一种新型碱性脂肪酶的制备方法[发明专利]

(10)申请公布号 CN 102071176 A
(43)申请公布日 2011.05.25C N 102071176 A
*CN102071176A*
(21)申请号 200910154648.3
(22)申请日 2009.11.23
C12N 9/20(2006.01)
C12N 15/01(2006.01)
(71)申请人湖州来色生物基因工程有限公司
地址313100 浙江省德清县武康镇长虹街
333号
(72)发明人吴菁
(54)发明名称
一种新型碱性脂肪酶的制备方法
(57)摘要
本发明公开了一种碱性脂肪酶的制备方法。

是从含油的土壤中分离得到碱性脂肪酶菌株，经
过初筛和复筛和紫外诱变，获得了一株高产脂肪
酶菌株，经过种子培养后转入发酵培养基培养，发
酵得到碱性脂肪酶液，酶液经过硫酸铵盐析、疏水
层析、阴离子交换层析后干燥得到纯度和酶活高
的碱性脂肪酶，为碱性脂肪酶的进一步研究和开
发生产提供了新的途径。

(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 2 页 说明书 2 页
1.一种碱性脂肪酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)产酶菌株的来源、初筛和复筛
将采自含油土壤中的样品加入富集培养基中，振荡培养，然后后取少量培养液加入新鲜培养基中继续培养，如此重复3次后，进行平板分离.
将富集培养液用无菌水梯度稀释至10-3，取稀释液0.1ml于分离平板中，用涂布器连涂三块板，并标记。

将涂布好的平板，在培养箱倒置培养。

挑选出较大蓝色圈的单菌落，进行编号，接种于斜面培养基。

从分离后的斜面上分别接菌于初筛发酵培养基，摇床中培养，测酶活。

再将初筛得到的优良菌株接于复筛培养基的摇瓶中，发酵培养，测酶活。

(2)诱变
取复筛得到的稀释分散菌液置于无菌培养基中，用紫外灯诱变处理，然后将菌液涂布于平板培养，挑选透明圈大的单菌落进行培养，获得了一株高产脂肪酶菌株。

(3)碱性脂肪酶的生成
将诱变得到的高产酶菌株接入平板培养基，得到出发菌株，再将出发菌株接入种子培养基，发酵培养得到的种子菌株转入发酵培养基，发酵培养，得到碱性脂肪酶粗酶液。

(4)碱性脂肪酶的分离纯化
离心上清液加硫酸铵，静置，离心收集蛋白质沉淀，将溶于少量水中，用Tris-HCl 缓冲液透析过夜。

然后将透析液上样到已预平衡的苯基-SepharoseCL-4B层析柱(D 1.1cm×30cm)上，用同一缓冲液洗涤，再用含乙醇和甘油的Tris-HCL缓冲液进行洗脱，收集活性组分。

将收集的活性组分在透析袋中浓缩后，用甘氨酸缓冲液透析，上样到已预平衡的DEAE Sepharose fast flow层析柱(D1.1cm×20cm)上，以含NaCl的同一缓冲液进行梯度洗脱。

将经DEAE Sepharosefast flow柱层析得到的高纯度脂肪酶冷冻干燥后，即得到碱性脂肪酶。

2.根据权利(1)中所述的产酶菌株的来源、初筛和复筛，其特征在于：富集培养基：酵
母膏0.02％，Na
2HPO
4
0.35％，KH
2
PO
4
0.15％，MgSO
4
.7H
2
O 0.05％，NaCl 0.05％，橄榄油
1.0％；震荡培养条件为26℃，180r/min，培养时间为3d；平板筛选培养基：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，葡萄糖0.3％，琼脂粉1.5％，Tween80 0.5％.PVA 1.0％，橄榄油
2.5％；平板培养温度为25℃，时间3d；斜面培养基：酵母浸出粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.5；初筛和复筛的发酵培养条件均为26℃，180r/min培养36h；筛选培养基：蛋白胨40g/L，蔗糖20g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4.7HzO 0.5g/L，大豆油5g/L，pH 9.5。

