GSH含量的测定.doc
谷胱甘肽含量测定
植物生理学模块实验指导玲主编科学还原型谷胱甘肽含量的测定方法（分光光度计法）【实验目的】了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。
【实验原理】谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。
谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。
2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。
因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。
【器材与试剂】1.实验仪器与用具研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（100ml、200ml、1000ml）、分光光度计2.实验试剂50g/L三氯乙酸（TCA）溶液（含5mmol/L Na2-EDTA）：称取5g三氯乙酸，用蒸馏水溶解稀释至100ml。
再称取186mg Na2-EDTA·2H2O，加入到100ml 50g/L三氯乙酸溶液中溶解。
0.1mol/L磷酸钠溶液缓冲液（pH7.7）：配制方法见附录。
0.1mol/L(pH6.8)磷酸钠缓冲液：配制方法见附录。
4mmol/L二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）溶液：称取15.8mg DTNB，用0.1mol/L、pH6.8磷酸缓冲液溶解，定容至10ml，混匀，4℃保存。
现用现配。
100μmol/L还原型谷胱甘肽标准液：称取3.1mg 还原型谷胱甘肽，加入少量无水乙醇溶解，加蒸馏水定容至100ml。
3.实验材料同抗坏血酸。
【实验步骤】1.标准曲线制作取6支试管，编号，按照表1加入各种试剂，混匀，25℃保温反应10min。
南瓜籽中还原型谷胱甘肽(GSH)和蛋白巯基(P-SH)的测定
南瓜籽中还原型谷胱甘肽(GSH)和蛋白巯基(P-SH)的测定应译娴;邱岳;张小勇;崔胜云【摘要】The contents of reduced glutathione (GSH) and protein thiols (P-SH) in pumpkin seed were detected by pre-column derivatization HPLC method using 5,5'-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid(DTNB) as derivatizing agent with concomitant cell rupture sample pretreatments.The results showed that detected pumpkin seed contained relatively abundant GSH and thiols in P-SH.The amounts detected were:GSH=1.045 μmol/g,thiols in P-SH=1.887 3 μmol/g respectively.The recoveries of the methods are99.55 ％-100.49 ％,and detection limits are 0.138 4 μmol/g for GSH and0.218 4 μmol/g for protein thiols.The results provided a useful data for the application of pumpkin seed for the healthcare.%用5,5-二硫双-2-硝基苯甲酸(5,5'-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid,DTNB)为柱前衍生化试剂,采用细胞破壁、衍生化为一体的同步衍生化提取,HPLC梯度洗脱测定市售南瓜籽干品中还原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione,GSH)和含半胱氨酸残基的含巯基蛋白(Thiol protein,P-SH)的巯基含量.结果发现南瓜籽含较丰富的GSH和P-SH的巯基,其3次测定均值分别为GSH含量为1.045 μmol/g,P-SH的巯基含量为1.8873μmol/g.在优化的选定条件下,该测定方法的回收率为99.55 ％～100.49％,GSH和P-SH巯基测定检测限分别为0.138 4 μmol/g和0.2184 μmol/g.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)015【总页数】5页(P143-147)【关键词】高效液相色谱法;南瓜籽;谷胱甘肽;巯基蛋白质【作者】应译娴;邱岳;张小勇;崔胜云【作者单位】延边大学理学院化学系,吉林延吉133002;延边大学理学院化学系,吉林延吉133002;延边大学理学院化学系,吉林延吉133002;延边大学理学院化学系,吉林延吉133002【正文语种】中文南瓜是葫芦科南瓜属草本植物的果实，是在我国各地都有广泛种植的味美可口的瓜菜。
正常人外周血单核细胞内谷胱甘肽含量的测定_王仁生
*本课题受广西自然科学基金资助(桂科自9731046)收稿日期:2002-11-07正常人外周血单核细胞内谷胱甘肽含量的测定*王仁生 丁 华 吴 芳(广西医科大学第一附属医院放疗科 南宁 530021)摘要 目的:建立外周血单核细胞内谷胱甘肽(GS H )含量的检测方法及健康人的参考值。
方法:利用Tietze 还原酶法检测不同性别、不同年龄健康人群外周血单核细胞内的G SH 含量。
结果:正常人群中外周血单核细胞内GS H 含量男女分别为:[(133.88±72.32)×10-9]mmo l /L,[(141.51±58.98)×10-9]mmol /L ,男女之间无明显差异(P >0.05),测得各年龄段值:30岁以下为[(132.99±49.16)×10-9]mmo l /L ,30～39岁为[(129.00±68.41)×10-9]mmo l /L ,40～49岁为[(132.67±47.25)×10-9]m mol /L ,50～59岁为[(152.17±73.72)×10-9]mmo l /L,60岁以上为[(150.84±104.27)×10-9]mmol /L 。
各年龄段G SH 值无明显差异(P >0.05)。
结论:该方法所测结果可信,可作为使用内源性G SH 合成抑制剂增强放疗和化疗效果的参考依据。
