表达猪瘟病毒E2_蛋白的重组杆状病毒反应器工艺研究

·研究论文·
Chinese Journal of Animal Infectious Diseases
中国动物传染病学报摘 要：为建立一套表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺，提高反应器上猪瘟病毒E2蛋白的表达量，以商业化培养基为基础，通过对关键营养组分添加量的DOE 试验设计优化，获得一种组合补料配方，并在3 L 反应器上对补料方式进行优化，以最大限度提高细胞密度。

进一步在反应器上摸索了通气策略，以精确调控猪瘟E2重组杆状病毒培养过程的营养代谢平衡，解决副产物乳酸和氨过度积累导致细胞活力下降的问题。

首次使用半连续补料工艺与渗透压动态平衡相结合的补料策略以及定向调节通气的工艺模式，使猪瘟病毒E2蛋白的表达量由130 mg/L 增加至520 mg/L ，提高了3倍。

将3 L 反应器工艺在100 L 反应器上进行了连续3个批次的验证，结果猪瘟病毒E2蛋白的表达量均大于500 mg/L ，收获猪瘟E2蛋白制备的疫苗抗体均在2周后转阳，且抗体水平持续上升，接种后8周抗体阻断率仍维持在80%左右。

综上，3 L 反应器工艺能够稳定放大至100 L 反应器，建立了表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒100 L 反应器工艺，且100 L 反应器上重组蛋白的表达量稳定、免疫原性良好。

关键词：猪瘟病毒；E2蛋白；重组杆状病毒；关键营养单元；半连续补料；定向调节
中图分类号：S852.65 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2024）02-0049-09
Improvement of Bioreactor Process of Recombinant Baculovirus Expressing E2
Protein of Classical Swine Fever Virus
CHEN Xiao 1,2, LI Weiguo 1,2, SONG Huanhuan 1,2, SU Xiaorui 1,2, WANG Tongyan 1,2,
Tan Feifei 1,2, Tian Kegong 1,2
(1. National Research Center For V eterinary Medicine, Luoyang 471000, China; 2. Public Bioengineering Co., Ltd., Luoyang 471000, China)收稿日期：2021-12-24
基金项目：郑洛新国家自主创新示范区创新引领型产业集群专项（201200211200）；云南省田克恭专家工作站（2019IC062）作者简介：陈晓，女，硕士，工程师，主要从事悬浮细胞培养工艺的建立及转化；李伟国，男，专科，助理兽医师，主要从事悬
浮培养工艺建立及转化
通信作者：谭菲菲，E-mail：**************；田克恭，E-mail：**************
表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺研究
陈 晓1,2，李伟国1,2，宋欢欢1,2，苏晓蕊1,2，王同燕1,2，谭菲菲1,2，田克恭1,2
（1.国家兽用药品工程技术研究中心，洛阳471000；2.普莱柯生物工程股份有限公司，洛阳471000）
2024,32(2):49-57Abstract: In order to improve the bioreactor process of the recombinant baculovirus expressing classical swine fever virus (CSFV) E2 protein, maximize cell density and increase the expression of CSFV E2 protein, a combined feeding formula was obtained based on the commercial culture medium by optimizing the DOE experimental design of the addition amount of key nutritional components and then the feeding model was optimized on a 3 L bioreactor. The aeration strategy of the bioreactor was further explored to accurately regulate the nutritional and metabolic balances in the culture process of CSFV E2 recombinant baculovirus and solve the problem of the decline of cell viability caused by the excessive accumulation of by-products lactic acid and ammonia. The feeding strategy of semi-continuous feeding process combined with dynamic balance of osmotic pressure and the process mode of directional regulated ventilation were used for the fi rst time to reduce the expression of CSFV E2 protein from 130 mg/L to 520 mg/L, a increase by 3 times. The 3 L bioreactor process was verifi ed in 100 L bioreactor for three consecutive batches. The results showed that the expression of E2 protein was more than 500 mg/L. The vaccine prepared from the harvested CSFV E2 protein induced positive antibody response after 2 weeks of
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猪瘟（classical swine fever, CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）引起的一种猪的高接触性、高致死率的急性传染病[1]。

