DNA提取常用试剂及操作方法_百替生物
实验十三质粒DNA的提取与鉴定_百替生物
实验十三质粒DNA的提取与鉴定_百替生物实验十三质粒DNA的提取与鉴定一实验目的1.了解分光光度计测定DNA含量的原理和方法。
2.熟悉质粒的基本特性及质粒DNA提取的基本原理。
3.掌握碱变性法提取质粒DNA的基本操作过程。
二实验原理质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA 分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。
细菌质粒大小介于1～200Kb 之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。
质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件又可以使DNA复性。
SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。
所以，SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。
释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境就会变性。
然后，用酸性乙酸钾中和溶液碱性使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA由于分子巨大在短时间内难以复性。
离心后，质粒DNA将留在上清中，染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。
通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。
测定DNA浓度的方法有两种：一是利用分光光度计法测定DNA 的紫外光吸收值；一是利用溴化乙锭荧光强度法测定样品中溴化乙锭发射的荧光强度来计算核酸的含量。
（1）紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm处的吸收峰即可对DNA进行定量。
一般在中性pH环境条件下进行测定，此方法常用于测定比较纯净的DNA样品。
（2）溴化乙锭荧光强度法：溴化乙锭能与DNA结合并嵌入双链中，当受紫外光照射时会激发产生荧光，且荧光的强度与DNA含量成正比。
三药品器材一器材1.电泳仪（包括直流电源整流器和电泳槽两部分）2.台式离心机与高压灭菌锅3.超净工作台、摇床和各式加样枪二试剂1.溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖10mmol/L EDTA，20mmol/L20mMTris-HCl pH8.0100mg/ml RNase A（抽质粒时现加）溶液Ⅰ可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（6.859×104Pa）高压下蒸汽灭菌15分钟，40C冰箱贮存（注：不能将RNase A加入溶液Ⅰ中一起灭菌，RNase A用时现加）。
质粒DNA的提取与电泳鉴定_百替生物
质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。
大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
DNA提取常用试剂及操作方法_百替生物
DNA提取常用试剂及操作方法一、真核细胞DNA的制备与定量制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。
在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。
一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。
这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。
根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
一、试剂准备1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。
2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。
3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。
4．20% SDS5．2mg/ml蛋白酶K6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿7．无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤（一）材料处理1．新鲜或冰冻组织处理：⑴取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。
⑵将匀浆液转移到1.5ml离心管中。
⑶加20% SDS 25 ml，蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml，混匀。
⑷ 60°C水浴1-3hr。
2．培养细胞处理：⑴将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。
⑵离心4000g×5min，去除上清液。
⑶加10倍体积的裂解缓冲液。
⑷ 50-55°C水浴1-2hr。
（二）DNA提取1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。
SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化_百替生物
SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化[适用对象] 生物工程专业[实验学时] 8学时一、实验目的使学生掌握从大肠杆菌中制备质粒DNA的方法，提供实验所需载体。
