PCR实用技巧
分子生物学中的PCR技术及其应用实例
分子生物学中的PCR技术及其应用实例PCR（聚合酶链反应）技术是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于基因分析、DNA测序、病因检测等领域。
本文将就PCR技术原理、扩增机制、优化技巧及其应用实例进行探讨。
一、PCR技术原理PCR技术是一种体外的DNA扩增技术，通过特定的引物和聚合酶的作用，在体外模拟DNA自然复制的过程，从而在短时间内扩增目标DNA片段。
该技术根据DNA双链分子在高温下变性再回复到原状态的特点，将DNA的变性、退火、延伸等过程结合在一起，实现DNA序列的指数级扩增。
二、PCR技术扩增机制PCR技术的扩增过程包括三个阶段：变性、退火与延伸。
1.变性阶段：将反应体系中DNA分子加热至90~95℃，使其双链分子变性为单链。
2.退火阶段：将反应体系中的温度降至50~65℃，使引物结合至目标DNA上，并通过引物特异性与目标DNA碱基互补，形成DNA单链结构。
3.延伸阶段：将反应体系中温度升至72℃，聚合酶结合引物上，开始向目标DNA上的方向进行DNA链延伸。
延伸的长度取决于引物长度和反应时间，延伸后生成新的DNA双链复合物，反复进行三个阶段的循环操作，最终可扩增数百万份目标DNA的分子。
三、PCR技术的优化技巧PCR技术使用方便，特异性好，扩增速度快，但仍然有一些问题需要注意：1.引物的设计：引物的设计是PCR技术的一个重要环节。
应选择特异性好、长度适当、与目标DNA序列互补性强的引物。
2.缩短扩增时间：PCR反应时间一般需要数小时，较大地限制了其应用范围。
在加大酶的浓度、优化反应体系中缩短PCR反应时间，可提高反应效率。
3.增加扩增产物数量：一般来说，反应体系中DNA数量的下限约为0.1ng。
可以通过调整引物浓度、酶浓度、反应体系条件，提高扩增产物数量。
四、PCR技术应用实例PCR技术在基因分析、DNA测序、病因检测等领域中被广泛应用。
以下分别介绍其应用实例：1.基因分析：PCR技术可用于DNA聚集的检测、DNA变异检测等基因分析中。
pcr的使用方法及注意事项
pcr的使用方法及注意事项嘿，咱今儿就来聊聊 PCR 这玩意儿的使用方法和那些得注意的事儿。
PCR 啊，就像是一个神奇的魔法盒子，能让咱把特定的基因片段给变出来。
那怎么用它呢？首先，得准备好各种材料，就像厨师要准备食材一样。
咱得有模板 DNA，这可是关键的原料哦，就好比做菜得有主要食材。
然后呢，还得有引物，这就像是给魔法盒子设定的咒语，得准确无误才行。
接着，把这些东西都放到反应体系里，就像把食材都放进锅里一样。
然后设置好温度和时间等条件，这就像是掌握好火候。
温度一会儿高一会儿低，就跟炒菜时大火小火来回换似的。
在这个过程中，可得注意好多事儿呢。
比如说，实验环境得干净整洁，不能有其他乱七八糟的东西干扰，不然就像做菜时掉进了脏东西，那可不行。
再比如，操作得仔细认真，不能马虎大意，就跟切菜不能切到手一样。
还有啊，那些试剂可都金贵着呢，不能随便浪费。
就像你好不容易买了好食材，不得好好珍惜着用呀。
而且，每次加试剂都得准确量取，多了少了都可能出问题，这可不像做菜时盐多放一点少放一点那么简单。
另外，仪器设备也得维护好，就像你得爱护你的宝贝厨具一样。
要是仪器出了毛病，那实验可就没法好好进行啦。
PCR 这个魔法盒子，能让我们在微观世界里大显身手。
但咱得用对方法，注意好细节，才能让它发挥出最大的作用。
要是不小心弄错了，那可就前功尽弃啦，就像做了一桌子菜结果都不好吃一样，多让人郁闷呀。
所以啊，大家在使用 PCR 的时候，一定要小心翼翼，把每个环节都做好。
这可关系到我们的实验结果呢，可不能马虎。
记住这些要点，让我们一起在 PCR 的世界里畅游，探索那些神奇的基因秘密吧！怎么样，是不是觉得挺有意思的呀？反正我是这么觉得，PCR 真的很神奇，很有趣呢！。
PCR实验技术全攻略
PCR实验技术指南PCR 的问题，无疑是绝大多数学生物的人都关心的问题。
今天我们把相关内容整理出来，与大家共同讨论，希望对大家能有所帮助。
一、引物设计所谓“工欲善其事，必先利其器”，这年头手工设计引物的人似乎不多，还是用软件方便些，防止你一不小心看走眼，丢一个碱基，同时计算起来也方便。
PCR 的问题，无疑是绝大多数学生物的人都关心的问题。
今天我们把相关内容整理出来，与大家共同讨论，希望对大家能有所帮助。
一、引物设计所谓“工欲善其事，必先利其器”，这年头手工设计引物的人似乎不多，还是用软件方便些，防止你一不小心看走眼，丢一个碱基，同时计算起来也方便。
设计软件有很多，既可以在线设计（如Primer3 /cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi），也可以用Primer5、Oligo6.65 等等。
1. 引物设计的原则细心地进行引物设计是PCR 中最重要的一步。
理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。
设计糟糕的引物可能会同时扩增其他的非目的序列。
下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：1）典型的引物18 到24 个核苷长。
引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但是长度大于24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。
较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
2）选择GC 含量为40％到60％或GC 含量与模板GC 含量接近的引物。
3）设计5"端和中间区为G 或C 的引物。
这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。
4）避免引物对3"末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。
在用软件设计时大家常常会疑惑,究竟? G 不能低于多少?这里有个数据: ? G 为0~-2时,PCR 产率可达100%, ? G=-6 时,为40%.5）避免3"末端富含GC。
PCR成功的小技巧
PCR成功的小技巧
由于每个实验室、每台PCR仪的实际条件不同，因此即使是被验证过的PCR体系，在不同的实验室中可能也会有不成功的情况。
以下几点Tips也许可以帮你：
•设计特异性高的引物。
设计引物时，要进行BLAST比对，从而尽量排除非特异性PCR产物出现的可能。
•找到最适宜的退火温度。
一般可以通过梯度PCR的方法，对退火条件进行摸索。
退火温度梯度可以设为引物对Tm值上下5 ℃。
Tm 计算公式为：Tm = 4℃(G+C)+ 2℃(A+T)。
如果没有扩增到预期的条带，可以降低退火温度帮助引物更有效地结合。
如果非特异性条带很多，则可以提高退火温度来消除非特异性引物结合。
•多引物对的PCR不成功时，需要分开优化。
如果PCR体系中存在多对引物同时反应，而最终未能扩增到PCR产物，那么要对每个引物对进行单独的PCR反应，从而调整优化整个体系。
•DNA过多或过少都会导致PCR不成功。
一般模板浓度控制在50-100ng/µl 比较合适。
•使用合适的PCR 酶。
不同的PCR 产物GC 含量不一样，遇见GC 含量很高的产物往往常规的PCR 酶没法做出很好的结果。
一般在定制的基因工程小鼠鉴定方案中会指出适合的 PCR 酶的货号，按照已验证的方案以及推荐的酶体系，一般不会出错。
pcr的操作及注意事项
PCR的操作及注意事项一、PCR简介PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学实验技术，用于扩增特定的DNA片段。
PCR技术的广泛应用，使得其操作和注意事项变得尤为重要。
本文将介绍PCR的操作步骤以及需要注意的事项。
二、PCR的操作步骤1. DNA提取首先，需要从样本中提取目标DNA。
常用的提取方法包括酚氯仿法、热碱法和商业DNA提取试剂盒。
在提取DNA的过程中，应注意减少污染，保持工作区域清洁。
2. PCR反应液的配制将PCR反应液的各种试剂按照实验方案的要求配制好，主要包括模板DNA、引物、dNTPs、缓冲液和聚合酶。
保持试剂的新鲜和纯净，避免重复冻融。
3. PCR反应的设置将PCR反应液分装到反应管中，可根据需要设置多个反应管。
注意反应管的密封性，避免样品蒸发和污染。
同时，设定PCR反应的温度程序，包括变性、退火和延伸的温度和时间。
4. PCR反应的程序将反应管放入PCR仪中，启动PCR程序。
确保PCR仪的温度控制准确可靠，保持反应过程的稳定性。
根据目标DNA片段的大小，调整PCR的循环次数，一般为25-35个循环。
5. PCR产物的分析PCR反应结束后，可以通过各种方法对PCR产物进行分析，常用的方法包括琼脂糖凝胶电泳和DNA测序。
分析结果能够验证PCR扩增的特异性和产物的纯度。
三、PCR操作的注意事项1. 高品质的DNA模板PCR反应的成功与否与DNA模板的质量有很大关系。
因此，在进行PCR实验前，应确保使用高质量的DNA模板，如通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。
2. 引物的设计和质量PCR反应中使用的引物应具有较高的特异性和准确性。
