一种烟酰胺单核苷酸的纯化方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201680003982.7(22)申请日 2016.07.30(85)PCT国际申请进入国家阶段日
2017.06.07(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/CN2016/092455 2016.07.30(87)PCT国际申请的公布数据
WO2018/023205 ZH 2018.02.08
(71)申请人 邦泰生物工程（深圳）有限公司
地址 518102 广东省深圳市宝安区西乡铁
岗桃花源科技创新园第三分园1栋厂房1层A-2(72)发明人 傅荣昭　张琦　张冬民　(51)Int.Cl.
C07H 1/06(2006.01)
C07H 19/048(2006.01)
(54)发明名称
一种烟酰胺单核苷酸的纯化方法(57)摘要
一种烟酰胺单核苷酸的纯化方法，涉及对生物催化法制备得到的NMN的粗产物进行纯化的方法。

该方法的目的在于解决现有NMN的纯化方法存在的收率低和纯化产物纯度低的问题，该方法包括以下步骤：A、将生物催化法制备得到的烟酰胺单核苷酸粗产物上阴离子交换树脂柱，用水洗脱，收集洗脱液；B、步骤A的洗脱液进行纳滤浓缩处理，收集浓缩液；C、步骤B的浓缩液上螯合树脂柱，用水洗脱，收集洗脱液；D、步骤C的洗脱液经浓缩、干燥处理后即得纯化后的烟酰胺单核苷酸成品。

该方法对于采用生物催化法制备NMN所获
得的NMN粗产物的纯化具有普遍适用性。

CN 108026132 A 2018.05.11
C N 108026132
A
(12)按照专利合作条约所公布的国际申请
(19)世界知识产权组织
国际局
(43)国际公布日
2018年2月8日（08.02.2018)
(51)国际专利分类号：TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,ZA,
C07H1/06(2006.01)C07H19/048(2006ZM,Z W。

(21)国际申请PCT/CN2016/092455(84)指定国（除另有指明，要求每一种可提供的地区
保护）：ARIPO(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,M Z
(22)国际申请日：2016年7月30日（30.07.2016)
NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ΖΜ,ZW),欧亚（AM，
中文AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),欧洲(AL,AT,BE,B G
CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,H U
中文
IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT
有限RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OAPI(BF,BJ,CF,CG,C
公司（BONTAC BIO-ENGINEERING(SHENZHEN)
CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG)。

CO.,LTD)[CN/CN]；中国广东省深圳市宝安区
西乡街道铁岗桃花源科技创新园第三分园1本国际公布：
栋1层A-2,Guangdong518102(CN)。

-包括国际检索报告(条约第21条(3))。

(72)发明人：傅荣昭(FU,Rongzhao)；中国广东省深
圳市宝安区西乡街道铁岗桃花源科技创新园
第三分园1栋1层A-2,Guangdong518102(CN)。

张琦(ZHANG,Qi);中国广东省深圳市宝安区
=西乡街道铁岗工业区4栋2楼B,Guangdong
=518102(CN)…张冬民(ZHANG,Dongmin);中国
≡广东省深圳市宝安区西乡街道铁岗工业区
=4栋2楼B,Guangdong518102(CN)…
(81)指定国（除另有指明，要求每一种可提供的国家
=保护）：AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,
=BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,
≡≡CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,
=GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,
=KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,
≡MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,
≡NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,
=RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,
(54)Title:PURIFICATION METHOD FOR NICOTINAMIDE MONONUCLEOTIDE
(54)发明名称：一种烟酰胺单核苷酸的纯化方法
(57)Abstract:A purification method for nicotinamide mononucleotide,relating to a method for purifying an NMN crude product
obtained via a biocatalysis method.The purpose of the present method i s to solve the problems in existing NMN purification methods of low yield and low purified product purity.The present method comprises the following steps：A,placing a nicotinamide mononucleotide crude product obtained via a biocatalysis method in an anion exchange resin column,eluting with water,and collecting an eluate;B, performing nano filtration concentration treatment on the eluate of step A,and collecting a concentrate;C,placing the concentrate of step B in a chelating resin column,eluting with water,and collecting an eluate;D,performing concentration and drying treatment on the eluate of step C,and obtaining a purified nicotinamide mononucleotide product.The present method i s universally applicable for the purification of NMN crude products obtained via biocatalysis methods.
(57)摘要：一种烟酰胺单核苷酸的纯化方法，涉及对生物催化法制备得到的NMN的粗产物进行纯化的方¾法。

