体结合导致结构改变，Ru（bpy）【sub】3【/sub】2＋不易进入该核酸适体，导致电流信号降低。

利用这一原理，实现了对溶液中腺苷的检测。

Zhang等［44］将末端修饰Fc的腺苷核酸适体固定在电极表面。

当不加入腺苷时，该核酸适体形成发夹结构，并且末端的部分双链碱基对能够被核酸内切酶识别并剪切，Fc 标记的核酸适体寡核苷酸链游离在溶液中，电流信号接近零。

当加入腺苷时，核酸适体与腺苷结合，导致核酸适体末端的部分互补碱基对改变，核酸内切酶无法识别，电流信号较大。

利用对背景电流的抑制效应，对腺苷的检出限达到0.1
nmol/L。

构建能够直接用于对实际样品的连续、实时检测的电化学传感器是一项具有挑战性的工作。

为解决这一难题，Swensen等［50］设计了一种微流控电化学传感器芯片，当目标物可卡因与核酸适体进行特异性结合时，核酸适体折叠，产生电化学信号，该信号与体系中目标物的量成正比。

该芯片成功地用于对血液中可卡因的定量检测。

值得一提的是，实验中所用血样未经过稀释及其他预处理过程。

Du等［51］利用层层自组装技术及静电吸附作用，在铟锡氧化物电极上（ITO）修饰上多层的Fc-聚二甲酰胺膜及金纳米粒子，并在
金纳米粒子上修饰可卡因核酸适体。

利用目标物与核酸适体结合前后，DPV信号的变化，实现对可卡因的灵敏检测。

该传感器在对实际样品如人体血清及唾液检测中，显示出卓越的抗干扰能力。

Zuo等［52］报道了一种夹心法电化学传感器，他们创新性地将小分子目标物的核酸适体链分割成两段，其中一段通过金硫键固定在金电极表面，另一段末端标记上电化学信号物MB。

当没有目标物时，电流信号较小；当目
标物存在并与两段核酸适体结合形成三明治结构时，MB与
电极的距离变近，电流信号增强。

该方法成功实现了对实际
样品血液中可卡因及ATP小分子的灵敏检测。

与已有的检测小分子的方法相比，该方法的操作简便，并且检测过程中不涉及目标物与核酸适体结合的双链解旋等构象改变过程，因此响应更加快速。

插入法是构建电化学传感器的常见方法，MB和Ru的化合物常作为插入的电化学信号物［53］。

例如［Ru（bpy）【sub】
2【/sub】dppz］2＋是一个应用广泛的DNA分子嵌入物，由于其具有伸展的芳香结构，与DNA具有很强的结合力，因此能够插入DNA分子中。

［Ru（bpy）【sub】2【/sub】dppz］2＋在草酸溶液中的ECL信号可以忽略；而溶液中同时有DNA 存在时，［Ru（bpy）【sub】2【/sub】dppz］2＋插入DNA分子中，ECL信号增强近1000倍。

Hu等［54］利用这一性质，将它用于溶液中ATP的检测。

当ATP存在时，核酸适体与ATP 结合，导致［Ru（bpy）【sub】2【/sub】dppz］2＋的ECL信号下降。

这种免标记法实现了对溶液中ATP分子的直接检测。

Dong的小组［55］设计了一个用于检测ATP的高灵敏传感器，利用金纳米粒子的信号放大效应及ATP结合核酸适体前后差分脉冲伏安法（DPV）信号的差别，对ATP的检出限达0.1 nmol/L。