二、实验原理质粒细菌染色体外的DNA分子，其范围大小在1kb至200kb以上不等。
它独立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。
质粒在基因工程中是最常用的载体。
提取质粒DNA也是基因工程中最常见的实验操作。
提取质粒首先进行大肠杆菌细胞的制备，制备后用碱裂解液进行细胞裂解，使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。
而裂解过程中，细菌蛋白、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。
当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。
离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA，最后用聚乙二醇沉淀法进行质粒的纯化。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
三、仪器设备培养皿摇床天平高速离心机（×12000g）微量移液器（2－20μl、20－200μl、200－1000μl）、电泳仪、微波炉。
四、相关知识点本课程知识点综合：涉及到质粒DNA提取过程、质粒纯化过程和琼脂糖凝胶电泳技术。
多课程知识点的综合：微生物学细菌的培养和质粒抽提技术。
五、实验步骤细胞培养接种培养挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。
离心取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
DNA提取试剂及提取步骤
DNA提取试剂及提取步骤DNA提取相关试剂5 mol/L KAc (pH 5.2)：称取49.07 g KAc溶解于蒸馏水中，定容至100 mL。
3 mol/L NaAc (pH 5.2)：称取40.81 g NaAc·3H2O溶解于蒸馏水中，调pH值至5.2，最后定容至100 mL。
1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)：称取12.114 g Tris Base溶解于蒸馏水中，定容前用HCl调pH值至8.0，定容至100 mL。
0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)：称取18.612 g EDTA溶解于蒸馏水中，溶解过程中加入6-8块NaOH固体以助溶，定容前用NaOH调pH值至8.0，定容至100 mL。
CTAB缓冲液（Cetyl trimethyl ammonium bromide）：分别称取或量取43.83 g NaCl，4 g CTAB，12.5 g 山梨醇（sorbitol），5 g 聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），10 ml EDTA（0.5 mol/L，pH 8.0），5 g 十二烷基肌氨酸钠（sarkosyl），依次加样溶解，65 ℃水浴1 h-2 h使其充分溶解后定容至500 mL。
TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1 mmol/L EDTA (pH 8.0))：分别取1 mL 1 mol/L的Tris-HCl (pH 8.0)，200 μL 0.5 mol/L的EDTA (pH 8.0)，加蒸馏水定容至100 mL，混匀。
PCI（Tris饱和酚：氯仿：异戊醇= 25：24：1）：将3种试剂按上述体积比配制后静置过夜，然后4 ℃避光保存。
CI（氯仿：异戊醇= 24：1）：将2种试剂按上述体积比配制后静置过夜，然后4 ℃避光保存。
50 × TAE电泳缓冲液：称取121 g Tris Base，量取28.55 mL冰乙酸，50 mL的0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)，用蒸馏水充分溶解混匀，定容至500 mL。
DNA提取方法和试剂作用详解
DNA提取方法和试剂作用详解DNA提取是分子生物学和遗传学研究中非常重要的步骤。
其作用是从生物样本中提取出纯度高的DNA，以便进行进一步的实验和分析。
DNA提取的方法和试剂作用有很多种，下面详细介绍一种常用的DNA提取方法和相应试剂的作用。
常用的DNA提取方法有酚/氯仿法、盐酸法、离心法和柱式法等。
下面以酚/氯仿法为例进行介绍。
酚/氯仿法是一种传统的DNA提取方法。
它利用了DNA、RNA和蛋白质在不同溶剂中溶解性的差异来分离DNA。
主要步骤如下：1.细胞破碎：首先将待提取DNA的样本（如动物组织或细菌）进行细胞破碎，使细胞膜破裂释放出细胞质和细胞核。
2.蛋白质沉淀：加入酚/氯仿（以1:1:0.7的比例混合）使细胞膜溶解，并沉淀DNA上层浮游的蛋白质和脂类，然后离心分离。
3.DNA与RNA沉淀：将上层液体转移到新离心管中，加入等体积的异丙醇，使DNA和RNA沉淀，然后离心分离。
4.DNA纯化：将DNA沉淀物洗涤去除残留的溶液和盐类，然后再次离心分离，脱水干燥或用缓冲液溶解。
除了上述步骤外，还需要一系列的试剂来协助完成DNA提取过程。
1.细胞破碎液：用于破裂细胞膜，释放出细胞内的DNA。
破碎液通常是一种含有酶和盐的缓冲液，可以有效地破坏细胞膜结构。
2. 蛋白酶：用于降解细胞核和线粒体中的蛋白质，以达到去除蛋白质的目的。
常用的蛋白酶有蛋白酶K和蛋白酶ase K。
3.酚/氯仿：用于沉淀和去除蛋白质。
酚是一种有机溶剂，它与蛋白质和脂类发生相互作用，从而使它们沉淀到底部。
氯仿能与酚混溶，形成一个界面，便于底部上层液体的分离。
4.异丙醇：用于沉淀DNA和RNA。
异丙醇能够调节DNA和RNA的溶解度，使其在溶液中沉淀下来，从而方便提取。
5.盐溶液：用于洗涤去除DNA沉淀物中的盐类和杂质，以提高DNA的纯度。
常用的盐溶液有EDTA和盐酸。
通过酚/氯仿法，可以得到高质量、高纯度的DNA样品，适用于进一步的PCR、测序和片段长度分析等实验。
DNA提取方法和步骤
DNA提取方法和步骤DNA提取是生物学实验中常见的操作步骤，用于从细胞或组织中提取纯化DNA。