3.根据权利(2)中所述的诱变，其特征在于：30W的紫外灯在距离15-30cm处照射4-6min。

4.根据权利(3)中所述的碱性脂肪酶的生成，其特征在于：种子培养基为：葡萄糖
2.0％，(NH
4)
2
SO
4
0.5％，KH
2
PO
4
0.1％，MgSO
4
.7H
2
O 0.05％，蛋白胨2.5％，橄榄油1.0％；
种子培养条件为：28℃培养16-18h；发酵培养基：蛋白胨2.0％，可溶性淀粉3.0％，橄榄
油1.0％，(NH
4)
2
SO
4
0.1％，MgSO
4
.7H
2
O 0.075％，K
2
HPO
4
0.1％；发酵培养条件为：初始pH
9.0～9.5，30℃培养48h。

5.根据权利(4)中所述的碱性脂肪酶的分离纯化，其特征在于：硫酸铵以70％饱
和度沉淀4h，以含0.5mol/L硫酸铵的20mmol/L Tris-HCl缓冲液(PH7.5)透析；在苯基-Sepharose CL-4B层析后，用含3％乙醇和5％甘油的20mmol/L Tris-HCL缓冲液(PH7.5)进行洗脱；再用50mmol/L甘氨酸缓冲液(pH 8.6)透析24h；在DEAESepharose fast flow层析柱上，以含NaCl的缓冲液进行洗脱。

一种新型碱性脂肪酶的制备方法
技术领域
[0001] 本发明是关于一种新型碱性脂肪酶的制备方法，属于生物酶工程领域。

背景技术
[0002] 脂肪酶(Lipase，甘油酯水解酶)是一类分解和合成脂肪的酶，脂肪酶广泛存在于许多动植物及微生物中，它不仅可以催化酯水解反应还可以催化酯合成反应和转酯反应。

脂肪酶广泛存在于许多动植物及微生物中，主要应用于食品加工及食品风味改良、油脂工业、皮革绢纺原料脱脂、洗涤工业等方面，是一种应用广泛的工业用酶。

[0003] 自20世纪80年代以来，碱性脂肪酶因水解脂肪具有高效、反应条件温和、无毒等优点，引起了国内外学者的广泛兴趣。

国外研究的碱性脂肪酶产生菌主要有假单胞菌、芽孢杆菌、无色杆菌、不动杆菌、毛霉、圆弧青霉、假丝酵母等。

目前，外国学者已经搞清了Pseudomonas fluoreseens和Penicilllum camembeilii等菌株的碱性脂肪酶的结构和作用位置的特异性。

成功克隆到类产碱假单胞菌Pseu-domonas pseudocdeligemes)、司徒芘丘假单胞菌(Pseudomonas stutzer)、醋酸钙不动杆菌(Aeinetobatex ealeoaeefieus)等菌株的碱性脂肪酶基因，并将高产菌株如米赫毛霉(Mueormiehe)等菌株的碱性脂肪酶基因克隆到适合发酵的菌株中，大大提高了脂肪酶产量，如今碱性脂肪酶已大量应用于工业化生产。

[0004] 我国于20世纪60年代才开始微生物脂肪酶的研究，起步较晚，与国外脂肪酶的研究存在一定的差距。

研究主要集中在脂肪酶的结构鉴定、菌种筛选、酶工程及基因克隆等方面。

由于碱性脂肪酶结构及性质的多样性、酶的不稳定性、底物的水不溶性、提纯困难等因素导致碱性脂肪酶的研究进展比较慢，而且国内研究的产碱性脂肪酶菌株的种类较少，主要有醋酸钙不动杆菌、类产碱假单胞菌、白地霉、青霉等。

