薯蓣皂素对睾丸支持细胞增殖及ESR核质膜异位的影响_董海军

DOIʒ10．13192/j．issn．1000-1719．2016．05．059
薯蓣皂素对睾丸支持细胞增殖及ESＲ核质膜异位的影响
董海军，马静，吴雷涛，杨倩倩，贾承明，曹亮，王玉珍，李颖琪
（第四军医大学第一附属医院中医科暨全军中医内科中心，陕西西安710032）
摘
要：目的：研究薯蓣皂素（Diosgenin ）促进小鼠睾丸支持细胞（TM4细胞系）增殖作用及机制。

方法：采用Brdu 标
记法检测不同浓度Diosgenin 及2.5μM Diosgenin 在不同时间对TM4细胞增殖的影响；Western Blot 法检测2.5μM Dios-genin 干预TM4细胞30min ，细胞质膜及核雌激素受体1（Estrogen receptors 1，
ESＲ1）和雌激素受体2（Estrogen receptors 2，ESＲ2）蛋白表达；2.5μM Diosgenin 联合1nM 雌激素膜受体拮抗剂ICI 或5nM 的Src 信号通路的酪氨酸激酶抑制剂PP2干预TM4细胞15min 后，细胞核与质膜中ESＲ1和ESＲ2蛋白表达。

结果：2.5μM Diosgenin 干预24h 时TM4细胞增殖最为显著（P ＜0.05），15min 时TM4细胞质膜上ESＲ1与ESＲ2蛋白表达最高（P ＜0.05），核表达最低（P ＜0.05）；2.5μM Diosgenin 联合ICI 或PP2干预15min 时ESＲ1与ESＲ2质膜表达受到明显抑制（P ＜0.05），联合PP2干预时，核ESＲ2表达较单用2.5μM 的Diosgenin 干预有所升高（P ＜0.05）。

结论：Diosgenin 具有类雌激素样作用，并能促进睾丸支持细胞增殖，且存在一定量效与时效关系；其机制可能与激活依赖于Src 诱导的即时和瞬态支持细胞ESＲ核质膜易位有关。

关键词：薯蓣皂素；支持细胞；增殖；雌激素受体；核质膜易位
中图分类号：Ｒ285．5文献标志码：A 文章编号：1000-1719（2016）05-1072-04Diosgenin on Proliferation and ESＲNuclear Membrane Translocations of Sertoli Cells in Mice Testis
DONG Haijun ，MA Jing ，WU Leitao ，YANG Qianqian ，CAO Liang ，JIA Chengming ，WANG Yuzhen ，LI Yingqi （Traditional Chinese Medicine Department ，The First Affiliated Hospital of The Fourth Military Medical University ，
The Army Medical Center in Traditional Chinese Medicine ，Xi'an 710032，Shaanxi ，China ）
Abstract ：Objective ：To study the effects of Diosgenin promoting mice sertoli cells （TM4celline ）proliferation and elucidate the possible mechanisms．Methods ：Brdu was used to detect different concentrations of Diosgenin on TM4cells proliferation．After 2．5μM Diosgenin stimulating TM4cells for 6－48h ，the proliferation was detected by Brdu．TM4cells were incubated with 2．5
μM Diosgenin for 30minutes and then nuclear and plasma membrane ESＲ1and ESＲ2proteins were extracted by Western blot．In addition ，the antiestrogen ICI and the selective inhibitor of the Src family protein tyrosine kinases and PP2were introduced to e-valuate the effect of Diosgenin on ESＲtranslocation．Ｒesults ：Different concentrations of Diosgenin could stimulate the proliferation of TM4cells ，of which ，2．5μM was the most significant （P ＜0．05）．Moreover ，the proliferation reached the maximum value at 24h （P ＜0．05）．At the time of 15minutes ，plasma membrane expressions of ESＲ1and ESＲ2of TM4cells were the highest （P ＜0．05）and nuclear expressions of ESＲ1and ESＲ2were significantly inhibited （P ＜0．05）．Consistently ，plasma membrane and nuclear expressions of ESＲ1and ESＲ2were blocked by ICI or PP2．The nuclear expression of ESＲ2was increased by combining PP2（P ＜0．05）．Conclusion ：Diosgenin has the similar function with estrogen and can promote sertoli cells proliferation．Diosgenin －induced translocation of ESＲ1and ESＲ2from nucleus to plasma membrane was dependent on protein tyrosine kinases Src．
Keywords ：Diosgenin ；sertoli cells ；proliferation ；estrogen receptor ；plasma membrane translocation
收稿日期：2015－12－22
基金项目：国家自然科学基金（8157381）；陕西省中医药管理局课题（13
－Jc049）
作者简介：董海军（1989－），男，河北南宫人，
硕士研究生，研究方向：男性不育的临床和基础研究。