关键词 谷胱甘肽;单核细胞;放射增敏剂;化学增敏剂中国图书资料分类法分类号 R446;R815THE GLUTATHIONE CONTENT OF MONDCYTE AS SAYI NG HEALT HY PEOPLE ’SBLOODWang Rensheng ,Ding Hua ,W u Fang .(Department of Radio therapy ,the First Affiliated H ospital of Guangxi Medical Univ ersity,Nanning ,530021China)Abstract Objective :To establish a test method about g lutathio ne content of mondcyte in healthy peo ple 's blood and its reference data .Methods :Using tietze methods to test the GSH content of mo ndcy te in healthypeople 's blood in different sexes and different ag es .Result :The GSH content in men and women a re [(133.88±72.32)×10-9]m mol /L and [(141.51±58.98)×10-9]m mol /L,respectiv ely(P >0.05);the GSH con-tent in young er than 30years,30～39years,40～49years,50～59years and above 60years are [(132.99±49.16)×10-9]mm ol /L ,[(129.00±68.41)×10-9]mmol /L ,[(132.67±47.25)×10-9]m mol /L ,[(152.17±73.72)×10-9]mmol /L,[(150.84±104.27)×10-9]mmol /L respectively (P >0.05).C onclu -sion :This m ethod is sim ple and the results a re accurate.The results are reliable w hen we use chemosensitization and radiosensitization to decrease the GSH co ntent .Key words GS H ;mondcyte ;radiosensitization ;chemosensitization 谷胱甘肽(Glutathione ,GS H )是一种内源性的巯基化合物,在正常状态下多以还原态存在于组织和细胞中。
谷胱甘肽(GSH)含量测定
谷胱甘肽（GSH）含量测定一、实验目的1.了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程;2.学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。
二、实验原理谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）、甘氨酸(Gly)组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。
它作为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，如与自由基、重金属等结合，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外。
谷胱甘肽能和2-硝基苯甲酸（DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG），2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm 处具有最大光吸收。
因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。
三、实验材料小麦幼嫩叶片四、实验方法及步骤1.制作标准曲线取7只干净的试管编号，按如下表格加入各试剂，反应20分钟后在412nm 下用分光光度计测其吸光度，制作标准曲线；2.样品测定a、称取小麦叶片0.2g，加入少量5%偏磷酸缓冲液研磨提取，并用5%偏磷酸缓冲液定容至6ml，8000rpm离心10min,取上清液；b、取上述上清液2ml显色，操作同标准曲线。
3.结果计算：GSH含量（ug/Gfw）= (Cx*Vt)/(Fw*Vs)注：Cx---2ml样品中GSH含量（ug），即每管中GSH的含量Vt---样品提取液总体积(ml)；Vs----显色时所取样的体积(ml)；FW---样品鲜重（g）。
五、实验结果1.标准曲线1.样品测定结果六、注意事项1.使用移液管吸取试剂时，视线要垂直于移液管且与液面凹面水平，不能斜视，以免量取试剂不准确。
2.在提取样品时，最好沉淀出去蛋白质，以防止蛋白质中所含巯基及相关酶对测定结果的影响。
3.在研磨叶片时，为方便研磨，刚开始时加入少量的提取液。
GSH_测定方法
GSH 的测定方法1．样品0.3g 用 2ml 6% (w/w) 的偏磷酸冰浴研磨，12000 g离心15-20 分钟2．GSH+GSSG的测定：取上清液0.4 ml 然后加入0.6 ml (0.5M pH 7.5) 的磷酸缓冲液稀释，然后加20ul 的蒸馏水，用于测总的谷胱苷肽。
但本实验没有稀释因为稀释后测的值太低就直接取100 ul 的上清液测定的。
3．GSSG的测定：取上清液0.4 ml 然后加入0.6 ml （0.5 M , pH 7.5）的磷酸缓冲液稀释，然后加入40 ul 的2-乙烯基吡啶，在25 °下反应1小时，用于测定GSSG。
但本实验没有稀释就是因为稀释后测定的值太低就直接取500 ul 的上清液直接加入30-40ul 的 2-乙烯基吡啶，在25°下反应1小时。
注意：建议先稀释一个试一下，看能否测出值，然后决定是否稀释。
4. 反应体系：1600 ul 100 mM pH 7.5 PBS100 ul 0.6 mM DTNB (5,5 –二硫代双－2－硝基苯甲酸)100 ul 提取液100 ul 0.2 mM NADPH100 ul 3个单位的GR5. 在412 nm 反应1分钟。
6. 药品的配制：1） 100 ml 6%(pH 2.8, 1mM 的EDTA) 的偏磷酸： 6 g 偏磷酸加热溶于水后，加入0.02925 g EDTA(EDTA 可能不溶要事先配一个母液) 然后调pH 到2.8 最后定容到100 ml .2) 100 ml 0.5M pH 7.5 的PBS的配制：先把0.5 M 的A液及0.5 M 的B 液配好，然后取16ml A+ 84ml B, 最后用HCL调 pH 到7.5。
3）200 ml 100 mM pH 7.5 的PBS：16 ml 0.2 M A+84ml 0.2 B, 稀释到200 ml.4) 0.6 mM DTNB: DTNB 用100 mM pH 7.5 的PBS 来配制，好溶。
谷胱甘肽(GSH)含量测定
谷胱甘肽（GSH）含量测定一、实验目的1.了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程;2.学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。
二、实验原理谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）、甘氨酸(Gly)组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。
它作为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，如与自由基、重金属等结合，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外。
谷胱甘肽能和2-硝基苯甲酸（DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG），2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm 处具有最大光吸收。