由于应用的需要，菌种及酶种的选择也不断扩大，尽量获得产酶能力高、容易培养管理、产酶性能稳定、不产有害物质、安全可靠的菌株，以及能耐酸、耐碱、耐高温的特殊酶种。

因此筛选具有新特性、高活力的碱性脂肪酶生产菌株对于碱性脂肪酶的深入研究和广泛应用有重要意义。

本发明是从含油的土壤中分离得到碱性脂肪酶菌株，经过初筛和复筛和紫外诱变，获得了一株高产脂肪酶菌株，经过种子培养后转入发酵培养基培养，发酵得到碱性脂肪酶液，酶液经过硫酸铵盐析、疏水层析、阴离子交换层析，得到纯度和酶活高的碱性脂肪酶。

发明内容
[0005] 本发明的目的之一是提供一种碱性脂肪酶的制备方法。

[0006] 本发明所说的碱性脂肪酶的制备方法，是从含油的土壤中分离得到碱性脂肪酶菌株，经过初筛和复筛和诱变，获得了一株高产脂肪酶菌株，经过种子培养后转入发酵培养基培养，发酵得到碱性脂肪酶液，酶液经过硫酸铵盐析、疏水层析、阴离子交换层析，最后经凝胶过滤得到纯度和酶活高的碱性脂肪酶。

[0007] 本发明的技术解决方案如下：
[0008] (1)产酶菌株的来源、初筛和复筛
[0009] 将采自含油土壤中的样品加入富集培养基中，振荡培养，然后后取少量培养液加入新鲜培养基中继续培养，如此重复3次后，进行平板分离.
[0010] 将富集培养液用无菌水梯度稀释至10-3，取稀释液0.1ml于分离平板中，用涂布器连涂三块板，并标记。

将涂布好的平板，在培养箱倒置培养。

挑选出较大蓝色圈的单菌落，进行编号，接种于斜面培养基。

[0011] 从分离后的斜面上分别接菌于初筛发酵培养基，摇床中培养，测酶活。

再将初筛得到的优良菌株接于复筛培养基的摇瓶中，发酵培养，测酶活。

[0012] (2)诱变
[0013] 取复筛得到的稀释分散菌液置于无菌培养基中，用紫外灯诱变处理，然后将菌液涂布于平板培养，挑选透明圈大的单菌落进行培养，获得了一株高产脂肪酶菌株。

[0014] (3)碱性脂肪酶的生成
[0015] 将诱变得到的高产酶菌株接入平板培养基，得到出发菌株，再将出发菌株接入种子培养基，发酵培养得到的种子菌株转入发酵培养基，发酵培养，得到碱性脂肪酶粗酶液。

[0016] (4)碱性脂肪酶的分离纯化
[0017] 离心上清液加硫酸铵，静置，离心收集蛋白质沉淀，将溶于少量水中，用Tris-HCl 缓冲液透析过夜。

然后将透析液上样到已预平衡的苯基-SepharoseCL-4B层析柱(D1.1cm×30cm)上，用同一缓冲液洗涤，再用含乙醇和甘油的Tris-HCL缓冲液进行洗脱，收集活性组分。

将收集的活性组分在透析袋中浓缩后，用甘氨酸缓冲液透析，上样到已预平衡的DEAE Sepharose fast flow层析柱(D1.1cm×20cm)上，以含NaCl的同一缓冲液进行梯度洗脱。

将经DEAE Sepharosefast flow柱层析得到的高纯度脂肪酶冷冻干燥后，即得到碱性脂肪酶。

[0018] 本发明采用从含油土壤中筛选得到的产碱性脂肪酶菌株经过紫外线诱变，获得了高产酶菌株，再经发酵培养得到粗碱性脂肪酶液。

粗酶液经过硫酸铵盐析、疏水层析、阴离子交换层析，最后经凝胶过滤得到纯度和酶活高的碱性脂肪酶。

该发明从土壤中获得了一种新型的产碱性脂肪酶菌株，经过发酵培养获得了高纯度和酶活的碱性脂肪酶，为碱性脂肪酶的进一步研究和开发生产提供了新的途径。