免疫荧光技术2

二.免疫荧光技术的基本条件
（一）荧光素 （二）待标记抗体的标准 （三）荧光标记抗体的制备 （四）荧光标记抗体的纯化与鉴定
（一）荧光素
（一）荧光素:一种有机或无机的化学物质，其接受激发光的光 能以后，能够以发射光形式产生明亮的荧光而作为染料使用。各 种荧光素都有各自的激发波长和发射波长。因发射波长不同，荧 光颜色各异。 荧光素及其性质：荧光素具有共轭双键体系的化学结构。荧光素 通常处于最低的能量状态，称为基态（ground state)。当荧光素 受到紫外光或可见光的短波部分（紫光和蓝光）作为激发光照射 时，会吸收合适波长的电磁波，其外层 电子即进入更高能量的 轨道，从而处于激发态（excited state)。
（2）四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) ：RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和 丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为 570nm，最大发射光波长为595～ 600nm，呈现橘红色荧光。
（3）四甲基异硫氰酸罗丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC)：TRITC为罗丹明 的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为 550nm，最大发射光波长为620nm， 呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其 荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。 （5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自 然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其 发射荧光峰值约为576 nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通 滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。
（1）去除游离荧光素 （2）去除未标记和过度标记的抗体 （1）抗体和荧光的活性鉴定 （2）荧光素与蛋白质的摩尔比值 （F/P） （3）荧光抗体浓度的测定 （4）荧光抗体特异性的鉴定 （1）经鉴定合格的荧光抗体，可过滤除菌，也 可加入防腐剂（0.01%硫柳汞或0.1%NaN3）或抗 生素防腐 （2）荧光抗体经无菌，小量分装后置0~4℃可保 存1年左右，-20℃可保存2~3年，冷冻干燥后可保 存较长时间。 （3）冷冻取出后应快速融化，并避免反复冻融。
（二）待标记抗体的标准
• 用于标记的抗体须特异性强，纯度高，效价高，经荧光素标记后 抗体活性损失少。标记前，可用梅花状琼脂双向扩散法测定抗体 效价，即中央孔加抗原（1mg/ml),周围孔加倍比稀释的抗体（1： 2~1：64），抗体效价在1：32以上较为理想。荧光标记的抗体可 以是多克隆抗体或单克隆抗体，亦可以是SPA，后者可作为荧光 二抗的通用试剂。
免疫荧光技术 （immunofluorescence technique,IFA)
实验1301班 杨小玉
主要内容
一.免疫荧光技术概念 原理 二.免疫荧光技术的基本条件 三.经典荧光抗体染色法 四.现代免疫荧光技术
一.免疫荧光技术的概念及原理
• 概念：免疫荧光技术是将荧光素的敏感可测性,抗原抗体反应的可 测性以及显微技术高度精确性相结合的一种免疫标记测定技术。
FITC 呈黄 绿色 荧光
RB200 呈橘红 色荧光 色
FITC+RB200 双标记染色法
合适荧光素的选择：
（1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。 （2）荧光效率高，标记后下降不明显。 （3）荧光色泽与背景色泽对比鲜明。 （4）标记后能保持生物学活性和免疫活性 （5）标记方法简单、快速。 （6）安全无毒
免疫荧光技术原理
免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或 抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗 原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。 在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素， 利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生 明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细 胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测 定含量。
（三）荧光标记抗体的制备
• 1.FITC标记抗体 • 2.RB200标记抗体 • 3.TRITC标记抗体 • 4.PE标记抗体
（1）搅拌标记法 （2）半透膜透析标记法
（1）PE巯基化 （2）IgG与PE交联 （3）残余巯基的封闭 （4）透析平衡
（四）荧光标记抗体的纯化与鉴定
• 荧光标记抗体的纯化 • 荧光标记抗体的鉴定
三.补体荧光染色法
• 概念：将荧光素标记在抗补体抗体（抗C3抗体），检测抗原抗体 复合物。此法是间接法的一种改良，利用补体结合反应的原理， 在抗原抗体反应时加入补体（多用豚鼠补体），再用荧光素标记 的抗C3抗体进行示踪。主要用于检测抗体。 • 检测过程分两步： 第一步：将待测抗体和补体加在已知抗原的玻片上，作用一 段时间后，洗去未结合的抗体和补体。 第二步：滴加荧光标记抗C3抗体。如果在第一步中抗原抗体 发生特异性结合，则补体被固定，此时加入的标记抗补体抗体即与 补体发生结合，形成“抗原—抗体—补体—荧光标记抗C3抗体”的大 分子免疫复合物
三荧光标记抗体的制备1fitc标记抗体2rb200标记抗体3tritc标记抗体4pe标记抗体1搅拌标记法搅拌标记法2半透膜透析标记法半透膜透析标记法1pe巯基化巯基化2igg与与pe交联交联3残余巯基的封闭残余巯基的封闭4透析平衡透析平衡四荧光标记抗体的纯化与鉴定荧光标记抗体的纯化荧光标记抗体的鉴定荧光标记物的保存1去除游离荧光素去除游离荧光素2去除未标记和过度标记的抗体去除未标记和过度标记的抗体1抗体和抗体和荧光的活性鉴定荧光的活性鉴定2荧光素与蛋白质的摩尔比值荧光素与
• 荧光标记物的保存
三.经典荧光抗体染色法
一.直接荧光抗体染色法 二.间接荧光抗体染色法 三.补体荧光染色法 四.特殊染色法
一.直接荧光抗体染色法
• 概念：将荧光素标记的特异性抗体直接滴加于待检标本片上，避 光反应和洗涤以后，在荧光显微镜下观察标本中是否有相应抗原 存在。这是荧光抗体技术最简单，最基本的方法。
四.特殊染色法
1.细胞表面双标记或三标记荧光抗体染色 2.细胞内双色免疫荧光染色 3.反衬染色法
四.现代免疫荧光技术
流式细胞术（FCM） 荧光偏振免疫分析技术（FPIA） 时间分辨荧光免疫测定（TrFIA）
流式细胞术（FCM）
是以荧光免疫技术为基础而发展起来的一种专门的细胞分析技术。
常见荧光素的特性：
FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm，发射光520~530nm， 明亮的黄绿色荧光。 RB200：橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光595~600nm，橘红 色荧光。 TRITC：紫红色粉末，吸收550nm，发射光620nm，橙红色荧光。 PE：吸收光490～560nm，发射光595nm，红色荧光。
荧光素的荧光特性：
• （1）停止供能，荧光现象随即终止 • （2）对光的吸收和荧光的发射具高度选择性入射光波长<发射光 波长 • （3）荧光效率：荧光效率=发射荧光的光量子数 /吸收光的光量 子数 • （4）荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱
常见荧光素：
1）异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) ：FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水 和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。 FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的 黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄 绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
二.间接荧光抗体染色法
• 概念：将荧光素标记于抗抗体（荧光二ห้องสมุดไป่ตู้）或标记葡萄球菌A蛋 白（SPA），以荧光二抗检测与抗原结合的特异性抗体。 • 检测过程： 第一步：将第一抗体加在含有抗原的标本上，避光孵育一定时 间以后，洗去未结合的抗体。 第二步：将荧光二抗加在标本上，与结合在抗原上的抗体（一 抗）结合，形成“抗原—抗体—荧光二抗”的复合物