传统预防和控制猪瘟主要以接种C株活疫苗为主，较难区分野毒感染抗体和免疫抗体。

CSFV结构蛋白E2是诱导产生中和抗体的主要抗原，具有高度的免疫原性[2-3]。

荷兰学者Hulist等[4]利用重组杆状病毒高效表达了猪瘟E2蛋白，用20 μg重组E2蛋白免疫，猪即可抵抗100LD50的CSFV强毒攻击。

通过基因工程技术高效表达猪瘟病毒保护性抗原基因，大量获得保护性抗原蛋白，与佐剂联合制成安全、高效的基因工程亚单位疫苗，对猪瘟防控、猪瘟净化非常有意义[5-6]。

国际和国内均已有利用杆状病毒表达系统研发的CSFV E2蛋白重组亚单位疫苗商业化，前期实验室已构建表达猪瘟E2蛋白的重组杆状病毒[7]，进一步对该重组杆状病毒在昆虫细胞上表达的反应器工艺进行研究，以期满足规模化生产的需求。

现阶段利用杆状病毒昆虫细胞系统在重组蛋白表达、疫苗开发和生产等方面的应用越来越广泛，但该系统所面临的成本高、产量低的问题仍是制约大规模生产、产品全面走向市场的关键因素[8]。

因此通过从不同方面了解昆虫细胞以及杆状病毒对环境条件的需求进而对其进行合理调控，是解决这一问题的关键所在。

重组杆状病毒的悬浮培养工艺一般从细胞株，培养基，感染策略包括感染复数（multiplicity of infection, MOI）、感染时间（time of harvest, TOI）、细胞初始密度（cell concentration of infection, CCI）等方面进行优化[9-15]，但是在反应器规模上针对补料方式联合过程参数控制对细胞代谢以及目的蛋白表达的影响则很少报道。

本研究为建立一套重组蛋白表达量高且稳定的反应器工艺，通过培养基关键营养组分的试验设计（design of experiment, DOE）优化以及反应器上补料方式联合通气策略的摸索，以精确调控表达猪瘟E2重组杆状病毒培养过程的营养代谢平衡，为解决代谢副产物乳酸和氨过度积累导致细胞活力下降的问题提供思路。

同时由3 L反应器工艺放大至100 L反应器的过程为表达猪瘟E2重组杆状病毒的规模化生产工艺奠定基础，并为其它的重组杆状病毒生产提供了工艺优化的方向。

1 材料和方法
1.1 细胞与毒种 Sf9昆虫细胞、High Five(Hi5)昆虫细胞均由国家兽用药品工程技术研究中心传代、保存；表达猪瘟E2蛋白的重组杆状病毒（rAC-5D-E2）由国家兽用药品工程技术研究中心自主构建和保存。

1.2 主要试剂基础培养基为商品化培养基；葡萄糖、谷氨酰胺、酵母提取物、脂质体均购自Sigma。

猪瘟病毒抗体检测试剂盒购自IDEXX；猪瘟阳性血清由国家兽用药品工程研究中心保存；兔抗猪IgG-HRP购自Sigma公司。

1.3 仪器设备 3 L反应器购自美国NBS公司；100 L反应器购自德国Sartouris公司；细胞计数仪购自上海睿钰生物科技有限公司；高效液相分析仪购自美国安捷伦公司；生化分析仪购自美国罗氏公司；渗透压分析仪购自德国罗泽公司。

1.4 昆虫细胞的复苏、培养 取出冻存于液氮中的Sf9和Hi5昆虫细胞株，迅速放入37℃水浴，缓慢摇动冻存管，待冰冻的细胞悬液完全融解后，转移至15 mL 离心管中，逐滴加入回温后的培养基，180 ×g离心5 min，弃上清液，用新鲜培养基重悬细胞，并补足到15 mL，转移至125 mL摇瓶，置于27℃、5%CO2摇床中培养。

1.5 重组杆状病毒的增殖取出冻存的表达猪瘟E2蛋白的重组杆状病毒，按照1%体积比接种至Sf9细胞25T培养瓶（5 mL），3～4 d后细胞活率为
immunization. The antibody level continued to rise and remained at about 80% blocking rate at 8 weeks post inoculation. In summary, the 3 L bioreactor process could be amplifi ed to 100 L bioreactor with the stable expression of CSFV E2 protein and good maintenance of its immunogenicity.
Key words: Classical swine fever virus; E2 protein; recombinant baculovirus; key nutrient units; semicontinuous feeding; ventilation mode
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陈 晓等：表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺研究第32卷第2期80%～90%时收获。