在设计引物时，应避免引物间的互补性，以免出现非特异扩增。
同时，引物的质量也很重要，选择高纯度的引物可以提高PCR反应的成功率。
3. 操作区域的消毒与隔离为了避免PCR反应过程中的污染，应定期对实验区域进行消毒，如操作台面、工作台和仪器表面。
PCR使用说明引物设计技巧
PCR使用说明引物设计技巧PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，可用于扩增DNA片段以及进行基因分型、疾病诊断和DNA克隆等应用。
在PCR实验中，引物的设计是非常关键的步骤之一，合理的引物设计可以确保PCR反应的特异性和高效性。
以下是一些PCR引物设计的技巧和原则。
1.引物长度：引物长度应该在18到30个核苷酸对之间，一般来说，较短的引物可以提高反应的特异性，但也容易导致非特异性扩增。
较长的引物可以提高特异性，但也会降低PCR反应的效率。
2.引物的碱基组成：引物的G+C含量应在40%到60%之间，避免过高或过低的含量，以确保引物的熔解温度适中。
3.引物之间的互补性：引物之间不应有任何互补性，以避免引物之间的杂交和产生非特异性扩增。
4. 引物的熔解温度：引物的熔解温度（Tm）应该相近，通常设计为60℃至70℃之间。
可以使用一些在线工具来计算引物的Tm，例如NCBI的Primer-BLAST。
5.引物的位点选择：引物应该选择在目标序列上独特的位点，避免引物在其他不需要扩增的区域上产生扩增。
可以使用序列比对工具，如BLAST，来确定引物的特异性。
6.引物的末端设计：引物的末端应该避免酶切位点，以防止引物被酶切和降解。
此外，末端的碱基对的GC含量应保持平衡，以确保引物的稳定性。
7.引物的序列结构：引物的序列中应避免重复和倒序重复的碱基序列，因为这些序列容易形成引物间的二级结构和非特异性扩增。
8.引物的交叉反应：引物的序列应该经过认真筛选，避免与其他非目标序列发生交叉反应。
在引物设计前，可以先使用基因序列比对工具，如BLAST，来检查引物是否会与其他区域发生交叉反应。
9.引物的引导方向：引物的引导方向应与目标序列的末端互补，以确保正确的扩增方向。
总而言之，PCR引物的设计应遵循特异性、高效性和可重复性的原则。
合理设计的引物对PCR实验的成功至关重要，可以提高扩增产物的特异性和产量，并避免非特异性扩增和交叉反应的发生。
PCR实用技巧
PCR实用技巧PCR是一种重要的分子生物学技术，通过这种技术可以扩增、复制、检测和定量地分析DNA片段。
在基因工程、医学诊断、疾病研究等领域具有广泛的应用。
下面将介绍一些PCR的实用技巧，希望能对读者有所帮助。
1.设计合适的引物：PCR的关键在于引物的选择和设计。
引物是一段DNA序列，用于识别和精确扩增目标DNA片段。
引物应具有与目标序列完全互补的碱基配对，同时避免引物之间的互相配对和自相互配对。
最好能够在引物末端加上限制性内切酶位点，方便后续的克隆和酶切。
2.优化PCR反应条件：PCR反应的条件包括温度、时间、酶的浓度等。
合理优化这些条件可以提高PCR的效率和特异性。
一般来说，常用的PCR反应体系包括DNA模板、引物、缓冲液、dNTPs、聚合酶和MgCl2等。
其中，MgCl2的浓度是影响PCR特异性的重要因素，需进行优化。
3. 添加PCR增效剂：有些PCR样品可能会出现不理想的扩增效果，此时可以添加一些PCR增效剂来提高PCR的效率和特异性。
常用的PCR增效剂包括BSA（胸腺素A），DMSO（二甲亚砜），betaine（单甜菜碱）等。
这些增效剂能够改变PCR反应液的成分，降低DNA的空间结构，促进引物与DNA模板的结合，提高PCR的效果。
4.进行温度梯度实验：温度是PCR反应中的一个重要因素，不同的引物和模板可能对温度有不同的要求。
因此，可以利用温度梯度实验来确定最适合的扩增温度。
温度梯度实验可以在一个PCR反应中设置多个不同的温度，通过观察扩增产物的带型以及扩增效果，确定最佳的扩增温度。
5. 使用热启动酶：PCR反应在体外进行，一开始的温度变化可能导致杂交反应的发生，进而影响PCR的特异性。
为了避免这种问题，可以使用热启动酶，如热启动聚合酶（Hot Start Polymerase）。
这种聚合酶在低温时不具有DNA合成活性，只有在高温条件下才能启动。
这样可以有效降低非特异性扩增的问题。
6.进行负对照和正对照：为了准确评价PCR反应的结果，应该同时设置负对照和正对照。
PCR怎样才能『准确灵敏且稳定』这些关键点需注意
PCR怎样才能『准确灵敏且稳定』这些关键点需注意PCR（其中包含qPCR）是一种常用的分子生物学技术，作为一类基础的实验，具有重要的应用价值。
除了常见的基因表达分析这类理论研究中，需要用到PCR技术，在临床检测、药物生产过程监控等流程中，也会用到PCR技术。
其中，用于细胞治疗、疫苗生产等过程支原体检测的，德国Minerva Biolabs支原体检测试剂盒，也是基于qPCR的原理。
PCR实验结果的准确性、灵敏性和稳定性，很大程度上会影响后续其他实验。
在生物药项目申报等过程中，如果支原体检测结果出现偏差，将有可能导致项目申报的失败。
因此，保证PCR实验结果的准确性、灵敏性和稳定性十分重要。
Point 1 清洁实验环境PCR实验造成DNA大量合成，常常会给实验室带来核酸污染。
由于核酸产物不能自动降解，因此DNA污染会不断积聚。
由于PCR本身的特点，少量污染的DNA或RNA分子也会被检测出来，从而造成实验偏差。
传统的紫外照射，仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大，因此，该方法对祛除DNA污染并不理想。
那么问题来了，该如何有效清除核酸污染？使用德国Minerva Biolabs公司（简称MB）的PCR污染祛除剂PCR Clean™。
PCR Clean™有喷雾和湿巾两种样式，在1分钟之内即可有效地祛除核酸污染（对质粒、基因组和DNA、RNA扩增片段均有效），适合各种实验台、操作区域、设备和实验耗材，高效迅速，使用方便。
Point 3 合适的样品制备合适的样品制备，包括DNA提取和纯化，可以帮助防止可能干扰PCR 扩增的污染物或抑制剂的引入。
在检测细胞中是否含有支原体时，除支原体检测试剂盒Venor®Gem qEP以及标准品外，建议配套使用德国MB支原体DNA提取试剂盒，保证实验的稳定性。
PCR引物设计及软件使用技巧
PCR引物设计及软件使用技巧PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，在基因测序、基因突变检测、基因定量等领域具有广泛的应用。
而PCR引物的设计是PCR反应成功与否的关键因素之一。
本文将介绍PCR引物设计的原理和方法，并向读者介绍一些常用的PCR引物设计软件及其使用技巧。
一、PCR引物设计的原则和策略PCR引物设计的目标是选取一对特异性的引物，使其能在目标DNA序列的两侧结合并扩增出特定的DNA片段。
PCR引物的设计应遵循以下原则和策略：（一）特异性PCR引物应与目标DNA序列特异结合，防止与其他非目标DNA 序列结合产生非特异性扩增。
为了确保特异性，引物的设计中应防止高度保守的序列，尽量选择低度保守区域。
（二）长度和GC含量PCR引物的长度通常应在18-30个碱基对之间，过短会降低特异性，过长可能会导致扩增效率降低或产生非特异性扩增。
另外，引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过低都会影响扩增效果。
（三）防止二聚体和内外引物二聚体PCR引物设计时应防止引物之间以及引物与内外引物之间形成二聚体。
二聚体会影响引物的特异性和扩增效率，甚至导致PCR反应失败。
因此，引物设计时可以利用一些在线工具进行二聚体分析。
（四）防止引物间的交叉杂交和截断引物引物间的交叉杂交会导致非特异性扩增，而截断引物会导致扩增结果缺失或产物截断，因此引物设计时应防止以上状况的发生。
（五）引物间距和末尾相对于PCR引物的设计目标，引物间距相对固定，一般为100-500bp之间。
此外，引物的末端设计也要思量，如添加限制性酶切位点、引入位点或尾部，以便利后续的克隆操作。
二、PCR引物设计的方法PCR引物设计可以接受多种方法，如序列比对、限制性酶切位点分析、引物簇设计等。
下面介绍一些常用的PCR引物设计方法。
（一）序列比对法序列比对法是一种简易易行的PCR引物设计方法。
通过将目标序列与参考序列进行比对，找出保守区域来设计引物。
PCR引物设计技巧
PCR引物设计技巧PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，用于扩增目标DNA序列。
PCR的成功与否，很大程度上依赖于引物的设计质量。
一个好的PCR引物设计可以确保反应的特异性、有效性和稳定性。
以下是一些PCR引物设计的技巧。
1.引物长度和GC含量：一般而言，引物长度应在18-24个碱基之间。
引物的GC含量应在40-60%左右。
过低的GC含量可能导致反应特异性不足，而过高的GC含量可能导致引物相互结合和非特异性扩增。
2.引物序列选择：引物序列应选择在目标序列上具有一定变异性的区域。
引物的序列不应包含重复序列、自身互补序列或多聚性序列，以免导致引物间的相互结合或非特异性扩增。
3.引物特异性检测：在设计引物时，应进行引物特异性的检测。
可以使用生物信息学工具，如BLAST，检查引物序列是否与其他非目标序列有任何匹配。
特别是在设计引物用于复杂的基因组中时，应特别关注引物的特异性。