DNA提取的主要目的是获得纯净的DNA样品，以便进行后续的实验，如PCR、限制酶切、测序等。
下面我们将详细介绍DNA提取的方法和步骤。
1.细胞破碎：将待提取DNA的细胞或组织进行破碎，以释放细胞内的DNA。
细胞破碎的方法有很多种，包括机械破碎、酶解、热破碎等。
其中，常用的方法是机械破碎，如用搅拌器或超声波振荡器将样品强力搅拌或振荡，以破坏细胞膜和细胞壁。
2.蛋白质除去：细胞破碎后，通过蛋白酶的作用，将细胞内的蛋白质降解，并与蛋白质结合的DNA一同除去。
常用的蛋白酶有蛋白酶K、丝氨酸蛋白酶等。
需要注意的是，蛋白酶的适宜浓度和作用时间需要根据实验的要求进行优化。
3.DNA纯化：在蛋白质除去后，将细胞产生的碱基、RNA等杂质与DNA分离。
常用的纯化方法有酚/氯仿方法、盐方法和硅胶柱法等。
其中，酚/氯仿方法是最早被使用的DNA纯化方法，其基本原理是将DNA与蛋白质、RNA等杂质分离，从而得到纯净的DNA。
酚/氯仿方法的步骤如下：a.向破碎细胞溶液中加入等体积的酚/氯仿混合液，轻轻摇晃离心管混匀，使DNA分配在有机相和水相之间。
b.离心管在高速离心机中离心15分钟，使混合液分为有机相、界面层和水相三个层次。
c.使用移液器将上清液（水相）转移到新的离心管中，注意避免吸入有机相。
d. 向上清液中加入1倍体积的冰冷异丙醇（Isopropanol），使DNA沉淀。
使用移液器轻轻颠倒离心管使DNA沉淀。
e.在-20℃冷冻保存30分钟或在室温下沉淀15分钟，以便DNA更好地沉淀。
f.在高速离心机中离心DNA沉淀，沉淀时间约为10分钟，沉淀结束后将上清液倒掉。
g.用70%乙醇洗涤DNA沉淀，然后在室温下晾干。
h.使用适量的缓冲液（如TE缓冲液）重新溶解DNA。
4.DNA沉淀：将纯化后的DNA样品进行沉淀，以去除残留的盐、酚、异丙醇等。
DNA抽提的操作步骤
DNA抽提的操作步骤试剂准备：蛋白酶K、白细胞裂解液、苯酚、氯仿、无水乙醇、70%乙醇1.从冰箱取出冰冻的白细胞，将编号和姓名写在登记本上。
待白细胞融化后，向管内加入5ml白细胞裂解液和50ul蛋白酶K（20mg/ml）。
将管内液体摇匀，或者借助移液枪反复吹打混匀。
然后将管子放入60℃水浴锅内，过夜（可以根据孵育的时间长短适当调整温度）。
在水浴的过程中，每隔2-3小时将试管震荡摇匀一次。
2.把水浴锅内的试管取出，将其中的液体转移到15ml试管内（15ml的试管事先做好标记），并依次向试管内加入等体积（即5ml）的酚-氯仿，然后将盖子拧紧。
轻轻上下颠倒混匀（20次左右），然后离心3000rpm，15min。
离心时将离心机的温度调至室温，温度过低会导致有机溶剂凝固。
离心结束后，可以看到试管内的液体分为三层，上层为水相，中间为变性的蛋白质，下层为有机溶剂（酚氯仿）。
3.然后用钝口Tip吸出上层水相转移到干净的试管中（注意：将1ml的Tip尖端减去2-3mm即可得到钝口的Tip，在吸取上层水相的过程中要尽量避免混入蛋白相，动作要缓慢）多分几次转移），然后再加入等体积的酚氯仿，拧紧盖子，颠倒混匀，离心3000rpm，10min。
4.再次用钝口Tip把上层水相转移到干净的试管中，然后向试管内加入2倍体×2），拧紧盖子，缓慢颠倒，积的无水乙醇（无水乙醇的体积=V所吸出的上清的体积即可看到絮状的DNA沉淀析出。
（如果抽提的数量较少，可以将管子放到Cold Room，等数量多了再一起进行下面的操作）5.用黄色Tip把白色絮状的DNA沉淀挑出来，放到70%乙醇（预先准备0.5ml的小管子，加入400ul70%的无水乙醇，洗涤用）中洗涤，重复两次。
6.最后用黄色Tip将DNA沉淀挑出，将DNA连同枪头一同打到1.5mlEP管中。
敞开盖子，室温放置直到乙醇完全挥发，向EP管内加入400ulTE，用Tip头反复吹打，使DNA完全溶于TE，得到DNA溶液。
DNA提取方法
DNA提取方法材料和试剂：-需要提取DNA的样品（例如细胞、组织、血液等）- 细胞裂解缓冲液：含25 mM Tris-HCl（pH 8.0）、50 mM EDTA（pH 8.0）、1% SDS（溶液A）-NaCl溶液：5M-酚-氯仿-异戊醇混合物（溶液B）-无水乙醇-75%乙醇步骤：1.准备样品：根据需要提取的样品类型和数量，准备适量的细胞或组织样品。
注意保持样品的冷链和洁净。
2.细胞破碎：将样品加入一个离心管中，使用适当的方法破碎细胞膜，并释放DNA分子。
可以使用机械方法（如搅拌器、超声波器等）或化学方法（如酶解）来破碎细胞。
3.核酸溶解：向破碎的样品中加入适量的细胞裂解缓冲液（溶液A），彻底混合。
细胞裂解缓冲液中的SDS可以降解蛋白质并保护DNA不被降解。
4.清除蛋白质：向上述混合物中加入相同体积的酚-氯仿-异戊醇混合物（溶液B），轻轻颠倒混合，促使DNA和蛋白质分离。
这个混合物可以通过离心来分离为两个相。
5.分离DNA：将混合物离心约10分钟，离心后可以看到分离为上部红色相（含蛋白质）、中间白色相（含DNA）和下部无色相（含细胞碎片和胆固醇）。
6.收集DNA：使用移液器或管道将中间白色相（含DNA）转移至一个新的离心管中。
同时尽量避免带入上下两部分的液体。
7.沉淀DNA：加入等体积的无水乙醇，轻轻颠倒混合，使DNA沉淀出来。
也可以在室温下静置一段时间，帮助DNA沉淀。
8.洗涤DNA：使用75%乙醇洗涤沉淀的DNA，将其离心5-10分钟，去除乙醇。
9.干燥DNA：使用离心机将离心管倾斜，将剩余的乙醇去除，然后将离心管倒置，待DNA干燥。
10.溶解DNA：使用适量的纯净水或缓冲液溶解DNA，并储存于-20°C 的冰箱中，以避免DNA的降解。
DNA提取方法的关键是将DNA从其他细胞组分中分离出来，同时保护其完整性和纯度。
酚-氯仿法是一种常见的DNA提取方法，该方法简单、快速，适用于各种样品类型。
DNA提取实验方案
DNA提取实验方案
材料与试剂：
1.细胞样本（如血液、组织等）
2.细胞裂解缓冲液（含有蛋白酶K）
3.蛋白酶K
4.乙醇
5.蛋白质沉淀液
6.正丁醇
7.氯仿
8.等离子水
9.TE缓冲液
10.离心管
11.磁珠
12.磁珠悬浊液
13.热拌器
14.离心机
实验步骤：
1.细胞破裂：将细胞样本加入细胞裂解缓冲液中，加入适量蛋白酶K，放入热拌器中破裂细胞，使DNA溶解在缓冲液中。