因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。
三、实验材料小麦幼嫩叶片四、实验方法及步骤1.制作标准曲线取7只干净的试管编号，按如下表格加入各试剂，反应20分钟后在412nm 下用分光光度计测其吸光度，制作标准曲线；2.样品测定a、称取小麦叶片0.2g，加入少量5%偏磷酸缓冲液研磨提取，并用5%偏磷酸缓冲液定容至6ml，8000rpm离心10min,取上清液；b、取上述上清液2ml显色，操作同标准曲线。
3.结果计算：GSH含量（ug/Gfw）= (Cx*Vt)/(Fw*Vs)注：Cx---2ml样品中GSH含量（ug），即每管中GSH的含量Vt---样品提取液总体积(ml)；Vs----显色时所取样的体积(ml)；FW---样品鲜重（g）。
五、实验结果1.标准曲线1.样品测定结果六、注意事项1.使用移液管吸取试剂时，视线要垂直于移液管且与液面凹面水平，不能斜视，以免量取试剂不准确。
2.在提取样品时，最好沉淀出去蛋白质，以防止蛋白质中所含巯基及相关酶对测定结果的影响。
3.在研磨叶片时，为方便研磨，刚开始时加入少量的提取液。
还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)的测定
还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)的测定关键词：还原型谷胱甘肽GSH氧化型谷胱甘肽GSSG测定2009-04-24 00:00 来源：互联网点击次数：6147GSH和GSSG 参照Anderson等（1992）。
取0.5 g样品，加入3 mL冰冷的6%的偏磷酸（含1 mmol•L-1 EDTA ，pH 2.8），冰浴研磨，匀浆液以20,000 g，4 ℃离心15 min，取上清液来马上测定GSH和GSSG的含量或储存在-20 ℃下等待测定。
总的GSH和GSSG含量测定如下：200 μL提取液加 1.2 mL反应液包含400 μL反应液1（110 mmol•L-1 Na2HPO4•7H20，40 mmol•L-1NaH2PO4•H2O，15 mmol•L-1EDTA，0.3 mmol•L-15,5‘-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）DTNB，0.04% BSA）、320 μL反应液2 （1 mmol•L-1 EDTA，50 mmol•L-1 imidazole 咪唑solution and 0.02% BSA）、400 μL反应液3（5% Na2HPO4，pH 7.5的溶液稀释50倍）、80 μL 9.0 mmol•L-1 NADPH。
测定OD412下的吸收值。
GSSG 含量测定如下：200 μL提取液加入1 mL的2-2乙烯嘧啶（稀释50倍）在25°C下水浴1 h再测定OD412下的吸收值。
GSH的含量可以从总的GSH和GSSG含量中减去GSSG含量获得。
GSH测定方法：取样品0.5 g，加入预冷的5%磺基水杨酸2.5 ml和少许石英砂，充分冰预研磨，转入离心管中，于4℃下20,000×g离心20min，将上清液分装，液氮冷冻后于-20℃保存或直接进行抗氧化剂分析。
取50 μL上清液，用5% 磺基水杨酸定容至100 μL （即加入5% 磺基水杨酸50 μL），加入24 μL 1.84 mol•L-1三乙醇胺triethlene diamine以中和样液，加入50 μL 10% 乙烯吡啶Polyvinyl pyridine （用70% 乙醇配制），25℃水浴1 h，以除去GSH，到时加入706 mL 50 mmol•L-1磷酸缓冲液，pH 7.5，内含2.5 mmol•L-1 EDTA，加入20 μL 10 mmol•L-1 NADPH 和80 μL 12.5 mmol•L-1 DTNB（二硫硝基苯甲酸），混匀，25℃保温10 min，到时加入20μL 50 U•mL-1 GR，总体积为1 mL，立即混匀，读出3 min时的OD值。
【doc】谷胱甘肽的生理意义及其各种测定方法比较、评价
谷胱甘肽的生理意义及其各种测定方法比较、评价第11卷第2期2003年6月中国临床营养杂志CHINESEJOURNALOFCLINICALNUTRITIONV o1.11.No.2June.20o3谷胱甘肽的生理意义及其各种测定方法比较,评价樊跃平于健春余跃张琳(中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院外科,北京100730)综述?摘要谷胱甘肽是一种非常特殊的氨基酸衍生物,广泛存在于动,植物细胞,在生物体内有许多重要的生理作用.人类组织中GSH的浓度的研究还不广泛.谷胱甘肽的测定有许多方法,目前还没有一种既快速,稳定,特异,又十分灵敏,经济的测定方法.本文对谷胱甘肽的生理意义及其各种测定方法作一综述.关键词谷胱甘肽生理意义测定方法中图分类号Rl51.3文献标识码A文章编号1008—5882(2003)02-0136-04 PhysiologicalandClinicalSignificanceofGlutathioneandEvaluationofV ariousMeasurementsofGlutathioneFanY ue—pingY uJian-chunYuY ueZhangLin(PUMCHospital,CAMSandPUMC,Beijing100730,China) Glutathione(GSH)isaspecialderivantofaminoacid,presentsinmostplants,a nimalsandmicrobes,playsavitalroleinorganisms.Wehavenotwidelystudiedaboutthe GSHlevelinhumantissue.TherearevariousmeasurementsofGSH,bynow,wehavenotbuiltarap id,stable,specificandsensitivemeasurement.Thephysiologicalandclinicalsignificanceofglu tathioneandevaluationof variousmeasurementsofglutathionewerereviewed. Keywordsglutathione;significance;measurementC.,c2inNutr,2003,11(2):136—139谷胱甘肽的生理意义谷胱甘肽是由谷氨酸,半胱氨酸和甘氨酸形成的三肽化合物,广泛存在于动,植物细胞,并于细胞内合成l】],分为还原型谷胱甘肽(GSH)及氧化型谷胱甘肽(GSSG)两类,其中GSH含量占到约99.5%.谷胱甘肽是一种非常特殊的氨基酸衍生物,它的活性成分是半胱氨酸中的巯基,在谷氨酸与半胱氨酸之间存在一个不多见的.肽键,从而保护了GSH被许多肽酶的水解.1921年Hopkins首先发现了谷胱甘肽,1931年Rapkine 第一次报道巯基化合物的浓度在有丝分裂期间发生了变化,这个变化证实了SH/SS(氧化/还原)循环的存在,并提示巯基化合物可能具备一些基本的生物学功能.Baron经大量回顾,总结,于1951年应用资料外推法提出了”GSH激发SH.酶的活性同样在细胞内发生,是细胞呼吸的常规机制”.对GSH的主要研究工作由Krebs,Hems,Vina于20世纪60～70年代在牛津代谢研究实验室展开l2].GSH可于所有器官组织细胞内生成,尤其以肝脏的生成最重要;是细胞内含量最丰富的非蛋白巯基,能够于细胞内经过酶反应而合成.GSH的生理作用是多方面的,如氨基酸的转运,蛋白,核酸的合成,抗氧化作用,维持蛋白巯基的还原状态,亲电子异生化合作用,维持酶的活性状态,保证了单磷酸己糖的分流,保护细胞防止自由基及内毒素的损伤等等.