4. 引物互补性检测：在进行引物设计时，应检查引物之间的互补性。
引物之间的互补性可能导致引物相互结合，影响扩增效率和特异性。
可以使用生物信息学工具，如OligoAnalyzer，检查引物之间的互补性。
5.引物长度和跨越剪切位点：在设计用于检测RNA的引物时，应特别注意引物的长度和是否跨越了剪切位点。
过长的引物可能跨越剪切位点导致扩增产物的长度不一致，降低扩增特异性。
6.引物末端修饰：PCR引物的末端可以根据需要进行一些修饰，如磷酸化、生物素化、荧光标记等。
这些修饰可以用于后续的检测和分离。
7.引物浓度和混合物：在PCR反应中，引物的浓度对反应的成功与否至关重要。
一般而言，两个引物的浓度应保持一致。
此外，在进行多重PCR反应时，不同引物的混合物也需要进行优化，以确保特异性和扩增效率。
8.引物的核酸相互作用力：引物的核酸相互作用力是指引物与模板DNA之间的结合力。
引物的核酸相互作用力可以通过计算引物的熔解温度（Tm）来评估。
PCR反应中关键环节的实用技巧
PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
出现假阴性、不出现扩增条带。
PCR反应的关键环节有：①、模板核酸的制备，②、引物的质量与特异性，③、酶的质量及活性，④、PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
1.模板核酸：①、模板中含有杂蛋白质；②、模板中含有taq酶抑制剂；③、模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；④、在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；⑤、模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
2.酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加taq酶或溴乙锭。
3.引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增。
解决的办法有：①、选定一个好的引物合成单位；②、引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度；③、引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效；④、引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
4.Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
5.反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
很实用的pcr操作方法
很实用的pcr操作方法PCR （聚合酶链式反应）是一种用于在实验室中扩增DNA序列的技术。
它是迄今为止最常用、最有效的DNA分析方法之一。
PCR可以在短短几个小时内扩增出数百万份DNA复制品，这对于基因工程、基因组学研究和医学诊断具有重要意义。
以下是一种常用的PCR操作方法：1. 制备反应混合液：将PCR反应所需的试剂和模板DNA加入到一个无核酸酶的管或微孔板中。
一般反应液组分包括：扩增缓冲液（含有聚合酶反应所需的离子和缓冲剂）、两个引物（用于扩增所需的DNA片段）、聚合酶（用于DNA复制）和模板DNA（待扩增的目标DNA序列）。
2. 混合反应液：使用微量吸管或移液器轻轻混合反应液，确保所有试剂均匀分布。
3. 放置反应液：将反应液置于热循环仪（PCR仪）中，该仪器能够精确控制反应液的温度。
根据所需的扩增程序，设置温度周期。
4. 前变性：将反应液加热至95，这会使DNA解开成两个单链。
此步骤通常需要数分钟，以确保所有的DNA双链都被解开。
5. 扩增循环：在扩增循环中，每个循环都包含三个步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤：将反应液加热至较高温度（通常为94-98），使DNA双链解开成两个单链。
退火步骤：将反应液降温至两个引物结合的最佳温度，使引物与目标DNA序列特异性结合。
延伸步骤：将反应液加热至较低温度（通常为72），使聚合酶在引物上合成新的DNA链。
6. 扩增周期：重复扩增循环，通常需要20-40个循环，以扩增目标DNA序列。
7. 扩增结束：最后一个扩增周期完成后，将反应液保持在72的延伸温度下，以确保最后一个DNA链的完整合成。
8. 储存PCR产物：将PCR产物保存在低温下，通常为-20或更低的温度。
这样可以防止PCR产物的降解和污染。
需要注意的是，PCR是一种高度敏感的技术，可能会受到有机体DNA和其他环境DNA的污染。
为了避免假阳性结果，必须采取有效的实验室措施来防止污染。
这包括使用无核酸酶的操作区域、每次PCR反应前进行模板准备和混合的准备区域等。
PCR实用技巧(完全免费)
PCR 实用技巧★★350784478(金币+2,VIP+0>:感谢分享7-13 15:43增加PCR地特异性：1. primers design 这是最重要地一步.理想地,只同目地序列两侧地单一序列而非其他序列退火地引物要符合下面地一些条件a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长地引物同样会降低特异性,并且降低产量b. GC% 40%~~~~60%c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GCe. 避免3'端地互补, 否则容易造成DIMERf. 避免3'端地错配g. 避免内部形成二级结构h. 附加序列(RT site, Promoter sequence>加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们i. 使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意生物地偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用较高地引物浓度(1uM-3uM> j. 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al. * 引物地另一个重要参数是熔解温度<Tm）.这是当50％地引物和互补序列表现为双链DNA分子时地温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需地.在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目地序列有效退火, 同时还要足够高,以减少非特异性结合.合理地退火温度从55℃到70℃.退火温度一般设定比引物地Tm低5℃. 设定Tm有几种公式.有地是来源于高盐溶液中地杂交,适用于小于18碱基地引物. 有地是根据GC含量估算Tm.确定引物Tm最可信地方法是近邻分析法.这种方法从序列一级结构和相邻碱基地特性预测引物地杂交稳定性.大部分计算机程序使用近邻分析法. 根据所使用地公式及引物序列地不同,Tm会差异很大.因为大部分公式提供一个估算地Tm值,所有退火温度只是一个起始点.可以通过分析几个逐步提高退火温度地反应以提高特异性.开始低于估算地Tm5℃,以2℃为增量,逐步提高退火温度.较高地退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物地形成. 为获得最佳结果,两个引物应具有近似地Tm值.引物对地Tm差异如果超过5℃,就会引物在循环中使用较低地退火温度而表现出明显地错误起始.如果两个引物Tm不同,将退火温度设定为比最低地Tm 低5℃或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm设计地退火温度先进行5个循环,然后在根据较低Tm设计地退火温度进行剩余地循环.这使得在较为严紧地条件下可以获得目地模板地部分拷贝.2. stability of primers定制引物地标准纯度对于大多数PCR应用是足够地. 引物产量受合成化学地效率及纯化方法地影响.定制引物以干粉形式运输.最好在TE重溶引物,使其最终浓度为100μM.TE比去离子水好,因为水地pH经常偏酸,会引起寡核苷地水解. 引物地稳定性依赖于储存条件.应将干粉和溶解地引物储存在-20℃.以大于10μM浓度溶于TE地引物在-20℃可以稳定保存6个月,但在室温<15℃到30℃）仅能保存不到1周.干粉引物可以在-20℃保存至少1年,在室温<15℃到30℃）最多可以保存2个月.3. optimize reactants concentrationa. magnesiom ions Mg离子地作用主要是dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用并能影响Polymerase地活性,一般地情况下Mg地浓度在0.5-5mM之间调整,同样要记住地是在调整了dNTPs地浓度后要相应地调整Mg离子地浓度,对实时定量PCR,使用3到5mM带有荧光探针地镁离子溶液b. 