2.蛋白质沉淀：加入等体积的蛋白质沉淀液，轻轻混匀，离心使蛋白
质沉淀。
3.DNA沉淀：将上清液转移至新的离心管中，加入适量的乙醇，轻轻
混匀，使DNA沉淀。
4.DNA纯化：将DNA沉淀用等离子水悬浊，加入等体积的正丁醇和氯仿，混匀后离心，取上清液，加入等量的等离子水和TE缓冲液。
5.纯化DNA：将上清液转移至带有磁珠的离心管中，加入磁珠悬浊液，混匀后在离心机中进行离心，使DNA和磁珠结合。
6.洗涤DNA：将离心管中的上清液丢弃，加入70%乙醇洗涤DNA，多
次洗涤后去除乙醇，干燥磁珠。
7.溶解DNA：最后用等离子水或TE缓冲液溶解DNA，即可用于后续的
实验。
通过上述步骤，可以从细胞样本中提取出纯净的DNA，用于后续的分
子生物学实验。
DNA提取是一项基础而重要的技术，在分子生物学和遗传
学研究中具有广泛的应用价值。
希望以上方案可以帮助您顺利进行DNA提
取实验。
质粒DNA提取(碱变性法)_百替生物
第 1 次课 6 学时注：本页为每次课教案首页实验四、质粒DNA提取（碱变性法）一质粒1 质粒（plasmid）：是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传。
质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。
2 质粒与宿主细胞的关系（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居”宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响，宿主离开质粒照样的生存下去。
（2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。
（3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿主细胞的补偿。
（4）质粒赋于宿主各种有利的表型，使宿主获得生存优势。
3 质粒提取实验在生物化学与分子生物学中具有非同寻常的意义。
是基因工程中常用的载体之一。
转基因的时候不会转移直接的外源基因，需要把外源基因连接到载体上进行转化。
载体的存在就像一个运输工具一样，把目的基因转到受体生物中。
任何的目的基因的克隆，外源基因的转入，载体的构建都绝对的离不开质粒的提取过程。
4 常用的载体质粒：是通过DNA重组技术构建而成的。
pUC18, pUC19,T-EASY等。
二提取三碱变性碱变性法主要是利用染色体DNA和质粒DNA碱性环境中变性和复性的差异来分离出质粒DNA。
染色体DNA 分子量比较大，在碱性环境中（高pH）变性，双链解拆开，抽提时由于机械剪切力的作用，环状断裂成线状，当pH 恢复中性时，无法恢复成环状，就呈网状与蛋白质一起通过离心沉淀下来。
质粒DNA 分子量小，在碱性环境中（高pH），双链解旋，但不拆开,当pH恢复中性时，恢复成环状。
由于分子量小，所以离心沉淀时，不下沉，保留在上清溶液中。
四、实验步骤与方法1 接含PUC18质粒的单菌落于3ml Amp+LB液体培养基中LB液体培养基：分别称取10g 胰蛋白胨、5g 酵母提取物、5g NaCL于1L 烧瓶中，950mlddH2O，5MNaOH调pH到7.0，补充至ddH2O1L，高压灭菌。
细胞DNA提取步骤
BIOG细胞DNA提取步骤
需自行准备的材料：无水乙醇、PBS及1.5mL离心管。
1.取出析出液和洗涤液，按以下操作：
a)析出液：4.5mL加入25.5mL无水乙醇；9mL加入51mL无水乙醇。
b)洗涤液：9mL加入21mL无水乙醇；18mL加入42mL无水乙醇。
c)配制好的析出液如出现沉淀，可在37℃溶解，摇匀后使用。
2.细胞处理：a)培养板培养的单层贴壁细胞，弃培养基，PBS清洗一遍，弃PBS；
b)培养瓶培养的贴壁细胞应先用胰酶消化，处理为细胞悬液，细胞量在105-106为佳，1,000 rpm离心5分钟，彻底弃去上清，加入100μL PBS振荡至细胞悬浮；
c)培养的细胞为悬浮细胞，1,000rpm离心5分钟，彻底弃去上清，加入100μL PBS振荡至细胞悬浮。
3.加入200μL裂解液，20μL消化液A，振荡混匀，室温放置5分钟。
4.加入20μL消化液B，充分振荡混匀，56℃水浴10分钟至细胞完全裂解。
5.加入500μL析出液，轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响DNA的提取与后续实验。
6.将吸附柱放入收集管内，将上述溶液转入吸附柱内，静置2分钟，12,000rpm4℃离心1分钟，弃收集管内废液。
7.将吸附柱放回收集管内，加500μL洗涤液至吸附柱内，静置2分钟，12,000rpm4℃离心1分钟，弃收集管内废液。
8.将吸附柱放回收集管内，12,000rpm4℃离心2分钟，离去残留的洗涤液。
9.取出吸附柱，放入新的1.5mL离心管内，加入50-200μL洗脱液，静置3分钟，12,000 rpm4℃离心2分钟，收集DNA溶液。
提取的DNA即可用于下一步实验或-20℃保存。
动物肝脏DNA的提取及检测_百替生物
５．核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型 DNA 的移动速度次序为：共价闭环 DNA＞直线 DNA＞开环的双链环状 DNA。 ６．琼脂糖凝胶电泳的特点 天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖 （ agarose ，约占 80% ）及琼脂胶（ agaropectin ）组 成。 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质， 不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸 性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能 产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质 作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用 琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。 ①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。 ②琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占 98%~99%） ，近似自由电泳，样品扩散较自由 电流， 对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 ③琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。 ④电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 ７．常用染料 EB（溴化乙锭 Ethidium Bromide，EB） ： 溴乙锭染料全名是 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐，是诱变剂，可与核酸结合，在紫外光下 呈黄色荧光。使用时一定要戴手套。 EB 废液要经过处理才能丢弃。 ①在 300nm 波长的紫外光照射下发出荧光。在适当的下，荧光强度与 DNA 片段的大小(或数量) 成正比。 可插入碱基与碱基之间造成移码突变。 DNA（RNA）定量 分析：可用紫外光谱 分析，原理是 DNA（RNA）分子在 260 nm 处 有特异的紫外吸收峰，且吸收强度与 DNA(RNA)的浓度成正比。此外，还可通过琼 脂糖凝胶电泳上显示的 DNA（RNA）带的亮 度来分析，因为 EB 作为一种荧光染料，能插 入 DNA(RNA) 的碱基对平面之间而结合于其 上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA(RNA)分子上 EB 的量与 DNA 分子的长度和数量成正比。在电 泳时加入已知浓度的 DNA（RNA）Marker 作为 DNA（RNA）分子量及浓度的参考，样品 DNA(RNA) 的荧光强度就可以大致 表示 DNA（RNA）量的多少。 ８．提纯的思路 ①基因组 DNA 的特性：分子量较大、所提取的 DNA 片段的大小：100 — 150kb，易断（如何保证 DNA 分子的完整性？） ②组织和细胞的破碎 ③要去除的物质： 蛋白、多糖、脂类、RNA 和小分子物质
基因组DNA抽提操作流程
基因组DNA抽提操作流程一、原理与意义先用细胞裂解液对已制备好的组织匀浆充分裂解，然后用蛋白酶去除其中的蛋白，再用氯仿一次抽提（无需用酚抽提）、预备液沉淀、RNase 去除RNA、乙醇再沉淀即可得到完整DNA。
该方法适用于从人或动物的各种组织、血液、培养细胞、G+/G－细菌中快速抽提基因组DNA。
抽提出来的DNA能用于几乎所有的分子生物学实验，如DNA梯度分析、PCR、限制性内切酶反应、克隆、Southern Blot分析等。
二、试剂及其配制抽提试剂盒购于上海生工公司，内含以下试剂：1.TE缓冲液：PH8.0，由10 mM Tris HCl和1 mM EDTA配成。
2.RNase A（3 mg）：使用前加入300 µl无菌双蒸水，煮沸10 min后使其自然冷却后使用，-20 ℃冻存。
3.Proteinase K（12 mg）：使用前加入600 µl无菌水，分装成小份，-20 ℃冻存。
4.Cell Lysis Solution与Precipitation Solution：溶液出现絮状沉淀50 ℃加热溶解后使用。
5. 1.2 mol/L NaCl。
冰冷乙醇和氯仿自备。
三、实验器材水浴锅、普通冰箱、1.5/2 ml离心管、移液器及枪头、紫外分光计、离心管架、剪刀、镊子、滤纸等。
四、操作步骤1.组织匀浆制备：取30 mg左右新鲜组织，加600 μl TE缓冲液，手工匀浆数次。
2.细胞裂解：吸取300 µl匀浆加600 µl Cell Lysis Solution，混匀。
3.消化蛋白：再加入9 µl Proteinase K(可适当增加)混匀，置于55 ℃水浴30 min以上（可达2.5 h），其间上下混匀几次。
4.氯仿抽提：加入600 µl氯仿（用户自备），轻柔上下混匀，不能太剧烈，以保证DNA的完整性。
5.沉淀：在台式离心机上，10000转/分，室温离心2 min。
哺乳动物基因组DNA的提取_百替生物
二、电泳加样 用移液器吸取 10 ul 已加入上样缓冲液的 DNA 样品加入加样孔。
三、电泳 接通电泳槽和电泳仪的电源，最高电源不超过 5V/。 当溴酚蓝染料移动至加样孔 3 cm 处时，停止电泳，将凝胶放在紫外灯下观察。DNA 存在处应显示
实验仪器和材料
低温冷冻离心机、烤箱、制冰机、移液器、冰箱，水平电泳槽、电泳仪、匀浆器、TRIzol、氯仿、 异丙醇、75％乙醇（DEPC H2O）配制、DEPC H2O
实验步骤
1. 取 50－100mg（新鲜或－70℃及液氮中保存的组织均可）置 1.5ml 匀浆器中，加入 1ml TRIzol 充分匀浆，室温静置 5min。
实验原理
DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动有电荷效应和分子筛效应。DNA 分子在高于等电点的 pH 溶液中带负 电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等 量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度 取决于分子筛效应，即 DNA 分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的 DNA 片段泳动速度不 一样，可进行分离。DNA 分子的迁移速度于相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离 相对分子质量的 DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的 DNA 分子。
实验仪器和材料
0.8%琼脂糖凝胶（含 EB），1×TBE 电泳缓冲液，凝胶成像仪，DNA 标准带（DL-2000），水平电泳 槽，电泳仪，小鼠基因组 DNA