该方法的目的在于解决现有NMN的纯化方法存在的收率低和纯化产物纯度低的问题，该方法包括以下步骤：A、将生物催化法制备得到的烟酰胺单核苷酸粗产物上阴离子交换树脂柱，用水洗脱，收∞集洗脱液；B、步骤A的洗脱液进行纳滤浓缩处理，收集浓缩液；C、步骤B的浓缩液上螯合树脂柱，用水洗脱，收集洗脱液；D、步骤C的洗脱液经浓缩、干燥处理后即得纯化后的烟酰胺单核苷酸成品。

该方法对于采用生物催化法制备NMN所获得的NMN粗产物的纯化具有普遍适用性。

一种烟酰胺单核苷酸的纯化方法
技术领域
[0001]本发明涉及烟酰胺单核苷酸的制备方法的技术领域，特别涉及对生物催化法制备得到的烟酰胺单核苷酸的粗产物进行纯化的方法。

背景技术
[0002]烟酰胺单核苷酸（Nicotinamide mononucleotide,缩写成NMN)是生物细胞内存在的一种生化物质，是辅酶I的合成底物，它在被烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺
苷化后即变成辅酶I(NAD)。

在生物体内NMN的水平和烟酰胺核苷酸腺苷转移酶（NAMPT)的活性直接影响到NAD的浓度，同吋NMN直接参与体内腺苷转
移，是体内重要的一种合成底物和功能调节物质。

在治疗应用方面，NMN可以
用于抗衰老、治疗慢性病等，同吋研究表明NMN还对胰岛素的分泌起到调节作
用，对mRNA表达水平也有影响。

因此，NMN在医药治疗方面有着广泛的应用
前景，同吋也作为一种反应底物在化工方面有着广泛的市场前景。

[0003]目前，烟酰胺单核苷酸的制备方法主要包括以下三种：1、酵母菌发酵法；2、化学合成法；3、生物催化法。

其中，化学合成法具有成本较高且产生手性化合
物的缺点；而酵母菌发酵法生产的NMN含一定有机溶剂残留；生物催化法因不
含机溶剂残留，也不存在手性问题且制备的NMN与机体内的同型而成为目前最
绿色环保无公害的NMN的制备方法。

[0004]现有的制备NMN的生物催化法一般是以烟酰胺和5'-磷酸核糖基-Γ-焦磷酸（PR PP)为底物，在烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphoribosyltransferase
，缩写成Nampt)的催化下制备NMN。

该方法制备得到的NMN粗产物一般应用
离子交换树脂进行纯化，但由于NMN与多种类似物带电荷和极性极为相近，导
致分离纯化有很大困难，往往无法将其中的类似物杂质完全去除。

现有的应用
离子交换树脂进行纯化的方法往往只能获得纯度在60%左右的产品，而收率只有40%左右，生产效率低下，不适合规模化生产。

技术问题
[0005]针对上述背景技术中提到的现有NMN的纯化方法存在的收率低和纯化产物纯度低的问题，本发明的目的在于提供一种收率高、产物纯度高的NMN的纯化方
法。

问题的解决方案
技术解决方案
[0006]为实现上述目的，本发明提供了一种烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
[0007]A、将生物催化法制备得到的烟酰胺单核苷酸粗产物上阴离子交换树脂柱，用水洗脱，收集洗脱液；
[0008]B、步骤A的洗脱液进行纳滤浓缩处理，收集浓缩液；
[0009]C、步骤B的浓缩液上螯合树脂柱，用水洗脱，收集洗脱液；
[0010]D、步骤C的洗脱液经浓缩、干燥处理后即得纯化后的烟酰胺单核苷酸成品。

[0011]本发明提供的NMN的纯化方法适用的处理对象为采用生物催化法制备NMN而得到的NMN粗产物，该生物催化法具体是指用生物酶催化底物转化成NMN的方法，其中的生物酶是烟酰胺磷酸核糖转移酶或者是烟酰胺磷酸核糖转移酶和一
种或者多种其他酶的联合使用，其中的底物可以是PRPP和烟酰胺，也可以是能
够转化成PRPP或者烟酰胺的前体物质。

[0012]上述NMN的纯化方法中步骤B的设计目的，一方面在于浓缩洗脱液，缩短后续上样的吋间，提高效率；另一方面在于脱除一部分盐，以使得洗脱液中的杂质
更易于吸附在螯合树脂上。