将收获的病毒液按照0.2%体积比接种至摇瓶，细胞活率在80%～90%时收获，收获的病毒液850 ×g ，10 min离心后上清液可用作E2蛋白表达的种毒。

1.6 重组杆状病毒E2蛋白的表达 使用Hi5细胞，选择初始细胞密度为
2.2×106 cells/mL，按照MOI=0.5接种表达猪瘟E2蛋白的重组杆状病毒，120 h收获。

每24 h取样，使用细胞计数仪测定活细胞密度和细胞活率。

离心取上清液使用生化分析仪检测葡萄糖、谷氨酰胺以及代谢副产物乳酸、氨的浓度。

收获液离心取上清液使用SDS-PAGE、Western blot猪瘟阳性血清（1∶500）对表达的蛋白进行鉴定，利用高效液相色谱方法对E2蛋白进行定量。

1.7 培养基中关键营养组分DOE 优化 在摇瓶中以商品化培养基为基础培养基，对拟添加的葡萄糖、谷氨酰胺、酵母提取物以及脂质体四个关键组分单元进行DOE试验设计优化。

每一组分单元设定3个水平，葡萄糖2、4、6 g/L；谷氨酰胺浓度
2.5、5、10 mmol/L，酵母提取物200、450、900 mg/L，脂质混合物45、90、180 mg/L，整体补加量为培养体积的20%，共计15组实验，3次重复。

取样按照1.6中的方法监测细胞密度与活率、葡萄糖与谷氨酰胺等营养物质、乳酸及氨等代谢副产物的浓度，建立不同补料配方条件下昆虫细胞的生长曲线。

1.8 补料添加方式的优化 使用NBS 3 L反应器对培养过程中补料的添加方式进行优化，培养体积1 L，温度设定27℃，培养过程中监控pH但不作调节，溶氧设定40%且关联搅拌转速100~150 r/min和通气率（vvm, Gas volume/culture volume/min）0.02~0.04。

三种补料的添加方式：1）直接补加：在培养第0 d 一次性添加200 mL的补料；2）间歇分次补加：将200 mL补料在培养过程的第0 d、第1 d、第2 d、第3 d、第4 d补加，每次补加40 mL；3）半连续补加：将需要补加的200 mL补料，以半连续方式（补加1 h，停止2 h，再次补加1 h，停止2 h，如此循环）在120 h内补加200 mL，补料过程取样使用渗透压检测仪监测过程中渗透压变化。

使用1.6中所述方法进行猪瘟E2蛋白表达，过程中采取不同补料的添加方式。

取样时间点、活细胞密度与活率、葡萄糖与
谷氨酰胺等营养物质、乳酸及氨等代谢副产物的浓度、猪瘟E2蛋白的表达量鉴定方法见1.6。

1.9 反应器通气策略的优化 在1.8中反应器培养工艺参数及获得的最优补料策略基础上，进一步对3L反应器的通气策略进行以下2种方式优化。

第一种通气模式，设定通气率0.02~0.04 vvm，由反应器控制系统自动计算并通入所需混合气体；第二种通气模式，根据细胞代谢副产物乳酸生成量针对性调节通气率，当乳酸生成量高于0.2 g/L时提高通气率至0.06 vvm，乳酸生成量低于0.1 g/L时，通气率回调至0.04 vvm。

根据乳酸生成量反馈调节通气率，精确控制代谢副产物的产生。

1.10 100 L 反应器工艺验证 根据3 L反应器上确定的最佳补料方式和通气策略，使用赛多利斯100 L反应器，培养体积80 L，培养温度27℃，pH过程监控但不调节，溶氧设定4 0%，关联搅拌转速60~80 r/min 进行猪瘟病毒E2蛋白的表达。

取样时间点、活细胞密度与活率、葡萄糖与谷氨酰胺等营养物质、乳酸及氨等代谢副产物的浓度、猪瘟E2蛋白的表达量鉴定方法见1.6。

1.11 猪瘟E2蛋白的免疫原性检测 100 L反应器悬浮培养收获的细胞培养物，离心后制苗，分别肌肉注射无猪瘟中和抗体的健康易感猪5头，每头2 mL，并于免前、免后1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周以及8周分别采血，参考猪瘟病毒抗体检测试剂盒说明书方法测定抗体阻断率。

2 结果
2.1 培养基关键营养组分的优化 摇瓶中以商品化培养基为基础，通过Design Expert 10.0软件将葡萄糖、谷氨酰胺、酵母提取物以及脂质体4个关键组分单元，3个水平的添加量进行实验设计优化以及标准差分析，比较15组配方对应的活细胞密度与对照组的差异，如表1所示。