禁食或应激初期,谷氨酸,半胱氨酸,蛋氨酸中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室;#通信作者住院医师,电话:010.65296024,传真010—65140698,电子邮件:*******************2期谷胱甘肽的生理意义及其各种测定方法比较,评价137的供给会受到干扰.肝脏GSH浓度水平不仅依赖GSSG(可由还原酶转化成GSH),而且还依赖肌肉,肠道器官的谷氨酸,半胱氨酸的储备,正由于这些储备,肝脏GSH水平升高,来保护脏器,组织免受应激状态下的氧化损伤.当病情进展时,GSH的合成下降,这是由于机体的氧化还原作用引起的.谷胱甘肽在临床上有广泛用途:作为抗氧化剂,可保护细胞膜,防止红细胞溶血及促进高铁血红蛋白的还原;对放射线,放射性药物或化疗所引起的白细胞减少等症状可起到保护作用;对缺氧血症,恶心及肝脏疾病所引起的不适具有缓解作用;可用于一氧化碳,重金属及有机溶剂中毒的解毒治疗.近几年还发现GSH可能具有抑制艾滋病病毒的功效.人类组织中GSH的浓度的研究还不广泛.国外文献报道人类肌肉组织GSH浓度为(1320±37)mo1每千克湿体重;国内文献报道血浆总谷胱甘肽浓度为4trmol/L.全血谷胱甘肽浓度为0.57mmol/L(500~mol/L一1000~mol/L),而谷胱甘肽几乎全部包含于血细胞,因此血浆浓度只有4.9I~mol/L-5.9~mol/Lt61.DeanP.Jones等报道健康人血浆GSH含量为(2.09+1.14)micomolar.肝脏被看作是谷胱甘肽代谢的中心器官,而血浆及红细胞中GSH 的浓度可以反映肝脏的GSH的合成能力.GSH与临床许多方面密切相关,对人体血浆,组织细胞中含量的测定,研究,可以提供我们关于细胞对氧化,应激的保护及反应状态的信息【3J,并且由于GSH和GSSG在细胞信号传递,基因控制,氧化还原反应和生物平衡方面的重要作用,细胞谷胱甘肽的精确测定是十分必要的【8】.作为机体内对抗氧自由基的一种重要的抗氧化剂,谷胱甘肽对于临床治疗具有重要意义,提供足够量的抗氧化剂能够改善患者的预后,明显降低危重病长时间的炎症反应.谷氨酰胺是合成谷胱甘肽的重要前体物质(可提供谷氨酸),目前已应用于临床(包括静脉及口服制剂).其作用之一,就是通过维持组织,细胞内谷胱甘肽水平从而保护组织细胞,达到免疫营养的目的1.谷胱甘肽的测定有许多方法,如酶循环法,流式细胞法,滴定法,电泳法和近些年发展的高压液相色谱法等,这些方法各有其优点,但也都有不足,目前还没有一种既快速,稳定,特异,又十分灵敏,经济的测定方法,谷胱甘肽的测定方法有待进一步的发展和完善.下面对目前常用的几种主要的测定方法做一介绍,比较和评价.谷胱甘肽测定方法酶循环法.其测定原理为氧化.还原反应:GSH被DTNB(5,5.dithiobis.2. nitrobenzoicacid;5,5.二巯基.2-硝基苯酸)氧化,生成GSSG和稳定的TNB(5-thio-2一nitrobenzoic acid;5-巯基.2-硝基苯酸);GSSG与GSSG还原酶及NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)反应,还原生成GSH.在NADPH与GSSG还原酶维持GSH总量不变的条件下,GSH和DTNB反应生成TNB的速率与样本中总谷胱甘肽成正比.TNB于412nm波长处有最大吸光度,可以通过分光光度计来测定总谷胱甘肽水平(GSH+GSSG)il1].酶法测定谷胱甘肽,样本的制备要迅速,因为GSH很容易氧化而使其浓度降低.本法还可测定GSSG水平.酶循环法最初由Owen和Belcher提出,之后由Tietze和Griffith进行了改进【3】.酶循环法是一种灵敏,快速的方法I】u;其最大优点是灵敏度高,可测定含量仅0.1~mol/L的样品,回收率93%～106%. Manju等¨认为此方法灵敏度高,但特异性不高,这是由于DTNB可与许多含活性巯基基团物质反应.但此法不足之处在于其测定的是谷胱甘肽总量(GSH+ GSSG),不能区分GSH和GSSG;另外样本的准备也比较严格,要求控制采血至测定时间间隔在3min 内,否则将影响测定,使实际应用受到很大限制. MargaretA.Baker等将酶循环法与微量滴定板技术相结合,设计了一种快速,敏感,简便的测定大数量生物样本的GSH,GSSG的方法.其最大优点是可同时测定大量的样本.为了提高灵敏度,Tamara Mourad等n将酶循环法与生物发光检测技术相结合, 测定GSSG,灵敏度达pm(10)水平.高效液相色谱法(HPLC).HPLC是近年测定复杂生物样本中各种巯基物的最好方法ll”.HPLC过程是溶质在固定相和流动相之间由于分配系数,吸附能力,亲和力,分子大小不同,进行连续分离的过程.其试剂材料包括mBBr(monobromobimane;一溴化物)溶液,NEM(N-Ethylmorphline;N-乙基吗啡),标准GSH,标准半胱氨酸溶液,由两个M6000A泵组成的HPLC,721系统控制仪,710BWISP自动样品仪,420荧光测定仪,C18柱.实验过程包括诱导过程和HPLC过程.GSH和其它巯基物水平可通过标准曲线得到.中国临床营养杂志l1卷HPLC法优点是可以区分开GSH,GSSH及2O多种含巯基氨基酸衍生物.其不足是灵敏度不高,样本中GSH含量不得低于50I~mol/L;且样本的前处理过程耗时,测定大样本时不方便,所用的柱特殊.A.Rodrigueuz-Ariza等[141介绍了一种结合电化学法快速测定谷胱甘肽水平的方法.该法应用一套双通道电化学测定仪,可同时测定GSH,GSSG,还可测定PSSG(蛋白结合谷胱甘肽),具有高灵敏度,高选择性,高效的优点.A.M.Dipietra等[11将依他尼酸作为色谱前诱导物,应用HPLC法测定GSH及L一半胱氨酸,认为在灵敏度要求不太高的情况下,可应用依他尼酸,而且只需简单,基本的HPLC设备即可.Chung-shiY ang等[11介绍了一种将HPLC与微透析机联机测定谷胱甘肽.此法缩短了分析测定时间,简化了样本的准备过程,并提供了连续的监测.流式细胞仪法.应用染色剂标记GSH,形成GSH的荧光化合,同时使染色剂尽量对其他巯基物产生最小影响,以便判断染色背景的程度及其线形关系,根据GSH含量与荧光强度的一定的比例关系,从而得到GSH的值.试剂材料包括染色剂(monobromobimane4mmol/L,monoch]orobimane一氯化物4mmol/L,OPT O-酞基二醛100lxmol/L,mercuryorange汞橙100I~mol/L),流式细胞仪.其方法通过化学处理来标记,耗尽GSH,以产生染色背景;应用流式细胞仪,通过不同染色剂的不同波长范围来测定荧光度, 根据染色背景的程度,得到GSH的值.对GSH进行标记的最理想染色剂应具有很好的专一性,另外,要求能够进行定量分析测定.而这些染色剂的专一性是相对的,一个常见问题是它们还可标志细胞内的其他巯基物,尤其是蛋白巯基. Durand和Olive通过对流式细胞仪巯基染色探针的早期研究,表明monobromobimane对GSH具有合理的专一性.TreumerV alet研究了0-phthaldialdehyde (OPT),表明OPT同时与GSH与蛋白巯基结合形成荧光化合物.Rice介绍了monochlorobimane,目前来讲,这是一个最专一的GSH探针.OConnor介绍了mercuryorange,这个染色剂最初用于组织化学巯基染色,后来发现其与GSH反应快于与蛋白巯基反应,在控制的染色条件下具有一定的专一性.