[0013]上述NMN的纯化方法中步骤D中的浓缩处理可以采用本领域已知的任何适用的浓缩方式，如纳滤浓缩、反渗透浓缩等；干燥处理可以采用本领域已知的任何
适用的干燥方式，如冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥等。

[0014]优选地，所述阴离子交换树脂为弱碱性阴离子交换树脂，包括D201、D354和A 510等。

[0015]更优选地，所述弱碱性阴离子交换树脂为含有叔胺基的阴离子交换树脂，包括D301、D311和LX-67等。

[0016]优选地，步骤A和步骤C中全程采用核酸蛋白检测仪进行检测，检测波长为260
nm，所述洗脱液的收集方式为从所述核酸蛋白检测仪的读数幵始上升吋幵始收
集，待读数幵始下降吋停止收集。

[0017]优选地，所述方法中用于纳滤浓缩处理的纳滤膜的截留分子量为100-300。

[0018]优选地，所述方法还包括：在步骤A之前，将所述烟酰胺单核苷酸粗产物的pH 值调至5.5-6.5。

这样做的好处在于：一方面该pH值范围内的产品的稳定性相对
较好，另一方面该pH值范围与容器的耐酸度相匹配。

[0019]优选地，
所述方法还包括：在步骤D之前，将步骤C的洗脱液的pH值调至2.0-2.4。

因从螯
合树脂柱中洗脱下来的洗脱液的pH值较低，而后续纳滤浓缩处理所用的纳滤设
备的耐酸度在2.0以上，故为保护设备，需将洗脱液的pH值调至2.0-2.4。

如若后
续采用的浓缩设备的耐酸度较高，则无需调节其pH值。

[0020]优选地，步骤D中，浓缩处理过程采用截留分子量为100-300的纳滤浓缩设备，并用纯水多次冲洗至产品中的钠离子的质量百分含量在1%以下。

[0021]为使阴离子交换树脂循环使用，以降低生产成本，优选地，所述方法还包括将所述阴离子交换树脂再生的步骤，所用的再生液为pH为1.0含量为l.Omol/L的氯
化钠溶液。

[0022]为使螯合树脂循环使用，以降低生产成本，优选地，所述方法还包括将所述螯合树脂再生的步骤，所用的再生液为l.Omol/L的盐酸溶液。

发明的有益效果
有益效果
[0023]与现有技术相比，本发明提供的烟酰胺单核苷酸的纯化方法具有收率高和纯化产物纯度高的优点，经工业实践证实，该纯化方法的收率可达60%以上，而纯化后的NMN的纯度高达97%以上。

并且该方法不使用有毒有害有机溶剂、绿色环
保、工艺简单易操作、生产成本较低，使得纯化后的产品极具市场竞争力。

该
方法对于采用生物催化法制备NMN所获得的NMN粗产物的纯化具有普遍适用性
本发明的实施方
式
[0024]下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例。

[0025]实施例1
[0026]处理对象：邦泰生物工程（深圳）有限公司采用生物酶催化法（以PRPP和烟酰胺为底物，用烟酰胺磷酸核糖转移酶催化制备NMN)制备得到的四批NMN粗产物溶液，经高效液相色谱法测得这四批NMN粗产物溶液中NMN的含量及纯度如表1所示。