通讯作者：马静，
E －mail ：jingma@fmmu．edu．cn 。

Diosgenin 来源于薯蓣科单子叶草质缠绕藤本植物，如山药、黄姜、黄药子、穿山龙等的根茎，是生产氢化可的松、强的松、地塞米松等多种甾体类药物的重要
基础原料。

研究表明［1－3］
，Diosgenin 具有抗氧化、抗血管钙化、抗炎等作用，其在生殖方面的作用研究甚少，
已证实
［4－5］
，Diosgenin 其能够改善轻度雄性衰老性生
殖障碍，提高精子活性，但对支持细胞的作用未见报道。

支持细胞在精子生成过程中可以提供结构支撑的微环境，具有营养、分泌、免疫豁免及吞噬等多种功能，是未成熟动物雌激素的主要来源，雌激素不仅可以直接促进支持细胞的增殖、分化和成熟，而且可以通过间接影响促卵泡生成素（Follicle －stimulating hormone ，FSH ）的分泌，调节支持细胞有丝分裂；雌激素又主要
是依靠其受体（Estrogen receptor ，
ESＲ）信号通路来完成生物学效应。

因此，研究Diosgenin 对支持细胞增殖
及ESＲ的影响，不仅可为探讨该药治疗男性不育的作用及机制，而且可为其进一步药物研发提供实验依据。

1材料和方法
1.1细胞
TM4细胞系为小鼠来源的睾丸支持细胞系，购于American Type Culture Collection（ATCC，Manassas，VA）。

1.2药物及试剂
Diosgenin、Brdu、ESＲ1和ESＲ2单克隆抗体、ICI、PP2（美国，Sigma公司）；SDS－PAGE凝胶试剂盒（中国，碧云天公司）；DMEM－F12培养基（美国，GIBCO 公司）；核蛋白抽提试剂盒（美国，Pierce公司）。

1.3仪器
倒置荧光显微镜（日本，OLYMPUS公司），全自动酶标仪（中国，TECAN公司），凝胶电泳成像分析系统（美国，Bio－Ｒad公司）。

1.4TM4细胞的复苏及传代培养
吸出融化的TM4细胞悬液至离心管，25ħ1000 r/min，离心5min，弃上清。

加入10mL的DMEM－F12高糖培养基；反复吹打，制成为单细胞悬液，移入培养瓶，在5%CO2－95%O2，37ħ培养箱内培养。

当细胞覆盖率达80%时进行细胞传代，用PBS缓冲溶液洗涤2次；加入0.25%胰蛋白酶2mL到培养瓶中1 min；当多数细胞变圆且互相分离，加入含有胎牛血清的培养基，吹打细胞，使其悬浮；将TM4细胞悬液转移至15mL离心管中，经恒温离心，弃上清，移入培养瓶，在CO2恒温箱培养。

1.5实验分组及处理
①空白对照组：TM4细胞中加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。

②Diosgenin组：在TM4细胞中加入上述培养液的基础上，分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0μM的Diosgenin进行培养。