试剂盒DNA提取详细操作步骤
试剂盒DNA提取详细操作步骤一、试剂盒打开后需要准备的工作1、Proteinase K（蛋白酶K）的溶解①取4.5ml双蒸水加入蛋白酶K粉中使其充分溶解②将溶解好的蛋白酶K溶液分装进小离心管，每管100u l～200ul③将分装好的Proteinase K放入-20℃冰箱中保存，使用期限为12个月2、组织抑制剂（Inhibitor Removal buffer）的调配加入20ml无水乙醇（absolute ethanol）颠倒混匀并在空白方框处打钩3、洗液（wash buffer）的调配加入80ml无水乙醇（absolute ethanol）颠倒混匀并在空白方框处打钩二、组织DNA提取（试剂盒）1、组织样品处理与消化①将采集来的样品剪碎（≤0.1cm）洗净保存液。
②加入组织破解液Tissue-lysis 200ul 蛋白酶K 40ul然后放入55℃水浴锅内3个小时使其充分消化。
2、DNA提取①在消化好的组织样品中加入结合液binding buffer 200ul 然后放入70°水浴锅中10分钟。
②再加异丙醇100ul 混合均匀吸取上清液放入柱体中，然后离心8000g一分钟。
③倒掉底液，加500ul组织抑制剂Inhibitor Removal 然后离心倒掉底液④加洗液washing buffer500ul离心（洗液加两次）⑤在70℃预热Elution Buffer，然后将洗好的柱体下部分丢掉，换新的离心管加入Elution Buffer200ul溶解10分钟离心保留底液放-20℃保存。
三、细胞DNA的提取（试剂盒）1、组织样品处理与消化①将带有培养基的样品用PBS清洗干净8000rpm/1min离心，倒掉上清②加PBS200ul振荡摇匀使之样品成为单个细胞的悬浊液③加200ul Binding Buffer，40ul蛋白酶K 混合均匀放入70℃水浴锅内消化10分钟。
2、DNA提取①加异丙醇100ul 混合均匀吸取上清液放入柱体中，然后离心8000g一分钟。
dna提取方法
dna提取方法
DNA提取是分离和纯化细胞内的DNA分子的过程。
以下是常用的DNA提取方法：
1. 经典的酚-氯仿提取法：将细胞裂解并溶于酚-氯仿溶液中，通过离心分离DNA上清液和蛋白质/ RNA/酚相，然后分别用异丙醇沉淀和洗涤 DNA，最后用缓冲液溶解 DNA。
2. 盐溶解法：将细胞裂解并使用盐水缓冲溶解 DNA，然后离心去除蛋白质和碎细胞碎片。
最后，通过异丙醇沉淀 DNA，洗涤和溶解 DNA。
3. 磁珠法：利用表面修饰的磁珠、离心和磁场来分离和纯化DNA。
磁珠上会吸附 DNA，然后用缓冲液洗涤和溶解 DNA。
4. 硅胶柱法：利用硅胶膜在碱性条件下与 DNA 结合，然后用缓冲液洗涤和溶解 DNA。
5. 腐蚀酶法：通过腐蚀细胞壁和细胞膜来释放细胞内 DNA，然后离心去除细胞渣。
最后，通过异丙醇沉淀 DNA，洗涤并溶解 DNA。
这些方法都可以从不同来源（如细菌、动植物组织和血液）中提取 DNA，以便分析、克隆或测序。
提取的 DNA 可用于分子生物学研究、犯罪鉴定、基因组学研究等各种应用。
提取dna的方法及步骤
提取dna的方法及步骤提取DNA的方法及步骤DNA（脱氧核糖核酸）是构成生物遗传信息的基本单位，因此，准确提取DNA样本是进行遗传研究、基因工程和犯罪侦查等领域的重要步骤。
以下将介绍几种常见的DNA提取方法及其步骤。
方法一：酚氯仿法酚氯仿法是一种常用的DNA提取方法，其步骤如下：1. 收集样本：可以是人体组织、血液、细胞培养物等。
确保样本新鲜，并避免受到污染。
2. 细胞破碎：将样本加入含有细胞破碎缓冲液的离心管中，通过离心将细胞沉淀。
3. 酚氯仿提取：将沉淀加入酚氯仿混合液中，轻轻混匀，并离心以分离DNA。
4. 沉淀DNA：将上清液转移到新的离心管中，加入冷乙醇沉淀DNA。
5. 洗涤：用70%乙醇洗涤沉淀的DNA，以去除杂质。
6. 干燥：将洗涤后的DNA在室温下晾干或用低温真空干燥器加速干燥。
方法二：盐析法盐析法是一种简单易行的DNA提取方法，其步骤如下：1. 细胞破碎：将样本加入含有细胞破碎缓冲液的离心管中，通过离心将细胞沉淀。
2. 盐析提取：加入高盐缓冲液使DNA与其他核酸和蛋白质分离。
3. 沉淀DNA：将上清液转移到新的离心管中，加入冷乙醇沉淀DNA。
4. 洗涤：用70%乙醇洗涤沉淀的DNA，以去除杂质。
5. 干燥：将洗涤后的DNA在室温下晾干或用低温真空干燥器加速干燥。
方法三：硅胶柱法硅胶柱法是一种高纯度DNA提取方法，其步骤如下：1. 细胞破碎：将样本加入含有细胞破碎缓冲液的离心管中，通过离心将细胞沉淀。
2. 硅胶柱处理：将细胞沉淀加入硅胶柱中，经过洗涤和离心，将DNA吸附在硅胶柱上。
3. 洗涤：用洗涤缓冲液洗涤硅胶柱，以去除杂质。
4. DNA洗脱：加入低盐缓冲液，使DNA从硅胶柱上洗脱出来。
5. 洗涤：用70%乙醇洗涤洗脱后的DNA，以去除杂质。
6. 干燥：将洗涤后的DNA在室温下晾干或用低温真空干燥器加速干燥。
方法四：酶解法酶解法是一种特异性较高的DNA提取方法，其步骤如下：1. 细胞破碎：将样本加入含有细胞破碎缓冲液的离心管中，通过离心将细胞沉淀。
DNA提取实验
DNA提取实验DNA提取是现代生物学研究的基础实验之一，它可以从生物体内分离和纯化DNA分子，为各种分子生物学技术和研究提供重要的基础。
本实验旨在介绍DNA提取的基本步骤和操作技巧。
材料和仪器：1. 新鲜的生物样本（如水果、蔬菜、口腔拭子等）2. DNA提取试剂盒3. 离心管4. 加热器5. 离心机6. 显微镜实验步骤：1. 样本处理：a) 将生物样本取出，如水果则切成小块，口腔拭子可直接使用。
b) 将样本放入离心管中。
c) 使用试剂盒提供的试剂，在样本中加入适量的细胞裂解缓冲液。
d) 轻轻摇动离心管，使样本与缓冲液均匀混合。
e) 将离心管放入加热器中，在60摄氏度恒温加热20-30分钟，以促进细胞的破裂和DNA的释放。
2. 细胞裂解：a) 将加热后的样本离心管取出，稍微晃动离心管使样本充分混合。
b) 加入适量的蛋白酶，用离心管盖密封离心管，并再次摇动离心管混合。
c) 将离心管放入加热器中，以高温（通常为60-65摄氏度）恒温孵育10分钟，以使蛋白酶发挥作用，降解细胞蛋白。