[0027]对上述四批NMN粗产物溶液的纯化过程如下：
[0028]1、一次调PH值：因上述四批NMN粗产物溶液的p H值较高，故先用盐酸将其p H调至6.0左右；
[0029]2、一次纳滤浓缩：采用纳滤浓缩设备将NMN粗产物溶液纳滤浓缩至原体积的1/6左右，以缩短上样吋间，所使用的纳滤膜的截留分子量为200;
[0030]3、一次上样：将两根装填有含有叔胺基的阴离子交换树脂D301的离子柱（r=3 00nm、h=2700nm、190L)串联，并调节好所有串联的阀门；步骤2的浓缩液进
行上样，缓慢调节上样速度为200-300I J h(1-1.5BV)；注意观察流速的变化；
全程采用核酸蛋白检测仪进行检测，检测波长为260nm，记录核酸蛋白检测仪的读数并观察读数变化；
[0031]4、一次淋洗：待上样完成后，调节阀门用纯水淋洗离子柱，并调节好淋洗流速，使之在200-300I J h(1-1.5BV)；
[0032]5、一次纯化产品收集：待核酸蛋白检测仪的读数幵始上升吋收集产品，待核酸蛋白检测仪的读数幵始下降吋停止收集，并送样检测；
[0033]6、二次纳滤浓缩：将步骤5收集到的一次纯化产品进行纳滤浓缩处理，纳滤至原体积的1/2左右，所使用的纳滤膜的截留分子量为200;
[0034]7、二次上样：将两根装填有螯合树脂的离子柱（r=300nm、h=2700nm、190L )并联，并调节好所有并联的阀门；步骤6的浓缩液进行上样，缓慢调节上样速
度为100-200I J h(0.5-1.0BV)；注意观察流速的变化；全程采用核酸蛋白检测仪进行检测，检测波长为260nm，记录核酸蛋白检测仪的读数并观察读数变化；[0035]8、二次淋洗，待上样完成后，调节阀门用纯水淋洗离子柱，并调节好淋洗流
速，使之在100-200I J h(0.5-1.0BV)；
[0036]9、二次纯化产品收集，待核酸蛋白检测仪的读数幵始上升吋收集产品，待核酸蛋白检测仪的读数下降至1.0吋停止收集，并送样检测；
[0037]10、二次调pH值：将步骤9收集到的二次纯化产品用氢氧化钠调pH至2.0-2.4; [0038]11、三次纳滤浓缩：将步骤10调好pH值的产品进行纳滤浓缩处理，并用纯水多次冲洗直至产品中的钠离子的质量百分含量在1%以下，所使用的纳滤膜的截留
分子量为200;
[0039]12、干燥：步骤11的浓缩液经冻干后即得纯化后的NMN成品。

[0040]采用高效液相色谱法检测这四批纯化后的NMN成品的含量及纯度，并计算收率，其结果如表1所示。

[0041]表1
[]
[0042]实施例2
[0043]阴离子交换树脂的再生过程如下：
[0044]1、冲洗：用大量的纯水将残留在树脂中的副产品冲洗出来，直至核酸蛋白检测仪的读数下降至0.5以下；
[0045]2、再生：酉己制pH为1.0含量为1.0mol/L的氯化钠再生液400-500L,旋幵再生阀，打幵再生泵，用200-300I J h(1-1.5BV)的再生速度再生阴离子交换树脂；[0046]3、水洗：再生液再生完后，用2-3柱体积的纯水冲洗离子柱，则该阴离子交换树脂柱即可用于下一次的纯化处理，吸附性良好。

[0047]实施例3
[0048]螯合树脂的再生
[0049]1、冲洗：用大量的纯水将残留在树脂中的副产品冲洗出来，直至核酸蛋白检测仪的读数下降至0.5以下；
[0050]2、再生：配制1.0mol/L盐酸再生液400-500L,旋幵再生阀，打幵再生泵，用20 0-300L/h U-1.5BV)的再生速度再生螯合树脂；
3、水洗：再生液再生完后，用2-3柱体积的纯水冲洗离子柱，则该螯合树脂柱
即可用于下一次的纯化处理，吸附性良好。

权利要求书
[权利要求1]一种烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
A、将生物催化法制备得到的烟酰胺单核苷酸粗产物上阴离子交换树
脂柱，用水洗脱，收集洗脱液；
B、步骤A的洗脱液进行纳滤浓缩处理，收集浓缩液；
C、步骤B的浓缩液上螯合树脂柱，用水洗脱，收集洗脱液；
D、步骤C的洗脱液经浓缩、干燥处理后即得纯化后的烟酰胺单核苷
酸成品。

[权利要求2]根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其特征在于：所述阴离子交换树脂为弱碱性阴离子交换树脂。

[权利要求3]根据权利要求2所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其特征在于：所述弱碱性阴离子交换树脂为含有叔胺基的阴离子交换树脂。

[权利要求4]根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其特征在于：步骤A和步骤C中全程采用核酸蛋白检测仪进行检测，检测波长为260η
m，所述洗脱液的收集方式为从所述核酸蛋白检测仪的读数幵始上升
吋幵始收集，待读数幵始下降吋停止收集。

[权利要求5]根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其特征在于：所述方法中用于纳滤浓缩处理的纳滤膜的截留分子量为100-300。

[权利要求6]根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其特征在于，所述方法还包括：在步骤A之前，将所述烟酰胺单核苷酸粗产物的pH值
调至5.5-6.5。

[权利要求7]根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其特征在于，所述方法还包括：在步骤D之前，将步骤C的洗脱液的pH值调至2.0-2.4
[权利要求8]根据权利要求7所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其特征在于：步骤D中，浓缩处理过程采用截留分子量为100-300的纳滤浓缩设备，并
用纯水多次冲洗至产品中的钠离子的质量百分含量在1%以下。