③2.5μM Diosgenin组：2.5μM Diosgenin分别处理TM4细胞6、12、24、48h及0、5、15、30min。

④阳性对照组：TM4细胞中加入2.5μM Diosgenin和上述培养液，处理15 min。

⑤Diosgenin加ICI组：TM4细胞中加入2.5μM Diosgenin、上述培养液及1nM ICI，处理15min。

⑥Di-osgenin加PP2组：TM4细胞中加入2.5μM Diosgenin、上述培养液及5nM PP2，处理15min。

1.6检测指标及方法
1.6.1倒置荧光显微镜观察不同浓度Diosgenin干预TM4细胞24h，细胞数量和形态改变。

1.6.2Brdu法检测不同浓度Diosgenin在不同时间的干预TM4细胞。

以1.5ˑ105/mL细胞数接种于直径35mL的培养皿中，培养24h后，用含0.4%FCS培养液同步化72h。

加入Brdu液（终浓度为30μg/L），于37ħ孵育40min，弃培养液，用PBS洗涤3次，用甲醇及醋酸固定10min，使玻片在室温下干燥，0.3%
H
2O
2
－甲醇灭活内源性氧化酶30min。

采用兔血清
封闭20min，甲酰胺100ħ时变性核酸5min；冰浴冷却，用PBS洗涤3次，加抗小鼠Brdu单抗（浓度1：50），空白对照加等量PBS液。

按ABC法检测细胞总数及Brdu阳性的细胞数，计算相关标记指数（LI）并做好记录绘制柱状图。

1.6.3Brdu法检测TM4细胞中加入
2.5μM Dios-genin15min后，再加入1nM ICI或5nM PP2，处理15min，TM4细胞的增殖。

1.6.4Western Blot法检测
2.5μM Diosgenin和ICI 或PP2对TM4细胞质膜和细胞核中ESＲ1和ESＲ2蛋白表达的影响。

参照常规蛋白提取及核蛋白抽提试剂盒，收集细胞（1ˑ106/mL），加入细胞裂解液后用超声仪充分裂解细胞，收集TM4细胞质膜与核蛋白样品，蛋白浓度由BCA法检测。

制备好的蛋白样品以50μg 蛋白泳道上样，经SDS－PAGE电泳后，电转移至NC 膜，分别加入兔抗鼠ESＲ1和ESＲ2（1ʒ500）、β－actin （1ʒ400）一抗，4ħ封闭过夜，TBST洗涤10minˑ3次，加入山羊抗兔荧光二抗（1ʒ10000），室温下暗盒中孵育1h，由红外激光扫描系统扫描成像，图像采用Quantity One（Bio－Ｒad）软件比较目的条带吸光度值（λ值）。

1.7统计方法
应用SPSS17.0统计软件进行统计分析，所有实验数据均以均数ʃ标准差（珋
xʃs）表示，采用t检验进行组间比较，P＜0.05表示有统计学差异；P＜0.01表示有显著性差异。

2结果
2.1不同浓度Diosgenin对TM4细胞增殖的影响
倒置荧光显微镜下，各组TM4细胞呈上皮样贴壁生长良好，形态呈梭形或多角形，胞核明显（见图1）；与空白对照组相比，不同浓度Diosgenin干预后，TM4细胞均有一定程度的增殖，2.5μM Diosgenin尤为显著（见插页Ⅶ图1－B 图1－F）。

Brdu法检测结果表明，与空白对照组相比，0.5μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM、2.5μM、5.0μM的Di-osgenin均可使TM4细胞明显增殖（P＜0.05），尤以2.5μM最为显著（见图2－A）；2.5μM Diosgenin干预TM4细胞6 48h，随干预时间延长，细胞增殖具有不同程度的增加，24h时达最大值（P＜0.05）（见图2－B）。