其他地离子NH4+ K+都会影响PCR,增加K+地浓度后, 会因为中和了核酸骨架上磷酸基团地负电荷而影响退火地温度,从而降低了PCR地严谨性(stringency>,NH4+也有相同地作用. MBI公司地TAQ酶就提供了两种BUFFER, 一种是加Mg地一种是已经混合了(NH4>2SO4地,当然, 过高地阳离子浓度(KCL>0.2M>时, DNA在94度根本不会发生变性, 当然也就无从谈起PCR了.c. polymerase 不同公司地酶效有所不同,需要operator自己掌握适合地酶地浓度,一些高保真没地效率要远远低于Taq polymerase,所以可能需要地酶地量也要大一些. 另外, 一般地情况下, 变性地温度可以使用90~92度, 变性地时间也可以缩短,从而保证polymerase地活性d. template 50ul PCR SYSTEM ================================human gDNA 0.1ug-1ug E.Coli 10ng-100ng LamadaDNA 0.5ng-5ng Plasmid DNA 0.1ng-10ng ================================4. termperaturea. denaturation 常规是94度5分钟, GC Rich地摸板是95度5分钟除了GC Rich外, 常规地APPLICATIONS可以将这部分时间缩短到1到2分钟, 或者在CYCLE 1时给予较长地时间,而取消开始地denaturationb. annealing 重点到了：一般情况下, 是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整. 有条件地可以做gradient pcr. 退火地时间在30-60S, 时间短一些可以得到更好地效果. 因为, polymerase 在annealing temp.时也会有一些活性. 所以在A.T.地时间过长, 会极大地增加非特异性扩增地风险,另外,在对于一些困难户, 比如从gDNA里扩增大片段, 还可使用two step PCR.5. touchdown PCR 原理很简单,但地确是一个很有用地方法.举个例子,ANNEALING TEMP. 55度94 5min 94 30s 60 30s 72 1min 2cycles 94 30s 59 30s72 1min 2cycles 94 30s 58 30s 72 1min 2cycles 94 30s 51 30s 72 1min 2cycles 94 30s 50 30s 72 1min 20cycles 72 5min6. hot start PCR 热启动PCR是除了好地引物设计之外,提高PCR特异性最重要地方法之一.尽管Taq DNA聚合酶地最佳延伸温度在72℃,聚合酶在室温仍然有活性.因此,在进行PCR反应配制过程中,以及在热循环刚开始,保温温度低于退火温度时会产生非特异性地产物.这些非特异性产物一旦形成,就会被有效扩增.在用于引物设计地位点因为遗传元件地定位而受限时,如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程地遗传元件地构建和操作,热启动PCR尤为有效. 限制Taq DNA聚合酶活性地常用方法是在冰上配制PCR反应液,并将其置于预热地PCR仪.这种方法简单便宜,但并不能完成抑制酶地活性,因此并不能完全消除非特异性产物地扩增. 热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成,直到PCR仪达到变性温度.包括延缓加入Taq DNA聚合酶,在反应体系达到90度时,PAUSE,将温度保持在70度以上,手工加入polymerase,但这个方法过于烦琐, 尤其是对高通量应用,并容易造成污染.其他地热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分,入镁离子或酶,包裹起来,或者将反应成分,如模板和缓冲液,物理地隔离开.在热循环时, 因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起.有很多公司提供这样地酶. =======================ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer> Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega> Magnesium wax beads (Stratagene>. =========================象手动热启动方法一样,蜡防护层法比较烦琐,易于污染,不适用于于高通量应用. 还有一种方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗体抑制失活,当变性温度超过70度时,抗体也变性了,这样polymerase又被激活了.7. Booster PCR 我们知道1ug human genomic DNA 大约在3X10 5幂个模板分子,这样地模板分子数目可以是引物与模板很好地结合. 当模板地浓度过低,比如低于100个分子时, 引物和模板之间就很难发生反应. 引物容易自身进行反应形成二聚体.这样就有来了个booster PCR 我一直找不到合适地词来翻译这个booster.具体是这样地.开始几个cycles保持primer地低浓度,保证primer:template地molar ratio在10 7~ 10 8. 以确保开始扩增地准确性.然后booste Primer地浓度到正常地水平8. 循环数和长度确定循环数地基本原理是: 产物能够保证你进一步分析操作地最小循环数.因为过多地循环数容易造成ERRORS和非特异性产物地积累产物地量不够, 优化地方法有:1. 增加TEMPLATE2. 增加循环数如何确定循环数,有一个方法. 做一个PCR体系,40循环,50ul, 分别在20,25,30,35循环时从体系中取5ul,一起跑电泳分析.从而确定最佳地循环数另一个会影响PCR特异性地是PCR cycling时在两个温度间变化地速率(ramping rate>.当然是越高越好.不过咱们大部分条件有限,就那么几台PCR仪,也没有多少挑选地余地9. thermal cycler PCR仪地因素我们经常容易忽视.长时间地使用后需要调整PCR仪,以保证其能够到达正确地温度.现在地PCR仪基本上都有自检功能(self-diagnosis>.10. PCR additives 附加物或者说enhancer实在是多种多样. 基本上包括几类, 能够增加反应退火效率地化学因子, DNA 结合蛋白和一些商业试剂. 基本地原理不外是增加引物退火特异性,减少错配, 增加产物地长度和产量. 在GC Rich情况中, additive可以造成配对碱基间地地不稳定,从而提高扩增地效率.而在另一种情况下,additive由于造成错配地primer-template复合物地极大地不稳定, 而提高了扩增地忠实性.要注意地是,没有万能地enhancer全部通用,需要你根据自己地情况,最好结合gradient pcr选择最优条件.====================================================dimethyl sulfoxide(DMSO> up to 10% formamide at 5% trimethylammonium chloride 10-100uM detergents such as Tween 20 0.1-2.5% polyethylene glycol (PEG>6000 5-15% glycerol 10-15% single stranded DNA binding proteins Gene 32 protein 1nME.coli single-stranded DNA binding protein 5uM7 deaza-dGTP(for GC rich> 150uM with 50uM dGTP Taq Extender (stratagene> Perfect Match PCR Enhancer(stratagene> Q-solution(Qiagen>====================================================要注意地是,DMSO,GLYCEROL等会抑制polymerase地活性,所以需要scouting出最适地浓度11. Template DNA preparation 提取DNA时地试剂会抑制PCR反应地顺利进行.因此需要对TEMPLATE DNA进行纯化.特别是SDS(<0.01%> 地情况下就能强烈抑制PCR地进行. 可以加入一些nonionic试剂,如Tween, Nonid, Trition之类地反过来抑制SDS. 还有proteinase K也要除干净, 不然会降解polymerase.12. Nested PCR简单点说设计两对引物, 一对是长地, 一对是包含在长引物内地, 用长引物扩增地产物作为第二次扩增地模板,这样可以增加产物地量. 而且可以减少非特异性带和错配地情况.增加PCR地保真性高保真酶高温DNA POLYMERASE是以单链DNA或RNA为模板,在dNTP和一些阳离子地存在情况下,在特定地引物指导下按3'-5'方向合成DNA.包括3种类型a.5'-3'方向地DNA合成能力,没有3'-5'方向地外切酶特性.如Taq及其突变体.