3. DNA沉淀：a) 将加热后的样本离心管取出，加入等体积的冷异丙醇，并摇动离心管使两者充分混合。
b) 将混合溶液离心10-20分钟，以最大速度离心沉淀DNA。
c) 抽掉上层溶液，离心沉淀的DNA。
d) 加入适量的70%乙醇洗涤一次，以去除残留的盐和其他杂质。
e) 将离心管倒置于纸巾上，待乙醇挥发后，加入适量的去离子水重新溶解DNA。
4. DNA纯化：a) 使用显微镜观察提取的DNA溶液中是否有明显的纹理和颜色，以确保DNA提取的成功。
b) 使用测量纯度和浓度的仪器对提取的DNA进行定量分析，并记录结果。
c) 将DNA溶液保存在低温冷冻条件下，以防止DNA的降解和损伤。
实验注意事项：1. 实验前需佩戴实验手套和口罩，防止污染和细菌感染。
2. 操作过程中需注意无菌操作，避免污染。
3. 实验前要确保所有仪器和材料已经正确消毒和清洗。
提取dna的实验操作方法
提取dna的实验操作方法
提取DNA的实验操作方法主要包括以下步骤：
1. 样本收集：收集所要提取DNA的生物样本。
常见的样本来源包括血液、唾液、细胞培养物、植物组织等。
2. 细胞破碎：将收集到的样本进行细胞破碎，使DNA释放出来。
常用的方法有物理破碎（如超声波破碎、酶解）和化学破碎（如细胞裂解液、洗涤液）等。
3. DNA溶解：将破碎后的细胞样本转移至含有盐和缓冲液的试管中，使DNA 溶解。
4. 蛋白质沉淀：加入蛋白酶K等蛋白质沉淀剂，将样品中的蛋白质去除。
5. DNA沉淀：加入过冷酒精或异丙醇等沉淀剂，使DNA凝结成白色絮状物，然后通过离心将DNA沉淀下来。
6. 洗涤：将沉淀下来的DNA进行洗涤，以去除杂质和残留的沉淀剂。
常用的洗涤缓冲液包括70%乙醇等。
7. 干燥和溶解：将清洗后的DNA样本用空气或真空干燥，然后用缓冲液或去离子水使其溶解。
8. 测定DNA浓度和纯度：使用分光光度计或其他的测定方法，测定提取到的DNA的浓度和纯度。
以上是提取DNA的基本实验操作方法，实际操作中可能会根据具体的实验目的和样本类型进行适当的调整和改进。
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DNA提取常用试剂及操作方法一、真核细胞DNA的制备与定量制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。
在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。
一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。
这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。
根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
一、试剂准备1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。
2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。
3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。
4．20% SDS5．2mg/ml蛋白酶K6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿7．无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤（一）材料处理1．新鲜或冰冻组织处理：⑴取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。
⑵将匀浆液转移到1.5ml离心管中。
⑶加20% SDS 25 ml，蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml，混匀。
⑷ 60°C水浴1-3hr。
2．培养细胞处理：⑴将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。
⑵离心4000g×5min，去除上清液。
⑶加10倍体积的裂解缓冲液。
⑷ 50-55°C水浴1-2hr。
（二）DNA提取1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。
2. 离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。
3. 加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。
4. 加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。
如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。
5. 加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。
6. 加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。
7. 待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。
8. 沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min ，弃上清液。
9. 室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100ml TE溶解过夜。
(三）DNA定量和电泳检测1.DNA定量：DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。
因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。
如用1cm 光径，用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000。
DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。