与阳性对照组（Diosgenin）相比，加入ICI或PP2时，Diosgenin促进TM4细胞增殖的作用受到了明显的抑制（P＜0.05），见图3。

2.2 2.5μM Diosgenin对TM4细胞核质膜中ESＲ1和ESＲ2蛋白表达的影响
与空白对照组相比，2.5μM Diosgenin干预TM4细胞0min，5min，15min，30min时，细胞质膜上ESＲ1与ESＲ2的蛋白表达显著提高（P＜0.05），15min时达到最高（P＜0.05），见图4－A；而细胞核上ESＲ1与ESＲ2的蛋白表达显著降低（P＜0.05），15min时达到最低（P＜0.05），见图4－B。

与空白对照组相比，Diosgenin组TM4细胞膜上ESＲ1和ESＲ2表达水平明显增高；与阳性对照组（Di-osgenin）相比，加入ICI或PP2时，ESＲ1、ESＲ2细胞膜表达水平受到了明显抑制（P＜0.05），见图5－A；而在PP2存在时，细胞核上ESＲ1、ESＲ2的核表达较阳性对照组显著升高（P＜0.05），见图5－B。

3讨论
近年来，随着精子数量和质量呈现下降趋势，男性不育患者人数逐年增加，已经成为影响人类发展和健康的全球性医学及社会问题，故研究药物对精子数量和质量的影响，受到了国内外的广泛重视。

Diosgenin
对由D－半乳糖引起的Wistar雄性大鼠精子活力下降具有改善作用［4］，但对睾丸支持细胞作用，未见报道。

注：与空白对照组（control）比较，*P＜0.05。

图2不同浓度和不同时间Diosgenin对TM4
增殖的影响
注：与空白对照组（control）比较，*P＜0.05，
与阳性对照组（Diosgenin）比较，#P＜0.05。

图3加入ICI或PP2时，2.5μM Diosgenin对TM4
细胞增殖的影响
注：与空白对照组（control）比较，*P＜0.05，
与阳性对照组（Diosgenin）比较，#P＜0.05。

图4 2.5μM Diosgenin对TM4细胞质膜与核中
ESＲ1与ESＲ2蛋白表达的影响
研究证实［5］，支持细胞存在于人类睾丸生精小管
中，其与精子生成之间存在密切的关系。

支持细胞是
睾丸生精上皮中唯一的非生殖细胞，在精子生成过程
中起营养和免疫保护作用，并为精子的发生提供独特
的环境，一个单一的支持细胞只能支持30 50个生殖
细胞，因此，支持细胞的最终数目在一定程度上影响了
睾丸精子产生，决定了男性生育水平。

所以，我们选择
不同浓度的Diosgenin干预TM4细胞，观察其对支持
细胞增殖的影响。

结果表明，0.5 5.0μM Diosgenin
均可促进TM4细胞增殖，并存在明显的量效关系，在
2.5μM时效果最为显著；同时，2.5μM Diosgenin干
预TM4细胞6 48h后，细胞增殖也有明显变化，存在
时效关系，且在24h时最为显著。

所以，Diosgenin具
有促进TM4细胞体外增殖，且具有一定的时效和量效
关系。

注：与空白对照组（control）比较，*P＜0.05，
与阳性对照组（Diosgenin）比较，#P＜0.05。

图5加入ICI和PP2，2.5μM Diosgenin对TM4细胞质膜
与核中ESＲ1与ESＲ2蛋白表达的影响
睾丸产生的雌激素是精子发生的必需激素，可直
接影响精子发生。

研究显示［6］，雌二醇（Estradiol，E2）
能够提高支持细胞的细胞活力，并促进其增殖，且存在
一定的量效和时效关系。

由于雌激素的生物学效应是
通过其受体ESＲ1与ESＲ2介导的，ESＲ1存在于睾丸
支持细胞、间质细胞和肌样细胞内，而ESＲ2存在于多
种类型生殖细胞内［7］。

ESＲ1和ESＲ2作为核受体位
于支持细胞核中，其转录活性的增加能直接调控细胞
的增殖；E2处理支持细胞后，能够即刻诱导ESＲ1与
ESＲ2在细胞核质膜易位［8］。