对照组的最高活细胞密度为7.0（±0. 3）106 cells/mL，培养至72 h细胞活率为95.6（±1.9）%，生长速率开始变缓，96 h急剧下降至85.9(±2.1)%。

添加补料后最高活细胞密度均大于8.4×106 cells/mL，最优组的最高活细胞密度为11.9（±0.25）×106 cells/mL，较对照组提高了70%，培养至144 h细胞活率仍≥95%。

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使用第3 组补料配方最高活细胞密度占优势，确定最优补料配方为：葡萄糖4 g/L，谷氨酰胺5 mmol/L，酵母提取物为900 mg/L，脂质混合物45 mg/L。

对细胞培养过程中营养成分葡萄糖、谷氨酰胺以及代谢副产物的浓度进行检测，结果见图1。

使用基础培养基的细胞，葡萄糖在72 h几乎耗尽，谷氨酰胺48 h残留量仅为0.23（±0.017）mmol/L，培养基中的营养物质限制了细胞生长。

添加补料后96 h
营养成分谷氨酰胺浓度为0.83（±0.05）mmol/L，120 h葡萄糖浓度为1.58（±0.04）g/L，满足细胞生长需求。

基础培养基中代谢副产物乳酸生成量为510（±22）mg/L，氨从初始的1.8（±0.013）mmol/L增加至10.4（±0.047）mmol/L。

而添加补料后乳酸生成量为630（±39）mg/L，氨从初始的1.8（±0.014）mmol/L增加至14.9（±0.57）mmol/L。

代谢副产物添加补料后乳酸和氨分别增加了23%和43%。

表1 关键组分单元DOE 实验结果
Table1 The result of DOE optimization of key nutrition units
组别
Serial No.A B C D 结果
葡萄糖Glucose (g/L)谷氨酰胺Glutamine (mmol/L)酵母提取物The extract of yeast (mg/L)脂质混合物Lipid mixture (mg/L)活细胞密度
The density of viable cells (106cells/mL)
000007.0±0.4145450909.1±0.224102009010.6±0.33459004511.9±0.1425200908.7±0.552104501809.2±0.2665900909.4±0.274 2.5900908.8±0.386590018010.4±0.192 2.5450458.2±0.210410200458.9±0.2116 2.54509010.7±0.1124109001809.9±0.3136104501809.4±0.214652009010.6±0.2154 2.5200459.2±0.1图1 基础培养基与添加补料后乳酸含量（A ）和氨浓度（B ）曲线
Fig.1 The concentration of lactic acid (A) and ammonia (B) of basal culture medium and feeding medium
1: 基础培养基; 2: 第3组补料培养基
1: Basal culture medium; 2: The third feeding medium
时间 (h)
0 24 48 72 96 120 144 168 192
700
600500400300200100
12
乳酸含量（m g /L ）
A 0 24 48 72 96 120 144 168 192
12
1614
121086420
时间 (h)
氨浓度（m m o l /L ）
B
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陈 晓等：表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺研究第32卷第2期2.2 不同补料方式对细胞生长、代谢以及目的蛋白表达的影响 利用3台3 L反应器进行补料添加方式的优化，细胞生长曲线以及活率见图2，最高活细胞密度分别为一次性补料11.9（±0.25）×106 cells/mL，间歇分次补料12.2（±0.19）×106 cells/mL，半连续补料12.71（±0.31）×106 cells/mL，没有显著差异。

但选用一次性补加方式时，细胞活率在144 h为95.3（±3.1）%，168 h则降为81.3（±0.47）%，而采用间歇分次和半连续补加时，192 h活率维持在90%以上，维持时间更久。

培养过程中营养物质葡萄糖、谷氨酰胺以及代
谢副产物乳酸和氨生成情况见图3，一次性补加培养过程中乳酸生成量为630（±4.9）mg/L，氨从初始的1.8（±0.11）mmol/L增加至14.9（±0.17）mmol/L。

间歇分次补加乳酸生成量降为473（±24）mg/L，氨最高积累量为12.7（±0.39）mmol/L；而采用半连续补料乳酸为370（±2.1）mg/L，最高积累量为12.1（±0.51）mmol/L ；半连续补料方式较一次性补入，乳酸的积累量降低了27%，氨最高生成量降低了23%。

