技术报告

免疫组织化学检测雌、孕激素受体在肝内、外胆管癌中的表达
技术报告
一、立题依据与设计指导思想
胆管癌是一种恶性程度很高，预后不良的胆道系统恶性上皮性肿瘤，它对常规治疗的反应性很差,研究新的治疗靶点对于胆管癌来说，意义重大。

众所周知，雌激素受体（estrogen receptor, ER）、孕激素受体（progesterone receptor, PR ）是乳腺癌的治疗靶点，应用三苯氧胺治疗ER和PR阳性的乳腺癌患者取得了很好的效果。

有研究发现消化道肿瘤可表达ER和PR。

国内外有研究发现三苯氧胺在体外可以抑制胆管癌细胞株的生长活性，并对胆管癌的化疗耐药性有抑制作用，提示三苯氧胺在胆管癌治疗中可能具有一定前景。

三苯氧胺作用的靶点为ER和PR，对肝内胆管癌中ER和PR表达的研究国内外均有报道，阳性率不一致，如Nash等报道肝内胆管癌不表达ER，但在低分化肝胆管癌中表达率50%。

Alvaro 等报道的肝内胆管癌ER阳性表达率100%。

Sampson等虽然通过免疫组化的方法没有检测到胆管癌细胞系中存在ER蛋白，但通过免疫沉淀反应成功地证实了ER 在胆管癌细胞系中存在。

对肝外胆管癌中ER和PR的表达情况尚罕见报道。

复习以往已发表研究论文，本项目研究者发现他们对ER和PR阳性判定的标准不一，详细说明阳性判定标准的文献中选择的阳性界值有1%、10%以及25%。

本研究目的在于使用较敏感的免疫组织化学方法检测ER和PR在肝内、外胆管癌中表达情况，应用2010年ASCO/CAP发布的ER和PR免疫组化检测指南中的阳性判定标准，为三苯氧胺的临床应用提供理论依据。

二、研究内容及方法
1．病例选择：选取滨州市人民医院2006年1月～2010年12月诊断的全部胆管癌病例，包括外院会诊病例，根据发病部位分为肝内胆管癌和肝外胆管癌2组。

另选取10例子宫内膜及肌层标本作阳性对照。

2.免疫组化染色方法：采用MaxVision法进行免疫组织化学染色。

抗体ER、PR以及MaxVision试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司。

DAB显色。

染色步骤采用MaxVision试剂盒中说明书提供的方法步骤；其中抗原修复采用
Tris-EDTA（PH9.0）,高压修复3min。

具体步骤：石蜡切片脱蜡、水化，高压锅中使用PH9.0 Tris-EDTA修复液抗原热修复3min，滴加50μl 3%H2O2室温孵育10min阻断内源性过氧化物酶活性，PBS水洗，滴加ER、PR抗体50μl于37℃孵育下60min，PBS水洗，滴加即用型Maxvision TM试剂50μl于37℃下15min，PBS水洗后DAB显色，自来水洗，苏木素复染，脱水、透明、封片。

3.结果
（1）肝内胆管癌中ER和PR的表达
24例胆管癌中ER阳性表达7例（图1），阳性率29%，其中组织学分级高分化组3例（3/9,33%），中分化组3例（3/11,27%），低分化组1例（1/4,25%）。

不同组织学级别之间的ER表达率无统计学意义（P=1.00）。

PR阳性表达11例，阳性率46%，其中组织分级高分化组2例（2/9，22%），中分化组7例（7/11,64%），低分化组2例（2/4,50%）。

不同组织学级别之间的PR表达率无统计学意义
（P=0.196）。

（2）肝外胆管癌中ER和PR的表达
ER和PR在34例肝外胆管癌标本中均呈完全阴性表达（图2）。

在肿瘤标本组织中附带有的胰腺组织中呈小导管细胞核阳性表达。

（3）阳性对照：10例子宫内膜及肌层标本均呈弥漫核阳性表达。

4.讨论分析
ER和PR作为乳腺癌的治疗靶点已经获得了广泛的共识。

能否将ER和PR 在乳腺癌治疗中的成功经验应用于非激素受体靶器官发生的恶性肿瘤，已经成为许多肿瘤学者研究的热点。

人正常胆管上皮细胞中不表达ER，但本研究结果提示，肝内胆管癌细胞则有较高的ER和PR阳性表达率，分别为29%和46%。

Alvaro 等使用免疫组织化学方法检测了18例肝内胆管癌标本，结果显示全部标本均有ERα表达。

他们同时在HuH-28细胞系中发现有ER的表达。

国内范正军等检测了42例肝门部胆管癌组织中ER和PR的表达水平，发现肝门部胆管癌中ER和PR阳性率分别为66.7%和64.3%，ER和PR的表达率随着细胞分化程度的降低而升高，提示ER和PR有成为反映肝门部胆管癌恶性程度和预后因子的潜在价值。