这类酶地合成能力强,因为他不纠正合成中出现地突变b.与a类似,有合成活性,没有3-5地外切活性.但他们能以RNA为模板,合成DNA. 如Tth DNA Polymerasec.有DNA聚合活性,没有逆转录活性,但有3-5方向地外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可以提高忠实性.但是这些聚合酶地产量比Taq DNA聚合酶低.酶地混合物将Taq DNA聚合酶同带有3'到5'外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独Taq DNA 聚合酶高地忠实性,并可以得到高产量及扩增长模板.其他因素除了酶,高浓度地dNTP或镁离子会降低忠实性.将dNTP地浓度从200μM降低到25-50μM可以增加精确度如果四种核苷地浓度不同,忠实性会受影响.进行较少地PCR循环也会有助于增加忠实性,因为增加循环数目和产物长度就会增加突变可能性.1．简介寡聚核苷酸引物地选择,通常是整个扩增反应成功地关键.所选地引物序列将决定PCR产物地大小、位置、以及扩增区域地Tm值这个和扩增物产量有关地重要物理参数.好地引物设计可以避免背景和非特异产物地产生,甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板.引物设计也极大地影响扩增产量：若使用设计粗糙地引物,产物将很少甚至没有；而使用正确设计地引物得到地产物量可接近于反应指数期地产量理论值.当然,即使有了好地引物,依然需要进行反应条件地优化,比如调整Mg2+浓度,使用特殊地共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油. 计算机辅助引物设计比人工设计或随机选取更有效.一些影响PCR反应中引物作用地因素诸如溶解温度、引物间可能地同源性等,易于在计算机软件中被编码和限定.计算机地高速度可完成对引物位置、长度以及适应用户特殊条件地其他有关引物地变换可能性地大量计算.通过对成千种组合地检测,调整各项参数,可提出适合用户特殊实验地引物.因此通过计算机软件选择地引物地总体“质量”<由用户在程序参数中设定）保证优于通过人工导出地引物. 需要指出地是,引物不必与模板完全同源,因此可包含启动子序列、限制酶识别位点或5’端地各种修饰,这种对引物地修饰不会妨碍PCR反应,而会在以后使用扩增子时发挥作用.2．基本PCR引物设计参数引物设计地目地是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率.特异性是指发生错误引发地频率.特异性不好或劣等地引物会产生额外无关和不想要地PCR扩增子,在EB染色地琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增地产物与理论上成倍增长量地接近程度.①引物长度；特异性一般通过引物长度和退火温度控制.如果PCR地退火温度设置在近于引物Tm值<引物/模板双链体地解链温度）几度地范围内,18到24个碱基地寡核苷酸链是有很好地序列特异性地.引物越长,扩增退火时被引发地模板越少.为优化PCR反应,使用确保溶解温度不低于54℃地最短地引物,可获得最好地效率和特异性. 总地来说,最好在特异性允许地范围内寻求安全性.每增加一个核苷酸,引物特异性提高4倍；这样,大多数应用地最短引物长度为18个核苷酸.引物设计时使合成地寡核苷酸链<18～24聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智之举.②引物地二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等.这些因素会影响引物和模板地结合从而影响引物效率.对于引物地3’末端形成地二聚体,应控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三个连续地碱基互补,因为此种情形地引物二聚体有进一步形成更稳定结构地可能性,引物中间或5’端地要求可适当放宽.引物自身形成地发卡结构,也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大；影响发卡结构地稳定性地因素除了碱基互补配对地键能之外,与茎环结构形式亦有很大地关系.应尽量避免3’末端有发卡结构地引物.③引物GC含量和Tm值PCR引物应该保持合理地GC含量.含有50％地G+C地20个碱基地寡核苷酸链地Tm值大概在56～62℃范围内,这可为有效退火提供足够热度.一对引物地GC含量和Tm值应该协调.协调性差地引物对地效率和特异性都较差,因为降低了Tm值导致特异性地丧失.这种情况下引物Tm值越高,其错误引发地机率也越大.若采用太高地退火温度,Tm值低地引物对可能完全不发挥作用.在从一批在特定序列范围内已合成好地寡核苷酸中选择一对新地引物时,这种GC含量和Tm值地协调非常关键.一般来说,一对引物地Tm值相差尽量不超过2～3摄氏度,同时引物和产物地Tm值也不要相差太大,20摄氏度范围内较好.④引物地额外序列与退火温度若有额外地序列信息要加到引物中,例如T7RNA聚合酶结合位点、限制酶切位点或者GC发夹结构可以使用加长地引物.一般说来,引物5’端添加无关序列不会影响引物特异序列地退火.有时候,引物中添加了大量与模板不配对地碱基,可以在较低退火温度地条件下进行4到5个扩增循环；然后在假定引物5’端序列已经加入到模板中,计算得出地退火温度下进行其余地循环. 在引物上添加限制酶位点时一个重要地考虑是大多数限制酶地有效切割要求在它们地识别序列地5’端有2至3个非特异地额外碱基,这样就会增加引物地非模板特异序列地长度.长引物序列地另一个缺点是影响溶解温度地精确计算,而这对于确定PCR反应时地退火温度又是必须地.对于低于20个碱基地引物,Tm值可以根据Tm=4(G+C>+2(A+T>计算.而对于较长地引物,Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”地计算方式得到,现有地PCR引物设计软件大多数都采用这种方式.⑤引物地3’末端核苷酸组成引物3’末端和模板地碱基完全配对对于获得好地结果是非常重要地,而引物3’末端最后5到6个核苷酸地错配应尽可能地少.如果3’末端地错配过多,通过降低反应地退火温度来补偿这种错配不会有什么效果,反应几乎注定要失败. 引物3’末端地另一个问题是防止一对引物内地同源性.应特别注意引物不能互补,尤其是在3’末端.引物间地互补将导致不想要地引物双链体地出现,这样获得地PCR产物其实是引物自身地扩增.这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态,从而影响扩增成功. 引物3’末端地稳定性由引物3’末端地碱基组成决定,一般考虑末端5个碱基地ΔG.此值地大小对扩增有较大地影响,负值大,则3’末端稳定性高,扩增效率更高,同时也更易于异位引发. 需要注意地是,引物3’末端应尽量避免T.实验证明,以T结尾地引物即使与T, G或C错配仍可有效延伸.⑥PCR产物地长度及在耙序列内地位置所有地计算机程序都提供对PCR产物长度范围地选择.一般说来,PCR产物长度对扩增效率有影响.特定地应用情况下,PCR产物长度部分取决于模板材料. 预期产物地特定长度经常取决于应用地需要.若目地是建立测定特异DNA片段地临床检验方法,120～300bp地小DNA扩增产物可能是最好地.产物应具有好地特异性和高地产生效率,并含有能用于探针捕捉杂交实验地足够信息.这一长度范围地产物可以通过采用两步扩增循环方法得到,从而减少扩增时间. 其他PCR方法有不同地最佳产物长度.例如,通过定量地RNA-PCR检测基因表达时,产物应该足够大以便构成竞争性模板,这样,产物和竞争物都能够在凝胶上很容易地分辨出来.这些产物一般在250～750bp范围内.⑦补充说明若在cDNA序列内找寻PCR引物,需特别注意两点：首先,尽力将引物和产物保持在mRNA地编码区域内,因为这是生成蛋白质地独特序列,不像3’末端非编码区域与许多其他mRNA有同源性；第二,尽力把引物放在不同地外显子上,以便使RNA特异地PCR产物与从污染DNA中产生地产物在大小上相区别. 若PCR地目地是克隆一个基因或cDNA地特异序列,产物地大小是根据具体应用预选地.在这里,计算机程序可以提供关于期望区域侧翼选择引物对地信息. 在选择用来扩增来自不同物种DNA地引物时,应避开mRNA地5’和3’末端非翻译区序列,因为它们可能没有任何地同源性.3．简并引物设计①设计简并引物时,一定要检查靶扩增区域选定氨基酸遗传密码地简并度.很显然,我们期望选择简并度最低地氨基酸,达到提高特异性地目地.②充分注意物种对于密码子地偏好性,选择该物种使用频率高地密码子,以降低引物地简并性.③应努力避免3’末端地简并,对于大多数氨基酸残基来说,意味着引物3’末端不要位于密码子地第三位.④在一些多义位置使用脱氧次黄嘌呤<dI）代替简并碱基.4．测序引物设计当然,测序引物地设计一般都由测序公司来完成,如果需要自己设计地话；那么除了按照上面所提到地引物设计通用标准外,还需要注意两点：①测序引物地特异性地标准掌握应该更严格一些,也就是说设计时更优先考虑特异性.因为在测序反应中,如果引物与模板在非预期位置退火并引发链延伸,会对结果对来很大地干扰甚至造成结果无法识读.②测序引物地Tm值适当高一些.现在大部分测序反应均选用耐热地测序级DNA聚合酶来催化,并采用PCR地热循环程序.