阿糖胞苷前药自组装纳米给药系统的构建与临床前抗肿瘤研究

阿糖胞苷前药自组装纳米给药系统的构建与临床前抗肿瘤研究恶性肿瘤是严重威胁全球人类健康的公共卫生问题。

其中,白血病的发病率居第六位,是全球十大高发恶性肿瘤之一。

白血病是一种以造血干细胞异常增殖且弥散浸润至其他组织和器官为主要特征的恶性克隆性疾病。

阿糖胞苷是嘧啶核苷类似物,用于治疗以急性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤为主的各种类型的白血病。

阿糖胞苷发挥抗白血病的主要原理为:阿糖胞苷经胞内磷酸化,转化为三磷酸阿糖胞苷的形式,该活性形式通过抑制DNA多聚酶活性从而干扰DNA的合成,使癌细胞死亡。

目前阿糖胞苷在治疗过程中存在严重缺陷:(1)在体内容易在脱氨酶的作用下发生脱氨基反应,转变为无活性的阿糖尿苷;(2)分子水溶性大,膜透过性差;(3)半衰期短,只有10-20分钟;(4)用于实体瘤的治疗效果差;(5)常出现手足综合征(HFS)和口腔炎等副作用。

因此,临床上阿糖胞苷主要经静脉注射给药,大大限制了临床的使用范围。

因此开发安全高效的阿糖胞苷纳米给药系统具有重要的研究价值和意义。

小分子自组装前药是将药物通过化学键连接低分子量惰性材料形成前药,前药分子可以自组装成结构多样的纳米制剂,通过EPR效应被动靶向至肿瘤组织;同时,具有载药量高,释药效率高的优点,并且可以实现药物的自递送过程。

其中脂溶性好的脂肪酸链与核苷类亲水性药物共价结合形成的小分子自组装前药纳米递送系统,可以提高药物的脂溶性,增加细胞膜通透性,同时增加对实体瘤的浸润,扩大核苷类药物用于实体瘤的治疗范围。

针对阿糖胞苷存在的缺陷,我们课题组已经设计并合成了三种不同碳链长度的单链脂肪酸阿糖胞苷前药,并进行体外生物活性评价:通过酰胺键分别将六个
碳的己酸(HA)、十二个碳的月桂酸(LA)、十八个碳的油酸(OA)和阿糖胞苷共价连接,构建出具有多功能的前药HA-Ara、LA-Ara及OA-Ara。

研究发现,三种不同疏水链长度的阿糖胞苷前药具有不同的组装行为,可以自组装形成纳米球、纳米纤维和纳米带,且均表现出良好的抗白血病活性。

本课题中,为进一步研究两个链的疏水脂肪酸连接阿糖胞苷形成的前药,以
及纳米组装行为和抗白血病效果,我们将生物相容性好的双链脂肪酸(DTA)与亲
水性的阿糖胞苷(Ara-C)共价结合形成前药DTA-Ara。

该分子与Ara-C及单链脂
肪酸前药相比,具有脂溶性和膜通透性增加,血浆稳定性增强,可长期保存的优点。

在以上研究的基础上,我们对上述四种疏水性不同的阿糖胞苷前药的体外抗白血病效果进行比较,结果发现,月桂酸-阿糖胞苷(LA-Ara)对白血病细胞的细胞毒性最强,且体内药动学研究结果表明LA-Ara的口服生物利用度显著提高,口服给药有效。

因此,基于增加脂溶性可以提高核苷类亲水性药物对实体瘤浸润的原理,我们选用LA-Ar 口服纳米制剂作为抗实体瘤的模型药物,并开展抗实体瘤的
临床前研究,为阿糖胞苷在治疗实体瘤方面提供临床前研究数据,为申报临床研
究奠定基础。

课题的研究内容包括:(1)将阿糖胞苷的4位氨基与双链脂肪酸的羧基共价
结合,构筑小分子前药自组装体系;(2)将构筑好的月桂酸-阿糖胞苷(LA-Ara)进
行抗实体瘤的一系列临床前评价。

具体研究内容如下:1.小分子2-癸基十四酸-
阿糖胞苷前药自组装纳米粒的合成与生物学评价阿糖胞苷是亲水性抗肿瘤药,通过抑制DNA的合成干扰细胞的代谢过程,从而产生细胞毒性作用。

但是由于其分子极性大,半衰期短,临床使用受到限制。

本课题采用生物相容性好的双链脂肪酸2-癸基十四酸(DTA)与阿糖胞苷通过酰胺键进行共价结合,形
成小分子前药(DTA-Ara),核磁共振氢谱(1H-NMR),质谱(MS)和傅里叶红外光谱(FT-IR)均证明产物合成成功。

饱和溶解度实验表明,和阿糖胞苷相比,前药的脂溶性和膜通透性明显增加。

前药分子可以自组装形成纳米粒,通过透射电镜(TEM)观察纳米粒呈现均匀的球形,动态光散射仪(DLS)测得的粒径在130 nm左右,电势大约在-31.6 mV。

体外稳定性实验表明,DTA-Ara在水或pH 7.4 PBS溶液中稳定存在一周以上,可长期保存。

体外溶血实验初步判定纳米粒具有良好的生物相容性,可经静脉注射。

采用两种白血病细胞K562和HL60细胞作为细胞毒性实验模型,结果表明,与原料药相比,DTA-Ara对两种细胞均呈现出较高的细胞毒性。

以上研究表
明,DTA-Ara纳米粒在白血病治疗方面显示了巨大的临床潜在价值。

2.月桂酸-阿糖胞苷前药口服纳米制剂用于治疗实体瘤的临床前评价基于课题组对月桂酸-阿糖胞苷(LA-Ara)具有较好的体外抗白血病活性的研究,体内药动学实验表明,LA-Ara纳米纤维(NFs)的口服生物利用度显著提高。

本课题选用鼠源乳腺癌细胞4T1和人源乳腺癌细胞MCF-7作为实体瘤细胞模型研究前药对实体瘤细胞的毒性。

体外细胞实验表明,LA-Ara比阿糖胞苷具有更高的细胞毒性。

以鼠源乳腺癌作为体内药效学实验的肿瘤模型,发现LA-Ara NFs可以显著抑制肿瘤生长。

临床前安全性评价和组织学实验表明LA-Ara NFs无明显系统毒性(如肝肾功能障碍和血液异常),且可以经口服给药。

此外,和游离药物相比,LA-Ara NFs能避免皮肤的毒副作用(如手足综合征HFS和黏膜炎)的发生。

因此,LA-Ara NFs用于实体瘤治疗具有很大的发展前景,以期促进阿糖胞苷
前药进入临床推广应用。

综上所述,本文对两种阿糖胞苷小分子前药自组装纳米给药系统进行了抗肿瘤的生物学评价和临床前研究。

研究结果表明,DTA-Ara纳米粒实现了药物的自递送过程,显著增强了阿糖胞苷的脂溶性和膜透过性,延长了药物半衰期;而LA-Ara 口服纳米纤维和Ara-C 相比,可以增强抗实体瘤的治疗效果。

因此,本文研究的两种小分子阿糖胞苷前药提供了一种有效扩大阿糖胞苷临床使用范围的解决方案,具有巨大的实践意义。