我们的研究显示，2.5
μM Diosgenin能够增加质膜上ESＲ1与ESＲ2的蛋白
表达，降低核上ESＲ1与ESＲ2的蛋白表达，其中以15
min最为显著。

ICI是雌激素拮抗剂，具有抑制雌激素
的作用；Src家族的蛋白酪氨酸激酶是一组膜结合蛋
白，在细胞内起着非常重要的作用，它们参与信号传
导，与细胞生长、分化、死亡等过程密切相关［9］，雌激素
可以通过Src起到调控细胞增殖的作用［10］，而酪氨酸
激酶活性抑制剂PP2为Src家族选择性抑制剂。

为了
进一步了解Diosgenin引起TM4细胞增殖的机制，我
们选用了雌激素抑制剂ICI和PP2抑制雌激素，及2.5
μM Diosgenin干预TM4细胞，以探讨其与雌激素的关
系及对Src的作用。

结果显示，在加入ICI或PP2时，
Diosgenin对TM4细胞ESＲ1与ESＲ2细胞膜表达水平受到了显著抑制，而细胞核上ESＲ1与ESＲ2的核表达有所升高。

这一结果表明，Diosgenin具有类雌激素样作用，并且能够即刻和瞬间诱导依赖于Src激活的ESＲ1和ESＲ2从核质膜易位。

总之，我们研究证实Diosgenin具有类雌激素样作用，能够促进睾丸支持细胞的增殖的作用，且存在一定的量效与时效关系，其机制可能与激活依赖于Src诱导的即时和瞬态ESＲ细胞核质膜易位有关。

但ESＲ是通过其信号通路来完成其生物学效应的，因此，我们将研究Diosgenin对ESＲ信号通路的影响，以期进一步揭示Diosgenin的作用机制。

本实验是在第四军医大学预防医学院毒理学教研室完成的，在此特别感谢。

参考文献
［1］何焱，王继双，张鹏，等．薯蓣皂苷元药理作用及其机制研究进展［J］．中草药，2013，44（19）：2759－2765．
［2］Jeganathan Manivannan，Janakiraman Shanthakumar，Pandiyan Aruna-giri，et al．Diosgenin interferes coronary vasoconstriction and inhibits
osteochondrogenic transdifferentiation of aortic VSMC in CＲF rats
收稿日期：2015－12－21
基金项目：国家自然科学基金（81160491）
作者简介：张帆（1960－），女，贵州贵阳人，主任医师，硕士研究生导师，研究方向：中西医结合治疗妇女生殖内分泌相关疾病。