若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。
OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。
2.电泳检测：取1μg基因组DNA用行0.8%琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA的完整性，或多个样品的浓度是否相同。
电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带。
三、注意事项1. 所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。
2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。
3. 用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。
4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等）目的。
如要求更高，可进行DNA纯化。
二、质粒DNA的碱裂解法提取与纯化细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。
2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。
使用前临时配置。
3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH4.8。
5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。
4℃保存备用。
4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。
1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。
15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
5.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）7. 5×TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。
15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
8．溴化乙锭（EB）：10mg/ml9.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。
10. 6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。
11. 1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。
缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TBE），即可上样。
二、操作步骤1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g 振荡培养过夜（约12-14hr）。
2.取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。
4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。
5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。
溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
6.加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g × 10min。
7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×15min。
8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。
9.沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。
三、质粒DNA的电泳检测观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。
该物质含有一个可以嵌入DNA 的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。
DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。
这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。
因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。
取制备的质粒DNA 1-2μl，加适当loading buffer混匀上样,采用 1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。
四、注意事项本裂解法小量制备质粒 DNA重复性好，一般无麻烦。
若所提取质粒 DNA不能被限制性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。
三、λ噬菌体DNA提取λ噬菌体是最早使用的克隆载体，λ噬菌体的基因组是一长度约为50kb的双链DNA分子，它在宿主细胞有两种生活途径，其一是裂解生长，环状DNA分子在细胞内多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌再进行下一次感染；其二是溶源性生长，即感染细胞内λ噬菌体DNA 整合到宿主菌染色体DNA中与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不裂解。