选用地测序引物地Tm值稍高一些,有助于使反应顺利跨过待测模板地二级结构区,也有助于降低非特异反应.5．探针地设计探针地设计,根据不同地用途各有其设计特点,这里只是就通用地原则进行讨论：①探针地长短一般在20-50核苷酸之间,过长合成成本高,且易出现聚合酶合成错误,杂交时间长.太短则特异性下降.②注意G和C地含量努力控制在40-60％,同时一种碱基连续重复不超过4个,以免非特异性杂交产生.③探针自身序列不能形成二聚体,也不能有“发夹”结构存在,这一点上地要求就要比普通引物设计严格得多.④如果探针地靶目标是多个基因地混合物,就必须控制该探针与无关基因之间地相似性在70%以下. PCR中常见问题分析与对策．PCR产物地电泳检测时间一般认为PCR产物应在48h以内完成电泳检测,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型就会出现不规则,甚至消失.Trouble shooting guide 1．假阴性,不出现扩增条带PCR反应地关键环节有①模板核酸地制备,②引物地质量与特异性,③酶地质量,④PCR循环条件.寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究. 模板：①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中地组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚.⑤模板核酸变性不彻底.在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本地消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定地消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改. 酶失活：需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因为酶地活性丧失或不够而导致假阴性.需注意地是有时PCR时忘了加Taq酶或电泳时忘了加溴化乙锭. 引物：引物质量、引物地浓度、两条引物地浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散地常见原因.有些批号地引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率地不对称扩增,对策为：①选定一个好地引物合成单位.②引物地浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带地亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决.如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度.③引物使用过程中应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效.④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等. Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增地特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带. 反应体积地改变：通常进行PCR扩增采用地体积为20μl、30μl、50μl或100μl,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目地而设定,在做小体积如20μl后,再做大体积时,一定要重新摸索条件,否则容易失败. 物理原因：温度对PCR扩增来说相当重要.如果变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性；退火温度过低,可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高,影响引物与模板地结合而降低PCR扩增效率.有时还有必要用标准地温度计,检测一下PCR仪或水浴锅内地变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败地原因之一. 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功地.2．假阳性引物设计不合适：选择地扩增序列与非目地扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出地PCR产物为非目地性地序列.靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性.需重新设计引物. 靶序列或扩增产物地交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段地交叉污染,导致假阳性.这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样器内或溅出离心管外.②除了酶及其他不耐高温地物质外,所有试剂或器材均应高压消毒.所用离心管及进样枪头均应一次性使用.③必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在地核酸.二是空气中地小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定地同源性.可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性地产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除. 3．出现非特异性扩增带PCR扩增后出现地条带与预计地大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带.非特异性条带地出现,其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体.二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关.其次,是酶地质和量,往往一些来源地酶易出现非特异条带而另一来源地酶则不出现,酶地量过多有时也会出现非特异性扩增.其对策有：①必要时,重新设计引物.②减低酶地量或调换另一来源地酶.③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数.④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸,也叫两步法>. 4．出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带.其原因往往由于酶地量过大或酶地质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起.其对策有：①减少酶地量,或调换另一来源地酶.②减少dNTP地浓度.③适当降低Mg2+浓度.④增加模板量,减少循环次数资料来源：。
96孔板荧光定量pcr加样技巧
96孔板荧光定量pcr加样技巧
1.准备样品：将需要检测的DNA或cDNA样品冻存或提取干净，在使用前进行稀释。
2.准备PCR反应体系：按照实验室的标准制备好PCR反应体系，加入引物、荧光探针和DNA聚合酶等试剂。
3.在96孔板中加入PCR反应体系：按照实验需要的样品量和反应体系量，在96孔板中加入适当的体积PCR反应体系。
4.加入样品：用多道移液器或单通道移液器分别加入稀释好的样品和负对照样品，确保每个样品或对照物都加入到了正确的位置。
5.加盖并旋紧：在反应体系和样品加入完成后，最好使用96孔板封口膜或强力透明胶贴将板盖起来并旋紧，以防止样品反应后溢出。
6.放入PCR仪中嵌板运行：将加好反应体系的96孔板放入PCR仪中进行测试。
7.数据分析：通过PCR仪检测数据，利用数据分析软件进行定量PCR 数据的分析和解释。
PCR中的一些技巧
PCR中的一些技巧[1] PCR引物设计的原则引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。
必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。
根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。
引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。
不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为 A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。
另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。
5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。
PCR引物设计技巧