通过补料方式的优化，培养过程中乳酸和氨的积累量有明显的降低趋势，有利于细胞生长以及病毒的增殖。

图2 不同补料方式下活细胞密度（A ）以及活率曲线（B ） Fig.2 The cell growth curves of diff erent feeding mode
1: 一次性补加; 2: 间歇分次补加; 3: 半连续补加
1: One-time addition; 2: Interval addition; 3: Semi-continuous addition
图3 基础培养基与不同补料方式下乳酸含量（A ）和氨浓度曲线（B ）
Fig.3 The concentration of lactic acid (A) and ammonia (B) of diff erent feeding mode
1: 基础培养基; 2: 一次性补加; 3: 间歇分次补加; 4: 半连续补加
1: Basal culture medium; 2: One-time addition; 3: Interval addition; 4: Semi-con t inuous addition
时间 (h)
0 24 48 72 96 120 144 168 192
氨浓度(m m o l /L )
1614121086420
B 1
2
乳酸含量（m g /L ）
900
8007006005004003002001000
A 0 24 48 72 96 120 144时间 (h)
1234
氨浓度(m m o l /L )
161412108642
B 0 24 48 72 96 120 144
时间 (h)
1234
时间 (h)
0 24 48 72 96 120 144 168 192
细胞活率（%）活细胞密度（1×106 c e l l s /m L ）
14131211109876543210
10090
80
70605040302010
1-VCD 2-VCD 3-VCD 1-Via%2-Via%3-Via%
A
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基础培养基的渗透压为396 mOsm/L，一次性加入补料后，渗透压瞬间升高至462 mOsm/L。

间歇分次补料，每次补加补料后渗透压升高至451~457 mOsm/L。

半连续补料培养过程种渗透压维持动态平衡，渗透压均低于450 mOsm/L。

不同补料方式下猪瘟E2蛋白的表达，经SDS-PAGE以及Western blot鉴定如图4，在非还原条件下100 kDa左右出现目的条带。

使用高效液相定量方法检测结果见图5，上清中目的蛋白的表达量一次性添加补料为290 mg/L，间歇分次补入为392 mg/L，半连续补入为457 mg/L，与基础培养基中目的蛋白浓度130 mg/L相比提高3.5倍。

图4 不同补料方式下目的蛋白SDS-PAGE 分析（A ）和Western blot 分析（B ）
Fig.4 SDS-PAGE analysis (A) and Western blot analysis (B) of the protein expressed the protein expressed by diff erent
feeding mode
M: 蛋白分子量相对标准; 1: 基础培养基; 2: 一次性补加; 3: 间歇分次补加; 4: 半连续补加; 5: 空白对照
M: Protein marker; 1: Basal culture medium; 2: One-time addition; 3: Interval addition; 4: Semi-continuous addition; 5: Control 图5 不同补料方式下猪瘟E2目的蛋白浓度
Fig.5 HPLC analysis of the protein expressed by diff erent
feeding mode
1: 基础培养基; 2: 一次性补加; 3: 间歇分次补加; 4: 半连续补加1: Basal culture medium; 2: One-time addition; 3: Interval
addition; 4: Semi-continuous addition
2.3 反应器通气策略的优化 选用半连续渗透压平衡补料方式，在3 L反应器上对通气策略进行优化。

比较两种通气模式，根据乳酸生成量对应反馈调节通气率的策略，与固定通气率0.02~0.04 vvm相比，乳酸生成量在整个培养过程中维持200 mg/L以下，氨的浓度也维持在10 mmol/L。