另一种染色剂是甲基氯荧光素酯和甲基氯伊红,在细胞内被酯酶水解,产生高分子荧光,在GSH-S转移酶作用下与GSH结合1.流式细胞仪的特点是在短时间内可获得大量数据,统计学意义明显,能进行多参数相关测定.另外,Manju等[121介绍了一种测定谷胱甘肽的特异,灵敏,快速的方法.其原理是GSH-S转移酶(GST)可使GSH与CDNB(1-chloro-2,4-dinitrobenz- ene)结合形成Dnp-SG(S-dinitrophenylglutathione), 而Dnp-SG于340nm处有最大吸光度.此法不需要酸化提取步骤,并且GSH可特异测定,而不受蛋白巯基或其他巯基的影响.综上所述,谷胱甘肽作为一种广泛存在于生物细胞,组织,机体中的特殊氨基酸,有着许多重要的生理作用,作为机体内重要的氧化物质,受到大家的普遍重视.目前对于谷胱甘肽的测定还没建立一个既十分灵敏,特异,又十分快速,稳定,经济的方法.谷胱甘肽的各种测定方法各有其优点,有的灵敏度高,有的快速可靠,有的可区分开各种成分;同时也存在各自的不足,有的样本准备过程复杂,有的测定各成分分离不佳,有的需要昂贵设备.一个快速,稳定,特异,灵敏,经济的测定方法,有待进一步建立.参考文献[1】AndersonME.Glutathione:anovervievofbiosynthesisand modulation[J】.Chemico-BiologicalInteractions,1998,111—112:1-14[2】V alenciaE,MD,MarinA,eto1.Glutathione-nutritional andpharmacologicviewpoints:PartI[J】_Nutrition,2001, 17:428.429[3】BakerMA,CemigliaGJ,ZamanA.Microtiterplateassay forthemeasurementofglutathioneandglutathionedisulfide inlargenumbersofbiologicalsamples[J1.AnalyticalBioch—emistry,1990,190:360—365[4】Jia-LiLuo,HammarqvistE,CotgreaveIA,eto1.Deter- minationofintracellularglutathioneinhumanskeletal musclebyreversed-phasehigh??performanceliquidchromato—graphy[J】.JournalofChromatographyB,1995,670:29—36[5】MeisterA,AndersonME.Glutathione[J】.Ann.Rev. Biochem,1983,52:711—760[6】LyonsJ,PfeifferAR,Y uYM,eto1.Bloodglutathione synthesisratesinhealthyadultsreceivingasulfuraminoacid-freediet[J】.ProcNatlAcadSciUSA,2000,97:5o71-5076[7】JonesDP,CarlsonJL,SamiecPS,eto1.Glutathione2期谷胱甘肽的生理意义及其各种测定方法比较,评价139 measurementinhumanplasmaevaluationofsample collection,storageandderivatizationconditionsforanalysis ofdansylderivativesbyHPLC[J】.ClinicaChimicaActa, 1998,275:175-184[8]SeAP,DaltonTP,ShertzerHG.Determiningglutathione andglutathionedisulfideusingthefluorescenceprobe0-phthalaldehyde….ArlyticalBiochemistry,2000,280:80.86[9]WilmoreDW.Nutritionandmetabolicsupportinthe21 stcentury[J].ChineseJoumalofClinicalNutrition,2001,9(1):4-6[10]WilmoreDW.Metabolicsupportofthegastrointe—stinal tract-poteTialgutprotectionduringintensivecytotoxic therapyJ】.ChineseJournalofClinicalNutrition,2001,9(3”39-146[11]AndersonME.Determinationofglutathioneandglutathione disulfideinbiologicalsamples[J】.Methodsinenzymology, 1985,113:548-555[12]SaxenaM,SinghalSSandA wasthiYC.Aspecific,sensitive andrapidmethodforthedeterminationofglutathioneand itsapplicationinoculartissues.Exp[J].EyeRes,1992,55:46】一468[13][14][15]【16】[17]MouradT,MinKL,SteghensJP.Measurementofoxidized glutathionebyenzymaticrecyclingcoupledtoioluminescent detection[J].AnalyticalBiochemistry,2000,283:146-152 ArizaAR,ToribioF,BareaJL.Rapiddeterminationof glutathionestatusinfishliverusinghigh-performance liquidchromatographyandelectrochemicaldedection【J]. JoumalofChromatographyB,1994,656:311-318 PietraAMD,GottiR,BonazziD,eta1.HPLCdeter- minationofglutathioneandL-cysteineinpharmace- uticalsafterderivatizationwithethacrynicacid[J].Jour—nalofPharmaceutical&BiomedicalAnalysis,1994,12 (1):91-98Y angGS,TsaiPJ,ChenWY,eta1.Determinationof extracellularglutathioneinlivesofanaesthetizedratsby microdialysiswithon-?linehigh?-perfo?-rlnanceliquidchrom?- atography[J].JoumalofChromatographyB,1995,667:41.48HedleyDW,ChowS.Evaluationofmethodsformeasuring cellularglutathionecontentusingflowcytometry[J].Cyto- metry,1994,15:349-358(2002-09-23收稿)。
GSH含量测定