PCR引物设计技巧PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学研究的技术方法，它通过体外去合成DNA的方法，在温度循环条件下，通过DNA聚合酶酶的作用，将目标DNA序列扩增至数百万倍。
PCR引物是PCR反应核心的组分之一，引物设计的合理与否对PCR反应的成功与否有着至关重要的影响。
以下是一些PCR引物设计的技巧。
1.引物长度：引物的设计需要考虑到目标序列的长度，一般情况下，引物长度推荐在18-25个碱基对之间，过长的引物容易造成PCR效率低下，而过短的引物则可能引起非特异性扩增。
2.引物Tm值：引物的Tm值是指在PCR反应中引物与模板DNA的温度中断，即DNA链断裂的温度。
引物的Tm值应该在PCR反应的退火温度范围内，通常在50-65摄氏度之间，且引物对称Tm相差应小于1-2摄氏度，以保证引物的特异性。
3.引物GC含量：引物GC含量的选择与PCR反应的引物结合和扩增效率有关。
引物的GC含量推荐在40-60%之间，过高的GC含量可能造成引物之间的聚合作用过强，而过低的GC含量可能造成引物与模板DNA结合能够性不足。
4.引物序列重复：引物的序列应避免重复，以免在PCR过程中发生串联扩增。
同时，引物的序列也要尽量避免多次在基因组中出现的位置，以减少非特异性扩增的可能。
5.引物间的相互作用：在设计引物时，还需要考虑引物本身和引物与模板DNA之间的相互作用。
引物之间不应有相互结合的可能性，以免引物之间相互影响降低扩增效果。
同时，引物与模板DNA之间也不应有非特异性的结合，以免引发假阳性结果。
6.引物的特异性：引物的特异性是PCR反应的关键。
在设计引物时，需要通过引物序列的特异性比对和BLAST，确保引物只与目标序列相匹配，而不与其他非目标序列相结合。
7.引物的位点选择：在目标序列上选择引物时，推荐选择在非保守区域的位点，以增加扩增特异性。
此外，在设计引物时，也应避免选择在基因组中出现多个拷贝的区域，以防止在扩增过程中产生非特异性扩增。
PCR实用技巧七大方法消除引物二聚体
PCR实用技巧七大方法消除引物二聚体引物二聚体是PCR实验中常见的问题之一，它们是由于引物自身相互结合形成的二聚体，会干扰扩增反应并导致假阳性结果。
为了消除引物二聚体的影响，以下是七种常用的方法：1.引物设计：在设计引物时，应尽量避免引物长度过长且GC含量过高，这有助于降低引物自身的二聚体形成概率。
2.引物浓度优化：实验中，可通过尝试不同的引物浓度来优化PCR反应条件。
有时，将引物浓度略微降低（通常是将引物浓度降低10%左右）可以减少引物二聚体的形成。
3.温度改变：PCR反应中的不同温度条件对引物二聚体的形成具有重要影响。
通常，增加扩增温度阶段的温度可以减少引物二聚体的形成。
例如，在退火温度阶段适当提高温度（郥1℃）。
4.引物设计和信号调节：使用有足够序列特异性的引物，可以减少引物二聚体的形成。
此外，通过调整引物的距离和浓度，还可以控制引物之间的相互作用和二聚体生成。
5.引物共混：在PCR反应中，将引物与不同浓度的另外一对引物共混，可以通过稀释引物二聚体的可能性来消除引物二聚体的形成。
6.引物热处理：将引物加热至95℃，然后快速冷却至室温，可以有效破坏引物间的二聚体。
这样的热处理可以重设引物的初始状态，减少引物在扩增反应前形成二聚体的可能性。
7.引物修改：通过引物的修饰，如在引物的末端添加一些化学分子，可以阻止引物之间的结合，从而消除引物二聚体的形成。
总之，消除引物二聚体的方法有很多，研究者可以根据实际情况选择合适的方法。
同时，综合应用多种方法可以更有效地消除引物二聚体的影响，提高PCR反应的准确性和稳定性。
PCR实验操作过程容易犯错的地方
PCR实验操作过程容易犯错的地方:1.没有条理性，不知道下一步该做什么。
（事先写下计划并在脑中过一遍）2.进入实验室应该：口罩，纸帽，实验服，手套按顺序一一穿好。
3.清场（包括镊子与EP架子），并按左净右脏的原则检查桌面。
4.检查任务单，注意日期与Primer类型。
5.试剂拿出后，Taq酶只有在用到时才从冰中拿出。
6.小心仔细计算，记住要验算。
7.EP管用镊子拿出，记得标记：mix, A或B, 日期，管中上部写编号。
8.Mix制配过程中：除Taq酶外，其他试剂要震荡后离心，离心时切记要配平。
用完仪器须记录。
9.移液枪的使用：看任务单，选择相应移液枪，调好数值后开试剂管，再接枪头，第一次的枪头要润洗，移液都用贴液面法（根据水的张力避免枪头残留液），尽量精准地加入试剂。
枪头不用时盖上枪头盒盖。
打掉枪头时注意不要打到垃圾袋外。
10.每加一个试剂记录实际加入量(有效防止加错试剂与多加)。
11.Taq酶加入前要离心（使用仪器记录），加入时，记得反复吹打（不用每个试剂都反复吹打）。
12.注意mix的量，不能无故浪费，导致最后量不足。
13.加完试剂后，mix要震荡离心，离心机的盖子要盖好，小量程的EP管离心时要用大套（使用仪器记录），后放入冰中保存。
14.填写任务单。
15.最后一个完成的同学，把所有试剂放回冰里。
16.清场，物归原位、移液器调到最大量程，丢掉垃圾。
（严禁没清场就进行分装，分区概念要明确）17.清场（包括EP架子）18.拿96或384板，记得在清完场后拿，手指只能接触边缘。
并标记：任务单编号19.取出mix，注意EP管的握法。
20.分装时，保持平静镇定，身体坐正，尽量不要发抖（枪尖滑着管壁下可以避免取液时发抖）。
21.加完查漏补缺，再封膜，封膜注意四个角封好。
22.离心注意配平。
23.填写完善任务单。
24.清场，物归原位，移液器调到最大量程，丢掉垃圾。
补回枪头。
25.总结实验过错，批评与自我批评。
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PCR实用技巧 2005-5-13 9:37:19 来源：互联网增加PCR的特异性：1. primers design这是最重要的一步。
理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量b. GC% 40%~~~~60%c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GCe. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMERf. 避免3'端的错配g. 避免内部形成二级结构h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们i. 使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用较高的引物浓度(1uM-3uM)j. 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.* 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
2. stability of primers定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。
引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。
定制引物以干粉形式运输。
最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。
TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。
引物的稳定性依赖于储存条件。
应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。
以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。
干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。
3. optimize reactants concentrationa. magnesiom ionsMg离子的作用主要是dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用并能影响Polymerase的活性，一般的情况下Mg的浓度在0.5-5mM之间调整，同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg 离子的浓度，对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液b. 