而采用反馈调节通气的策略，目的蛋白E2的表达量为520 mg/L，与固定通气率模式相比，表达量提高了13%。

SDS-PAGE 以及Western blot鉴定在100 kDa左右出现目的条带
（图6）。

2.4 100 L 反应器工艺验证 采用3 L反应器上确定最优补料方式和通气策略，使用赛多利斯100 L反应器进行连续3个批次的工艺验证。

收获上清液中猪瘟E2目的蛋白表达量均大于500 mg/L。

表明该重组杆状病毒的小试工艺参数能够稳定放大至100 L反应器，
且蛋白表达量可维持批次间稳定。

kDa M 1 2 3 4 5
kDa M 1 2 3 4 5
补料方式
1 2 3 4
5004003002001000
E 2 表达量（m g /L ）
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陈 晓等：表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺研究
第32卷第2期
图6 不同通气策略下目的蛋白SDS-PAGE 分析（A ）和Western Blot （B ）分析
Fig.6 SDS-PAGE analysis (A) and Western blot analysis (B) of the protein expressed by aeration strategy
M: 蛋白分子量标准; 1: 固定通气模式; 2: 反馈调节通气模式; 3: 空白对照
M: Protein marker; 1: Fixed ventilation mode; 2: Directional regulated ventilation mode; 3: Control
2.5 猪瘟E2蛋白的免疫原性检测 3批100 L规模反应器悬浮培养收获的细胞培养物，离心后分别配制疫苗，肌肉注射无猪瘟中和抗体的健康易感猪5头，每头2 mL，并于免前及免后不同时间点采血，使用猪瘟抗体检测试剂盒测定抗体水平。

结果可知，3批100 L规模反应器悬浮培养收获的猪瘟E2蛋白制备的疫苗抗体均在2周后转阳，且抗体水平持续上升，接种后8周抗体阻断率仍维持在80%左右。

表明100 L规模反应器收获的目的蛋白制备的疫苗免疫后抗体水平较高，抗体持续期至少维持8周（图7）。

免疫后时间/周
100L-S001100L-S002100L-S003
1 2 3 4 5 6 7 8
100806040200
阴断率（%）
图7 100 L 反应器收获目的蛋白制备的疫苗免疫后抗体
水平
Fig.7 The antibody level of vaccine harvested from 100 L
reactor
3 讨论
在杆状病毒昆虫细胞系统蛋白表达的过程中调整培养基配方、优化培养基中的补料成分，是提高活细胞密度、进而增加目的蛋白表达量有效、稳定的策略之一[16]。

有研究对使用过的培养基成分进行分析，发现葡萄糖和谷氨酰胺的消耗影响细胞生长速度[17-18]。

关键组分如葡萄糖、谷氨酰胺、酵母酸盐和脂类溶液组成的营养素混合物能够提高活细胞密度以及重组蛋白表达量[19-20]。

将杆状病毒昆虫细胞系统的关键营养组分葡萄糖、谷氨酰胺、酵母提取物以及脂质体通过DOE实验设计优化以补料形式添加后，猪瘟E2蛋白的表达量由130 mg/L增加至290 mg/L，添加补料后目的蛋白表达量是仅使用商业化基础培养基表达量的2.23倍。

因此表明培养基营养成分对细胞生长以及重组蛋白的表达量至关重要。

另外，反应器通气策略的优化是工艺研究的很重要部分。

培养过程中乳酸的积累也被认为是昆虫细胞供氧减少和能量生产效率降低的一个指标，表观原因可能是能够进入细胞内的氧气量不能满足需求，进而培养液中二氧化碳分压增高[21]。

而充分的空气喷射是去除二氧化碳的关键[22]，溶解二氧化碳
kDa M 3 1 2
kDa M 1 2 3
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（dissolved CO2, dCO2）去除率是通气速率的强函数，对于相似的体积氧传递系数（volumetric oxygen transfer coefficient, kLa），较大的通气率可以更好地去除dCO2[23]，进而降低乳酸的生成量。

根据乳酸生成量对应提高或者降低通气率，将培养液中代谢副产物乳酸的生成量与通气率相关联，这种通气反馈调节模式下整个培养过程乳酸生成量降低了45%，同时氨的积累量降低了17%，猪瘟E2蛋白的表达量则提升为520 mg/L，有效地提高目的蛋白的表达量同时降低代谢副产物的生成量。

本研究通过关键营养组分单元的DOE实验设计，在商业化培养基的基础上优化得到一组补料配方。

采用半连续渗透压平衡补料方式和以乳酸生成量为参考值的反馈通气策略，能够解决代谢副产物乳酸和氨过度积累导致细胞活率下降的问题，同时猪瘟E2蛋白表达量由130 mg/L增加至520 mg/L，提高了3倍。

在100 L规模反应器连续进行3个批次工艺验证，实现了猪瘟E2蛋白的规模化生产，收获的猪瘟E2蛋白经动物实验评价具有良好的免疫原性。

表达猪瘟E2蛋白的重组杆状病毒大规模生产工艺的优化，为其它重组杆状病毒亚单位疫苗的工艺放大提供了借鉴的思路。

参考文献
[1] 马帅, 郑世磊, 赵明, 等. 我国猪瘟的流行病学及疫苗研
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