本研究结果没有表现出这一趋势，各组织学级别之间差异无统计学意义，可能与本组病例数较少或选择的阳性界值不同有关。

对肝外胆管癌中ER和PR的表达情况的研究尚很罕见。

雷元卫等采用免疫组织化学ABC法检测了30例肝外胆管癌标本，发现ER和PR的阳性表达率分别为56.7%和50%。

本文检测了34例肝外胆管癌标本，均呈完全阴性表达，与雷元卫等的研究结果有较大差异。

结果差异的原因可能是由于免疫组织化学检测系统和阳性判定标准均存在不同所致。

免疫组织化学染色过程中，由于内源性生物素影响容易产生非特异性着色，他们采用的ABC法则不能避免这一弊端，本文采用的MaxVision TM法则能有效这一干扰；同时该报道中采用的阳性结果判断方法为细胞浆或/和细胞核着色为阳性着色，很容易将内源性生物素产生的非特异性着色判定为阳性表达。

ER和PR均为核受体家族，在核内与相应配体结合起到转录调节作用。

根据美国临床肿瘤学会（ASCO）/美国病理医师学院（CAP）发布的ER和PR免疫组织化学检测指南，ER和PR的肯定阳性定位应在细胞核，出现其他着色都应判断为非特异性着色，不能够作为指导临床诊治的依据。

本研究中发现ER和PR在肝外胆管癌中呈完全阴性表达，与肝内胆管癌中ER和PR的较高表达率形成鲜明对比，提示肝外胆管癌的发生发展过程与肝内胆管癌不尽相同，尽管它们都来源于胆管上皮细胞。

Mancino等的研究表明肝内胆管癌中VEGF-A、VEGF-C及其受体VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3均呈强阳性表达，但在Tang等的结果显示人的肝外胆管癌标本中，未能发现VEGFR 的高表达。

这一点或可为ER和PR在肝内、外胆管癌发生发展过程作用程度不
同的辅证之一，因为雌激素可以诱导雌激素敏感肿瘤的新生血管形成，而VEGF 在此过程中起到了重要作用。

ER和PR在肝内、外胆管癌中表达水平的差异，也提示ER和PR可能参与了肝内胆管癌的发生过程中，有可能成为肝内胆管癌的治疗靶点，例如刘志华等就发现雌二醇竞争性拮抗剂tamoxifen可增强化疗药对胆管癌细胞株QBC939以及耐药细胞株QBC939/ADM的抑制作用，并可提高耐药细胞株细胞内的药物浓度。

鉴于内分泌治疗在乳腺癌中已经发挥的重要作用，ER和PR在肝内胆管癌中的具体作用机制很值得进一步研究，以将来为内分泌治疗在胆管癌中实际应用提供理论依据。

5.结论：ER和PR在肝内、外胆管癌中的表达水平明显不同，仅表达于肝内胆管癌，可能参与了肝内胆管癌的发生过程。

三、主要创新点、先进点及其指导意义
1.方法新：运用可避免内源性生物素及过氧化物酶的免疫组化染色方法进行研究，结果可信性强
2.标准新：采用2010年ASCO/CAP发布的ER和PR免疫组织化学检测指南作为判断标准。

3.结果新：首次采用最新免疫组化方法对比了ER和PR在肝内、外胆管癌中的表达，发现结果对比鲜明，仅肝内胆管癌中存在阳性表达，肝外胆管癌完全阴性。

本研究结果提示（1）雌激素受体途径在肝内、外胆管癌发生发展过程中的作用存在明确差异，值得进一步深入研究。

（2）内分泌治疗具有具有毒、副反应小，费用较低，患者生存质量较高的特点。

该文为内分泌治疗方法在肝内胆管癌中得到具体、广泛应用提供理论依据，具有重要的临床意义，将产生显著的社会效益。

四、论文发表情况
该研究已作为论著发表在中华医学会系列杂志《肿瘤研究与临床》2011年第12期。