GSH含量测定一、原理还原性谷胱甘肽(GSH)是植物细胞重要的抗氧化剂之一，是一个良好的表示氧化胁迫的指标。
GSH+TDBN在pH=7时生成黄色物质，其颜色深浅与GSH的浓度成线性关系。
即：在巯基化合物的存在下，无色的DTNB将被转变成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸。
由于5-巯基-2-硝基苯甲酸在412 nm处具有最大吸收，DTNB的吸收光谱并不干扰巯基的测定。
二、材料、试剂、仪器1、材料：小麦叶片2、试剂(1）GSH标准溶液：称取10mg 分析纯GSH，溶于蒸馏水中，并定容于10ml，即为1mg/ml 之标准母液，用稀释10倍（0.1mg/ml GSH）；(2）5%偏磷酸；(3）0.2mol/L 磷酸钾缓冲液，pH7.0；(4）TDNB试剂：称取39.6mg二硫代双-二硝基苯甲酸（TDNB），用0.2mol/L磷酸钾缓冲液溶解并定容于100ml；(5）1mol/L NaOH溶液。
2、仪器（1）可见分光光度计：4台；（2）离心机：1台（10000转/分）；（3）1/千天平-2台；（4）离心管：3支×16（10ml）（5）刻度试管：4×16支；（10或15ml）（6）普通试管（刻度试管）：7支×4（15*150 标准曲线）（7）刻度吸管：0.5ml-8支； 1ml-8支; 2ml-16支; 5ml-8支；（8）研钵：1×16个；（9）比色杯4套；（10）吸水纸适量；（11）剪刀8把；（12）玻棒8支；三、方法步骤：1、制作标准曲线：取7支刻度试管，编号，按表加入试剂：将上述溶液混合均匀，在室温下显色5min。
在412nm波长下测定吸光度。
以标准溶液中GSH浓度为X，吸光度为y，制作标准回归方程，（并求出GSH含量。
）2 、样品测定：称取植物鲜样0.204g加入少量5%偏磷酸研磨提取，并用5%偏磷酸定容到10ml。
10000rpm 离心10min。
离心后取上清液2 ml，同标准曲线操作。
还原型谷胱甘肽 (reduced glutathione,GSH)含量测定试剂盒使用说明
还原型谷胱甘肽（reduced glutathione,GSH）含量测定试剂盒使用说明产品简介：GSH/GSSG是细胞内最重要的氧化还原对之一。
因此，测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。
DTNB与GSH反应生成复合物，在412nm处有特征吸收峰；其吸光度变化与GSH含量成正比。
试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1ml比色皿、双蒸水产品内容：试剂一×1支，充分溶解于100ml双蒸水，4℃保存试剂二×1支，充分溶解于50ml试剂一中，4℃保存试剂三×1支，充分溶解于10ml双蒸水中，4℃避光保存操作步骤：一、样品前处理：取组织约0.1g，加1ml试剂二，冰上充分研磨，8000rpm4℃离心10min，取上清。
（如上清不清澈，再离心3min）GSH测定操作：测定前将试剂一于25℃水浴20min按每100mg组织加入1000µL生理盐水的比例进行匀浆。
8000g4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
对于非哺乳动物组织：按每100mg组织加入1000µL提取液的比例进行匀浆。
8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
（2）血清（浆）样品：直接检测。
二、测定操作表：测定管空白管样本0.1ml/试剂一0.7ml0.7ml蒸馏水/0.1ml试剂三0.2ml0.2ml 迅速混匀，于412nm测吸光值，并记录第60s的OD值GSH含量计算：GSH标准曲线公式：y=0.0015x+0.0818（x为GSH浓度，y为吸光值）液体中GSH（µmol/L）=[（OD测定管-OD空白管）-0.0818]/0.0015×样品稀释倍数组织中GSH计算：①GSH（µmol/mg prot）=[（OD测定管-OD空白管）-0.0818]/0.0015×样品稀释倍数÷样品蛋白浓度（Cpr）②GSH（µmol/g mass）=[（OD测定管-OD空白管）-0.0818]/0.0015×样品稀释倍数÷样品质量（g）注意事项：（1）样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，以免影响其活力测定时，除试剂一外，其它试剂均需放置在冰上；（2）样本测定前先取1-2个样做预实验，如吸光值太高（超过标准曲线范围，即y ＞0.2时），应先用试剂二稀释到适当倍数，使得吸光值在标准曲线范围内。
氧化型谷胱甘肽含量测定试剂盒说明书
氧化型谷胱甘肽含量测定试剂盒说明书分光光度法50管/48样注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：GSH/GSSG是细胞内最重要的氧化还原对之一。
因此，测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态，也是谷胱甘肽氧化还原循环的主要指标之一。
测定原理：利用2-VP法测GSSG含量。
自备仪器和用品：可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配置：试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体300μL×1支，4℃保存。
试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体6mL×1瓶，4℃保存。
试剂五：液体30μL×1瓶，-20℃保存。
临用前加入0.6 mL试剂三稀释，4℃保存。
试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加入40 mL试剂三溶解，现配现用。
粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min，取上清液（如上清不清澈，再离心3min）待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；8000g 4℃离心10min，取上清液（如上清不清澈，再离心3min）的蒸馏水混匀待测。
3. 血清等液体：直接测定。
测定操作:1. 分光光度计预热30 min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂三置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）水浴中保温30min。
3. 测定管：取1 mL EP管，加入100 μ L上清液，5μ L试剂二，盖紧后混匀，置于37℃水浴30min；依次加入100 μ L试剂四，10 μ L试剂五，700 μ L试剂六，迅速混匀后，立即测定30 s和150 s光吸收A1和A2，计算ΔA=A2-A1。
谷胱甘肽含量参考
1、枸杞中GSH含量范围在6.56-7.37 mg/g 参考文献：枸杞中谷胱甘肽的含量测定研究。
2、GSH广泛存在于动、植物中，在面包酵母、小麦胚芽和动物肝脏中的含量极高，达100-1000mg/100g,在人体血液中含26-34mg/100g，鸡血中含58-73mg/100g，猪血中含
10-15mg/100g,在西红柿、菠萝、黄瓜中含量也较高（12-33mg/100g），而在甘薯、绿豆芽、洋葱、香菇中含量较低（0.06-0.7mg/100g）
参考来源：食品论坛/thread-67897-1-1.html.