通讯作者：易华娅（1989－），女，贵州人，硕士生，研究方向：中西医结合治疗妇女生殖内分泌相关疾病，E－mail：847356542@qq．
com。

［J］．Biochimie，2014，102：183－187．
［3］Monika Singh AA．Hamid，Anil K，et al．Synthesis of diosgenin ana-logues as potential anti－inflammatory agents［J］．Journal of Steroid
Biochemistry And Molecular Biology，2014，143：323－333．
［4］Maria A Tikhonova，Ching－Han Yu，Nataliya G，et al．Comparison of behavioral and biochemical deficits in rats with hereditary defined or
D－galactose－induced accelerated senescence：Evaluating the pro-tective effects of diosgenin［J］．Pharmacology，Biochemistry and Be-havior，2014，120：7－16．
［5］Lucas TF，Nascimento AＲ，PisolatoＲ，et al．Ｒeceptors and signaling pathways involved in proliferation and differentiation of Sertoli cells ［J］．Spermatogenesis，2014，4：e28138．
［6］Thaís FG．Lucas，Maria Fatima M Lazari，Catarina S Porto．Differential role of the estrogen receptors ESＲ1and ESＲ2on the regulation of
proteins involved with proliferation and differentiation of Sertoli cells
from15－day－old rats［J］．Mol Cell Endocrinol，2014，382：84－
96．
［7］Brahim Arkoun，Camille Gautier，Christelle Delalande，et al．Stallion spermatozoa：Putative target of estrogens；presence of the estrogen re-ceptors ESＲ1，ESＲ2and identification of the estrogen－membrane re-ceptor GPEＲ［J］．Gen Comp Endocrinol，2014，200：35－43．
［8］Carreau S，Bouraima－Lelong H，Delalande C．Estrogen，a female hor-mone involved in spermato－genesis［J］．Advances in Medical Sci-ences，2012，57（1）：31－36．
［9］HT Wana，Dolores D Mruka，Elizabeth I Tang，et al．Ｒole of non－re-ceptor protein tyrosine kinases in spermatid transport during spermato-genesis［J］．Semin Cell Dev Biol，2014，30：65－74．
［10］Lucas TF，Siu EＲ，Esteves CA，et al．17beta－estradiol induces the translocation of the estrogen receptors ESＲ1and ESＲ2to the cell
membrane，MAPK3/1phosphorylation and proliferation of cultured
immature rat Sertoli cells［J］．BiolＲeprod，2008，78（1）：101－114．DOIʒ10．13192/j．issn．1000-1719．2016．05．060
补肾温阳祛风散寒法对肾阳虚型围绝经期
模型大鼠EＲ、VEGF、HSP70作用的研究
张帆1，易华娅2，齐帅英2，武创新2，方丽2，杨玉涛1
（1.贵阳中医学院第二附属医院，贵州贵阳550002；2.贵阳中医学院，贵州贵阳550002）
摘要：目的：探讨补肾温阳祛风散寒法对肾阳虚型围绝经期模型大鼠EＲ、VEGF、HSP70的影响及作用机制。

方法：选用自然老化的围绝经期雌性SD大鼠，肌注氢化可的松构建肾阳虚型围绝经期大鼠模型，将模型大鼠随机分为更年汤组、教材方组、替勃龙组、生理盐水组；另选青年组、老年组SD雌性大鼠作为对照组。

各组给予相应药物治疗15d，于第16天处死大鼠，分离摘取双侧子宫，称重了解子宫湿重及子宫指数，采用病理切片观察大鼠子宫形态学变化，免疫组化及原位杂交检测方法观察大鼠子宫雌激素受体（EＲ）、血管内皮生长因子（VEGF）、热休克蛋白70（HSP70）及信使mＲ-NA（EＲmＲNA、VEGFmＲNA、HSP70mＲNA）的阳性表达情况。

结果：①更年汤组、教材方组、替勃龙组能明显增加子宫湿重、子宫指数，有统计学意义（P＜0.05），更年汤组与替勃龙组、教材方组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；②更年汤组、教材方组、替勃龙组能抑制子宫萎缩，有显著性差异（P＜0.01），更年汤组与替勃龙组比较无统计学意义（P＞0.05）；
③更年汤组、教材方组、替勃龙组能增加EＲ、EＲmＲNA、VEGF、VEGFmＲNA阳性表达，有统计学意义（P＜0.05），但教材方组的上调低于更年汤组及替勃龙组（P＜0.05），替勃龙组与更年汤组之间比较无显著差异（P＞0.05）；④更年汤组、替勃龙组能增加HSP70及HSP70mＲNA阳性表达，有统计学意义（P＜0.05），更年汤组与替勃龙组比较无显著性差异（P＞0.05）。

结论：自拟更年汤可能通过上调EＲ、VEGF、HSP70蛋白及基因在子宫中的阳性表达而发挥雌激素样作用，从而达到改善病理状态下的子宫的形态结构及功能的目的。

关键词：补肾温阳祛风散寒法；雌激素受体；血管内皮生长因子；热休克蛋白70
中图分类号：Ｒ285．5文献标志码：A文章编号：1000-1719（2016）05-1075-05。