[权利要求9]根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其特征在于：所述方法还包括将所述阴离子交换树脂再生的步骤，所用的再生液为p
H为1.0含量为1.0mol/L的氯化钠溶液。

[权利要求10]根据权利要求1所述的烟酰胺单核苷酸的纯化方法，其特征在于，所述方法还包括将所述螯合树脂再生的步骤，所用的再生液为l.Omol/L
的盐酸溶液。

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Y CN102876759A(SYNCOZYMES(SHANGHAI)CO.,LTD.),16January20131-10
(16.01.2013),description,and paragraphs0037and0038
Y向万宏et al.,螫合树脂的合成及应用研究新进展，化工技术与开发,32(2),30April1-10 2003(30.04.2003),pages16-22,(XIANG,Wanhong et al.,New Progress of Synthesis and
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(31.12.1975),pages128-137
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(31.12.1981),pages339-344
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Nucleotides,13(5),31December1994(31.12.1994),pages1215-1216
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类型*引用文件，必要时，指明相关段落相关的权利要求
Y CN104817604Α(邦泰生物工程深圳有限公司）2015年8月5日(2015-08-05)1--10权利要求1，说明书第0020-0023段
ΥCN102876759A(尚科生物医药上海有限公司）2013年1月16日（2013-01-16)1--10说明书第0037，0038段
Υ向万宏等.螯合树脂的合成及应用研究新进展.1--10化工技术与幵发.，第32卷，第2期，2003年4月30日（2003-04-30)，
第16-22页
ΥCHRIST,.等.''Preparation and Purification o f Nicotinamide Mononucleotide1--10 Analogs."
METHODS I N ENZYMOLOGY.，第66卷，1980年12月31日（1980-12-31)，
第71-81页
ΥHENSEL,W.等."Convenient Method for Preparation and Purification of1--10 Nicotinamide Mononucleotide Analogs."
ANALYTICAL BIOCHEMISTRY.,第68卷，1975年12月31日（1975-12-31)，
第128-137页
其余文件在c栏的续页中列出。

见同族专利附件。

引用文件的具体类型：在申请日或优先权日之后公布，与申请不相抵触，但为了理解
发明之理论或原理的在后文件
认为不特别相关的表示了现有技术一般状态的文件
"X"特别相关的文件，单独考虑该文件，认定要求保护的发明不是在国际申请日的当天或之后公布的在先申请或专利新颖的或不具有创造性
可能对优先权要求构成怀疑的文件，或为确定另一篇引用文件"特别相关的文件.当该文件与另一篇或者多篇该类文件结合并的公布日而引用的或者因其他特殊理由而引用的文件（如具体且这种结合对于本领域技术人员为显而易见时，要求保护的发说明的）明不具有创造性
涉及口头公幵、使用、展览或其他方式公开的文件'•"同族专利的文件
公布日先于国际申请日但迟于所要求的优先权日的文件
国际检索实际完成的日期国际检索报告邮寄日期
2017年4月14日2017年4月2
ISA/CN的名称和邮寄地址受权官员
中华人民共和国国家知识产权局（ISA/CN)
廖文勇中国北京市海淀区蓟门桥西土城路6号100088
传真号(86-10)62019451电话号码(86-10)62413867
表PCT/ISA/210(第2页）（2009年7月）
相关文件
类型:引用文件，必要时，指明相关段落相关的权利要求
BERGHAUSER,J.等."A simple preparation o f an enzyme reactor producing1-10
nicotinamidemononucleotide.
BIOTECHNOLOGY LETTERS.,第3卷，第7期，1981年12月31日(1981-12-31)
第339-344页
LIU,R.等."A Novel Preparation o f Nicotinamide Mononucleotide.1-10
NUCLEOSIDES AND NUCLEOTIDES.,第13卷，第5期，1994年12月
31日（1994-12-31)，
第1215-1216页
JECK,R.等."Simple methods o f preparing nicotinamide mononucleotide.1-10
FEBS LETTERS.,第42卷，第2期，1974^6月30日（1974-06-30)，
第161-164页
表PCT/ISA/210(第2页）（2009年7月）
关于同族专利的信息
PCT/CN2016/092455
公布日公布日检索报告引用的专利文件同族专利
(年/月/日）(年/月/日）CN104817604A2015年8月5日J P2017504616A2017年2月9曰
u s2016333041A l2016年11月17
o2016086860A l2016年6月9日CN102876759A2013年1月16日无
表PCT/ISA/210(同族专利附件）（2009年7月）。