3、谷胱甘肽在羊的谷胱甘肽为114-152μg /公斤参考外文：Phenotypic blood glutathione concentration and selenium supplementation interactions on meat colour stability and fatty acid concentrations in Merino lambs-谷胱甘肽浓度和硒表型血液补充肉的颜色稳定性关系和脂肪酸含量很高的羊羔
4、大纲视图能看，主要讲的是小鼠肝的谷胱甘肽的含量也许您能看懂s
张老师参考中文和外文文献以及网站论坛搜索就找到这些，你看中不？。
还原型谷胱甘肽(GSH)检测
还原型谷胱甘肽（GSH）检测
谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，含有巯基的三肽，广泛存在于动、植物中，在生物体内有着重要的作用，如抗氧化作用、整合解毒作用。
谷胱甘肽在体内以还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）两种形式存在，其活性成分为还原型谷胱甘肽，可参与体内三羧酸循环，激活各种酶，对不稳定的眼晶状体蛋白质巯基有抑制作用，从而抑制白内障的发展，抑制角膜及视网膜病变，在角膜损害时能促进上皮组织的修复。
迪信泰检测平台采用高效液相色谱(HPLC)和液质联用(LC-MS)法，可高效、精准的检测还原型谷胱甘肽的含量变化。
此外，我们还提供其他氨基酸及其代谢物检测服务，以满足您的不同需求。
HPLC和LC-MS测定还原型谷胱甘肽样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关质谱参数（中英文）
3. 质谱图片
4. 原始数据
5. 还原型谷胱甘肽含量信息。
谷胱甘肽
药品 基本信息 谷胱甘肽 谷胱甘肽：还原型谷胱甘肽、阿拓莫兰、古拉定 CAS号：70-18-8 EINECS200-725-4 [1] 分子式：C10H17N3O6S 分子量：307.32348 熔点：为189～193°C，晶体呈无色透明细长拉状，等电点为 5.93。 药理作用：本品可促进糖、脂肪及蛋白质代谢，加速自由基排泄， 保护肝脏的合成、解毒、灭活激素等功能。
谷胱甘肽不仅能消除人体自由基，还可以提高人体免疫力。谷胱甘肽维护 健康，抗衰老，在老人迟缓化的细胞上所发挥的功效比年轻人大。 谷胱甘肽还可以保护血红蛋白不受过氧化氢氧化、自由基等氧化从而 使它持续正常发挥运输氧的能力。红细胞中部分血红蛋白在过氧化氢等氧 化剂的作用下，其中二价铁氧化为三价铁，使血红蛋白转变为高铁血红蛋 白，从而失去了带氧能力。还原型谷胱甘肽既能直接与过氧化氢等氧化剂 结合，生成水和氧化型谷胱甘肽，也能够将高铁血红蛋白还原为血红蛋白。 人体红细胞中谷胱甘肽的含量很多，这对保护红细胞膜上蛋白质的巯基处 于还原状态，防止溶血具有重要意义。 谷胱甘肽保护酶分子中-SH基，有利于酶活性的发挥，并且能恢复已被 破坏的酶分子中-SH基的活性功能，使酶重新恢复活性。谷胱甘肽还可以抑 制乙醇侵害肝脏所产生的脂肪肝。 谷胱甘肽对于放射线、放射性药物所引起的白细胞减少等症状，有强 有力的保护作用。谷胱甘肽能与进入人体的有毒化合物、重金属离子或致 癌物质等相结合，并促进其排出体外，起到中和解毒作用。
生理作用或功能 谷胱甘肽广泛存在于动、植物中，在生物体内有着重要的作用。在面包酵 母、小麦胚芽和动物肝脏中的含量很高，达100～1000mg/100g,在人体血液中 含26～34mg/100g，鸡血中含58～73mg/100g，猪血中含10～15mg/100g,在西 红柿、菠萝、黄瓜中含量也较高(12～33mg/100g)，而在甘薯、绿豆芽、洋葱、 香菇中含量较低(0.06～0.7mg/100g)。 机体新陈代代谢产生的过多自由基会损伤生物膜，侵袭生命大分子，加快 机体衰老，并诱发肿瘤或动脉粥样硬化的产生。谷胱甘肽在人体内的生化防御 体系起重要作用，具有多方面的生理功能。它的主要生理作用是能够清除掉人 体内的自由基，做为体内一种重要的抗氧化剂，保护许多蛋白质和酶等分子中 的巯基。GSH的结构中含有一个活泼的巯基-SH，易被氧化脱氢，这一特异结 构使其成为体内主要的自由基清除剂。例如当细胞内生成少量H2O2时，GSH在 谷胱甘肽过氧化物酶的作用下，把H2O2还原成H2O，其自身被氧化为GSSG， GSSG由存在于肝脏和红细胞中的谷胱甘肽还原酶作用下，接受H还原成GSH， 使体内自由基的清除反应能够持续进行。
谷胱甘肽GSH／GSSG氧化还原态各指标的测定
关 键 词 氧 化 还 原 平 衡 态 ； Ｈ／ Ｓ Ｇ 氧 化 还 原 对 ＧＳ Ｇ Ｓ
氧 化还 原 态 （ ｅ ｏ ｔｔｓ 平 衡 是 机 体 内环 境 Ｒ ｄ ｘｓａｕ ） 稳定 （ ｏ ｏｔｓ ） ｈ ｍｅｓ ｉ 的基 本 内 涵 之 一 ， 可 以 影 响 到 ａｓ 它
原态 。
标 准 液具 体 制备 方法见 表 １ 。
表 １ ＧＳ 标 准 曲线 的 制 备 Ｈ
１ 材 料与方 法
研究 对 象 ： ０ ２ ０名健 康 体 检者 ， 体 检 心 、 等 经 肺 功 能正 常 ， 、 血 尿生 化检 查无 异 常。
材 料 ： 光 试 剂 邻 苯 二 醛 （ —ｐ ｔａ ｅ ｙ ｅ 荧 Ｏ ｈｈｌ ｈ ｄ ， ｄ ｏ Ｔ） Ｎ 一 乙基 马 来 酰 亚 胺 （ —ｅｈ ｌ ｌｍｉｅ Ｐ 、 Ｎ ｔｙｍａ ｉ ｄ ， ｅ ＮＥ 购 自 瑞 士 Ｆｕ ａ公 司 ； 光 甘 肽 还 原 型 Ｍ） ｌ ｋ 谷 （ Ｓ 和氧 化 型（ Ｓ Ｇ） 准 品购 自 Ｓｇ 公 司 ， Ｇ Ｈ） ＧＳ 标 ｉ ｍａ 其 余 均 为 国产分 析 纯试 剂 。 主要 仪 器 及设 备 ： 日本 岛 津Ｒ Ｆ一５ ０ ０ ０型荧 光分 光光 度 仪 、 国 贺利 氏低 温 德
性 、 胞 和 器 官 的功 能 ， 细 以及 细 胞 的增 殖 、 化 、 分 凋
血浆 加入 等 体 积 １ ％偏 磷 酸 除 蛋 白 ， 行 Ｇ Ｈ 测 ０ 进 Ｓ
亡、 坏死 等 许 多 生理 、 理 生 理 过程 。 因此 ， 测 体 病 监
液 的氧化 一还原 态 成为近 年来 人 们高 度重 视的 一个 基 础领 域 。 由 于大 量 的体 内生 化反 应 属氧化 一还 原 反应 ， 机体 内存 在着 种类 繁 多 的还 原 型 、 且 氧化 型物 质， 因此 ， 选择 何种 指标 能最 有效 地反 映体液 的氧化
植物叶片中GSH含量测定
植物叶片中GSH含量测定一、实验目的掌握TDBN（巯基试剂显色法）测定GSH含量的原理和步骤。
二、实验原理还原型谷胱甘肽（GSH）是植物细胞内一种重要的抗氧化剂，直接或间接地参与了许多植物生理活动如硫的代谢和转运。