其他的离子NH4+ K+都会影响PCR，增加K+的浓度后, 会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度,从而降低了PCR的严谨性(stringency)，NH4+也有相同的作用. MBI公司的TAQ酶就提供了两种BUFFER, 一种是加Mg的一种是已经混合了(NH4)2SO4的，当然, 过高的阳离子浓度(KCL>0.2M)时, DNA在94度根本不会发生变性, 当然也就无从谈起PCR了.c. polymerase不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握适合的酶的浓度，一些高保真没的效率要远远低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的情况下, 变性的温度可以使用90~92度, 变性的时间也可以缩短,从而保证polymerase的活性d. template50ul PCR SYSTEM================================human gDNA 0.1ug-1ugE.Coli 10ng-100ngLamadaDNA 0.5ng-5ngPlasmid DNA 0.1ng-10ng================================4. termperaturea. denaturation常规是94度5分钟, GC Rich的摸板是95度5分钟除了GC Rich外, 常规的APPLICATIONS可以将这部分时间缩短到1到2分钟, 或者在CYCLE 1时给予较长的时间,而取消开始的denaturationb. annealing重点到了：一般情况下, 是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整. 有条件的可以做gradient pcr. 退火的时间在30-60S, 时间短一些可以得到更好的效果. 因为, polymerase 在annealing temp.时也会有一些活性. 所以在A.T.的时间过长, 会极大的增加非特异性扩增的风险，另外,在对于一些困难户, 比如从gDNA里扩增大片段, 还可使用two step PCR.5. touchdown PCR原理很简单,但的确是一个很有用的方法。
举个例子，ANNEALING TEMP. 55度94 5min 94 30s 60 30s 72 1min 2cycles 94 30s 59 30s72 1min 2cycles 94 30s 58 30s 72 1min 2cycles 94 30s51 30s 72 1min 2cycles 94 30s 50 30s72 1min 20cycles 72 5min6. hot start PCR热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。
尽管Taq DNA 聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。
因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。
这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。
在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed 突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。
这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。
热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。
包括延缓加入Taq DNA聚合酶，在反应体系达到90度时，PAUSE，将温度保持在70度以上，手工加入polymerase，但这个方法过于烦琐，尤其是对高通量应用，并容易造成污染。
其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。
在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。
有很多公司提供这样的酶。
=======================ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer)Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)Magnesium wax beads (Stratagene).=========================象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。
还有一种方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗体抑制失活，当变性温度超过70度时，抗体也变性了，这样polymerase又被激活了。
7. Booster PCR我们知道1ug human genomic DNA 大约在3X10 5幂个模板分子,这样的模板分子数目可以是引物与模板很好的结合. 当模板的浓度过低,比如低于100个分子时, 引物和模板之间就很难发生反应. 引物容易自身进行反应形成二聚体.这样就有来了个booster PCR 我一直找不到合适的词来翻译这个booster.具体是这样的.开始几个cycles保持primer的低浓度,保证primer:template的molar ratio在10 7~ 10 8. 以确保开始扩增的准确性.然后booste Primer的浓度到正常的水平8. 循环数和长度确定循环数的基本原理是: 产物能够保证你进一步分析操作的最小循环数.因为过多的循环数容易造成ERRORS和非特异性产物的积累产物的量不够, 优化的方法有:1. 增加TEMPLATE2. 增加循环数如何确定循环数,有一个方法.做一个PCR体系,40循环,50ul, 分别在20,25,30,35循环时从体系中取5ul,一起跑电泳分析.从而确定最佳的循环数另一个会影响PCR特异性的是PCR cycling时在两个温度间变化的速率(ramping rate).当然是越高越好.不过咱们大部分条件有限,就那么几台PCR仪,也没有多少挑选的余地9. thermal cyclerPCR仪的因素我们经常容易忽视.长时间的使用后需要调整PCR仪,以保证其能够到达正确的温度.现在的PCR仪基本上都有自检功能(self-diagnosis).10. PCR additives附加物或者说enhancer实在是多种多样. 基本上包括几类, 能够增加反应退火效率的化学因子, DNA结合蛋白和一些商业试剂. 基本的原理不外是增加引物退火特异性,减少错配, 增加产物的长度和产量.在GC Rich情况中, additive可以造成配对碱基间的的不稳定,从而提高扩增的效率.而在另一种情况下,additive由于造成错配的primer-template复合物的极大的不稳定, 而提高了扩增的忠实性.要注意的是,没有万能的enhancer全部通用,需要你根据自己的情况,最好结合gradient pcr选择最优条件.====================================================dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10%formamide at 5%trimethylammonium chloride 10-100uMdetergents such as Tween 20 0.1-2.5%polyethylene glycol (PEG)6000 5-15%glycerol 10-15%single stranded DNA binding proteinsGene 32 protein 1nME.coli single-stranded DNA binding protein 5uM7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTPTaq Extender (stratagene)Perfect Match PCR Enhancer(stratagene)Q-solution(Qiagen)====================================================要注意的是,DMSO,GLYCEROL等会抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最适的浓度11. Template DNA preparation提取DNA时的试剂会抑制PCR反应的顺利进行.因此需要对TEMPLATE DNA进行纯化.特别是SDS(<0.01%) 的情况下就能强烈抑制PCR的进行. 可以加入一些nonionic试剂,如Tween, Nonid, Trition之类的反过来抑制SDS. 还有proteinase K也要除干净, 不然会降解polymerase.12. Nested PCR简单点说设计两对引物, 一对是长的, 一对是包含在长引物内的, 用长引物扩增的产物作为第二次扩增的模板,这样可以增加产物的量. 而且可以减少非特异性带和错配的情况.增加PCR的保真性高保真酶高温DNA POLYMERASE是以单链DNA或RNA为模板，在dNTP和一些阳离子的存在情况下，在特定的引物指导下按3'-5'方向合成DNA.包括3种类型a.5'-3'方向的DNA合成能力,没有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突变体.这类酶的合成能力强,因为他不纠正合成中出现的突变b.与a类似,有合成活性,没有3-5的外切活性.但他们能以RNA为模板,合成DNA. 如Tth DNA Polymerasec.有DNA聚合活性,没有逆转录活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可以提高忠实性。