Das等［56］报道了一个基于单壁碳纳米管的化学
电阻核酸适体传感器，该传感器具有很高的灵敏度，对ATP
的检出限达1 pmol/L。

与DNA核酸适体相比，RNA核酸适体的稳定性不高［57］，
很容易被核糖核酸酶降解，因此基于RNA核酸适体的电化学传感器鲜有报道。

Ferapontova等［58］首次设计了一种基于RNA核酸适体的电化学传感器。

将末端修饰Fc的茶碱RNA
核酸适体通过金硫键固定在金电极的表面，此时电化学信号物Fc远离电极表面，电流信号较小。

当核酸适体与茶碱结合后，形成发夹结构，这种构象改变拉近了Fc与电极之间的距离，增加了电子传递效率，电流信号较大。

该传感器对茶碱的检出限达0.2 ??SymbolmA@ mol/L，并可用于对实际样品
血清中茶碱的检测。

2.3 核酸适体传感器用于多重检测分析
构建多功能的电化学传感器，并且实现对溶液中两个及两个以上目标物的灵敏检测是一个重要挑战。

Du［59］设计了一个多功能、可重复使用的电化学传感器。

他们将ATP和凝血酶的混合单链核酸适体通过其部分互补链修饰在金电
极的表面。

当溶液中的目标物与相应的核酸适体结合时，引起EIS或CV信号的改变，从而实现对ATP和凝血酶的灵敏检测。

检出限分别达到10 nmol/L和10 pmol/L。

这种传感器利用电化学阻抗图谱实现了在免标记的前提下，对目标物的高灵敏、可再生及多元分析。

此后不久，Du等［60］在该工作的基础上构建了一个微流控的电化学核酸适体传感器，实现了对溶液中小分子物质ATP和可卡因的多元分析。

Deng等［61］将末端互补的腺苷和溶菌酶核酸适体固定在电极表面，
然后将电极浸泡在Ru（NH【sub】3【/sub】）3＋【sub】6【/sub】溶液中，通过静电吸附作用，Ru（NH【sub】3【/sub】）3＋【sub】6【/sub】被吸附在核酸适体中。

当溶液中含有腺苷或溶菌酶时，由于核酸适体与目标物的结合，导致核酸适体构型发生改变，影响电子传递。

利用电流信号的变化实现了对腺苷和溶菌酶的同时检测。

此外，实验还考查了纳米粒子对传感器灵敏度的影响，发现当引入金纳米粒子时，对两个目标物的检测效果都有明显提高。

Li等［62］将末端标记CdS及PbS的金纳米粒子通过DNA链固定在金电极表面。

当目标物与对应的核酸适体结合时，金纳米球脱落。

利用阳极溶出伏安法检测Cd及Pb的溶出峰，该峰电流与目标物的量成正比，从而实现了对腺苷和凝血酶的灵敏检测。

3 展望
2004年，Ikebukuro等首次报道一个基于核酸适体的电化学传感器［63,64］，实现了对凝血酶的灵敏检测。

随后，相关的报道不断涌现［65］。

特别是近5年来，电化学传感器的发展取得了长足的进步。

然而迄今为止，电化学传感器仍处于发展的早期阶段，成功地投入实际应用的仍然很少。

未来，构建电化学核酸适体传感器的工作将可能主要在以下几个方面展开：（1）发展能够直接用于复杂生物样品检测的电化学传感器，以实现对癌细胞的早期快速灵敏检测及对血液等相关疾病的临床医学诊断；（2）筛选对小分子具有高亲
和力的核酸适体［66,67］，并实现对小分子的免标记高灵敏检测；（3）利用纳米材料良好的催化性能及信号放大作用，构建新型纳米核酸适体传感器，以提高传感器的灵敏度；（4）设计新的传感模式［68］，以提高传感器的可重复实用性及灵敏度；（5）设计小型化、便携式、价格低廉的电化学传感器，用于对有毒物质的实时分析。

毫无疑问，基于核酸适体的电化学传感器的研究将仍然是一个活跃的研究领域。

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Electrochemical and Electrochemiluminescent Aptasensors YUAN Tao1,2, LIU Zhong-Yuan1, HU Lian-Zhe1,2, XU
Guo-Bao*1
1（State Key Laboratory of Electroanalytical Chemistry, Changchun Institute of Applied Chemistry,Chinese Academy of Sciences, Changchun 130022）
2（Graduate University of Chinese Academy of Sciences,
Beijing 100039）
Abstract Aptamers have been widely used for the detection of target molecules owing to their chemical stability, easy modification and remarkable specificity and affinity with various target molecules. Electrochemical methods are well known for low cost, high sensitivity and miniature instruments. Recently, the design of electrochemical aptasensors has attracted remarkable attention in the field of biosensors. This paper mainly reviewed the developments of this field since 2005, and the prospects are discussed.
Keywords Aptamer；Electrochemistry；Biosensor；Electrochemiluminescence；Review
（Received 25 January 2011accepted 11 May 2011）。