实验22谷类作物种子中赖氨酸含量的测定(精)

实验22谷类作物种子中赖氨酸含量的测定
蛋白质中赖氨酸（lysine，Lys）的含量是谷物品质的主要指标之一。

由于动物及人类不能合成，须从食物中得以补充，为此培育高含量赖氨酸的谷物，对于提高营养价值有重要意义。

本实验分别用茚三酮溶液显色法和染料结合法（Dye Binding Lysine，DBL）测玉米种子中赖氨酸含量。

一、原理
谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的ε-NH2，它与茚三酮（ninhydrin）试剂可发生颜色反应，生成紫红色物质，其颜色与赖氨酸残基的数目成正相关。

选用碳原子数目与赖氨酸相同的亮氨酸，配成标准溶液，做出标准曲线，可用以测定谷物蛋白内赖氨酸的含量.
二、材料、仪器设备
（一）材料：不同品种的玉米种子，用粉碎机粉碎，过100目筛子，收集过筛后的细粉，放入广口瓶内，加入沸程60～90℃的石油醚，使其淹过粉面，浸泡8h，不时搅动进行脱脂。

然后过滤，并用石油醚淋洗沉淀若干次，弃去滤液。

将脱脂玉米粉晾在干净的滤纸上，置阴凉通风处吹干石油醚。

收集干粉，置干燥器内，保存备用。

（二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 水浴锅；3. 试管；4. 圆头玻璃棒（圆头大小要与试管大小配套）。

（三）试剂：1. 缓冲溶液，称取30g甲酸钠，溶解于约60ml蒸馏水中，加入10ml8％的甲酸，最后加水到100ml；2.茚三酮试剂，称取1g茚三酮和1g氯化镉（CdCl2.H2O），加入25ml 上述缓冲溶液和75ml乙二醇，室温下放置一天，第二天使用。

若出现沉淀，则过滤后使用。

该溶液一定要头一天配制，第二天使用，不宜放置过久，也不能现用现配；3.4％和2％无水碳酸钠溶液各50ml；4.标准亮氨酸溶液，准确称取25mg亮氨酸，加数滴稀盐酸，待溶解后定容至50ml，该溶液亮氨浓度为500μg/ml。

准确吸取上述母液1，3，5，7，9ml，分别稀释至25ml，待用。

三、实验步骤
（一）绘制标准曲线准确吸取已配好的标准浓度系列的亮氨酸溶液各0.5ml，分别放入5支试管中，每种浓度做三个重复。

再取一支试管加入0.5ml蒸馏水做空白对照。

向每支试管中各加入0.5ml的4％碳酸钠溶液和2ml茚三酮试剂（头一天配好的），混匀，在80℃恒温水浴上保温30min。

取出后，立即放入冷水浴中冷却3min，然后向每管内加入5ml的95％乙醇，摇匀，在分光光度计上500nm波长处进行比色，以空白做对照，读取吸光度。

以吸光度值为纵座标，亮氨酸浓度为横座标，绘出标准曲线，并求出曲线的斜率。

（二）样品的测准确称取已脱脂的各种玉米种子干粉各25ml，每个品种做三个重复。

放入试管中（试管应预先烘干），加入约300mg细石英砂（估计数字）和1ml2％碳酸钠溶液，用圆头玻棒充分搅拌2min，注意切勿将试管挤破，将试管放入80℃恒温水浴中，提取10min，应常搅动。

取出试管，向每管内按顺序加入2ml茚三酮试剂，混匀，放入80℃恒温水浴中，保温显色30min，同时以蒸馏水做一空白对照，取出后，立即放入冷水浴中冷却3min，以下步骤与标准曲线做法相同。

加完乙醇后进行过滤，用滤液进行比色，读取吸光度。

若样品颜色过深，则可取一定量的滤液用95％乙醇稀释后比色，吸光度的数值以在标准曲线范围内为宜。

在标准曲线上查出相当的亮氨酸含量。

一般作物的籽粒中，蛋白质含量约为干重的10％～20％，富含蛋白的种子中则为30％～50％；赖氨酸含量约为3～7g／16g氮。

四、结果计算按下列公式进行计算
赖氨酸含量（μg Lys/mg）＝G×2×N/W 。

式中：G—为标准曲线上查出的亮氨酸的量（μg ／0.5ml）；N—为样品稀释倍数；W—为样品的重量（mg）。