它含有活性巯基，极易被氧化。
GSH能与TDBN反应产生GSSG，GSSG呈黄色，在波长412nm处有最大光吸收。
因此利用标准曲线法可测定样品中GSH的含量。
三、实验仪器天平、冷冻离心机、恒温水浴锅、分光光度计、研钵、移液枪等。
四、实验试剂10µg/mL GSH标准溶液；5%偏磷酸；0.2mol/LpH7.0磷酸钾缓冲液；TDBN试剂五、实验材料小麦叶片六、实验方法1、样品测定取两份0.2g叶片，一份为对照，另一份在0℃处理4min。
两份叶片剪碎后均加入少量5%偏磷酸，冰浴研磨后分别转移到两支试管中，再加5%偏磷酸定容到6mL，各取3mL在离心管中，平衡后在4℃，10000rpm下离心8min。
各取离心后上清2mL，加入4mL磷酸缓冲液和0.4mLTDBN试剂，摇匀后，30℃显色5min。
最后测定它们在412nm下的吸光值。
2、标准曲线制作含量为横坐标，吸光值A为纵坐标，得到标准曲线及其对应的回归方程。
七、实验结果及计算1、GSH含量（µg/g FW）=(C x·Vt)/(Vs·W)C x：根据标准曲线计算的2mL提取液中的GSH含量（µg）；Vt：样品提取液总体积（6mL）；Vs：测定用提取液体积（2mL）；W：样品鲜重（0.2g）。
2、实验结果：（1）标准曲线结果得到标准曲线及回归方程如下图：（2）样品测定结果计算。
GSH含量测定
GSH含量测定一、原理还原性谷胱甘肽(GSH)是植物细胞重要的抗氧化剂之一，是一个良好的表示氧化胁迫的指标。
GSH+TDBN在pH=7时生成黄色物质，其颜色深浅与GSH的浓度成线性关系。
即：在巯基化合物的存在下，无色的DTNB将被转变成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸。
由于5-巯基-2-硝基苯甲酸在412 nm处具有最大吸收，DTNB的吸收光谱并不干扰巯基的测定。
二、材料、试剂、仪器1、材料：小麦叶片2、试剂(1）GSH标准溶液：称取10mg 分析纯GSH，溶于蒸馏水中，并定容于10ml，即为1mg/ml 之标准母液，用稀释10倍（0.1mg/ml GSH）；(2）5%偏磷酸；(3）0.2mol/L 磷酸钾缓冲液，pH7.0；(4）TDNB试剂：称取39.6mg二硫代双-二硝基苯甲酸（TDNB），用0.2mol/L磷酸钾缓冲液溶解并定容于100ml；(5）1mol/L NaOH溶液。
2、仪器（1）可见分光光度计：4台；（2）离心机：1台（10000转/分）；（3）1/千天平-2台；（4）离心管：3支×16（10ml）（5）刻度试管：4×16支；（10或15ml）（6）普通试管（刻度试管）：7支×4（15*150 标准曲线）（7）刻度吸管：0.5ml-8支； 1ml-8支; 2ml-16支; 5ml-8支；（8）研钵：1×16个；（9）比色杯4套；（10）吸水纸适量；（11）剪刀8把；（12）玻棒8支；三、方法步骤：1、制作标准曲线：取7支刻度试管，编号，按表加入试剂：将上述溶液混合均匀，在室温下显色5min。
在412nm波长下测定吸光度。
以标准溶液中GSH浓度为X，吸光度为y，制作标准回归方程，（并求出GSH含量。
）2 、样品测定：称取植物鲜样0.204g加入少量5%偏磷酸研磨提取，并用5%偏磷酸定容到10ml。
10000rpm 离心10min。
离心后取上清液2 ml，同标准曲线操作。
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主要目的：
——测定物质还原性谷胱甘肽（GSH）的含量。
主要原理：
参照 GSH检测分析试剂盒说明书， 5,5 ’–二硫代–双–（2–硝基苯甲酸）能和
谷胱甘肽（GSH）反应产生 2–硝基– 5–巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（ GSSG），
由于 2–硝基– 5–巯基苯甲酸是一黄色产物，通过测定其在412 nm处的最大吸
收可确定样品中谷胱甘肽的含量用纯化的谷胱甘肽（GSH）抗体包被微孔板，制
成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入谷胱甘肽（GSH），再与HRP标记的谷胱甘
肽（ GSH）抗体结合，形成抗体 - 抗原 - 酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物
TMB显色。
TMB在 HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的谷胱甘肽（GSH）呈正相关。
用酶标仪在412 nm波长下测定吸光度（ OD值），通过标准曲线计算样品中谷胱甘肽（GSH）的含量。
实验室签章
一、试剂
——谷还原性胱甘肽（ GSH）测定试剂盒（南京建成生物研究所）
二、仪器设备
—— 96 孔酶标板
—— UV-Vis 可见多功能酶标
仪——旋涡混匀器——离心机
——移液枪及其相应量程枪头
三、实验方法
根据试剂盒说明书具体操作步骤如下:
1.上清液的制备：取稀释后的血清或组织匀浆液 mL，加试剂一应用液 2 mL 混匀， 4000 rpm 离心 10 分钟，取上清液 1 mL 进行显色反应。
2.显色反应：空白管中加入 1 mL 试剂一，标准管加入 20μmol/LGSH标准
液 1 mL，测定管加入上步骤得到的上清液 1 mL，然后各管中分别加入mL 试剂
二、试剂三、 mL 试剂四。
3.混匀，室温静置 5 分钟后，在 412 nm处将酶标板空板进行扫描，准确吸
取 mL 各管反应液加入到新的 96 孔板中，酶标仪测定各孔吸光度（ OD值）。
4.血清中 GSH含量计算公式
GSH含量（ mg/L）
测定 OD值 -空白 OD
值
-3 mmol/L）
×标准品浓度（ 20×10
标准 OD值-空白 OD值
×GSH分子量（ 307）×样本测试前稀释倍数
组织中 GSH含量公式
测定OD值-空白OD值
-3 GSH含量（mg/gprot ）×标准品浓度（20×10 mmol/L）
×GSH分子量（ 307）×样本测试前稀释倍数÷待测组织匀浆液蛋白浓度
（gprot/L ）
参考文献
Lapshina E A, Sudnikovich E J, Maksimchik J Z, et al. Antioxidative enzyme and glutathione S-transferase activities in diabetic rats exposed to long-term ASA treatment [J]. Life sciences, 2006, 79(19): 1804-1811.。