猪链球菌9型钦州株的分离及其cps9H基因序列分析
猪链球菌9型钦州株的分离及其cps9H基因序列分析
９ ．％； ９５ 与河 南 Ｈ 湖北 ＨＢ ２分别 为 ９ ．％和 ９ ． ； 广 Ｎ、 ２ ８ ２ ９２ 与 ％
州 Ｇ ０６ Ｚ ５ ５同 源 性 最 低 ， 为 ９ ． 。 仅 ７２ ％
２２ Ｐ ． ＣＲ 扩 增 结 果
的病料 进 行 细 菌分 离 、Ｃ Ｐ Ｒ扩 增 ， 并进 行 测 序 分析 ， 以期 为
Ｓ ９的分子流 行病 学提 供数 据 支持 。 Ｓ
１ 材 料 与 方 法
１１ 标 准 毒 株 及 主 要 试 剂 ．
扩增 产物 经 １ ／ 脂 糖凝 胶 电泳 ， 到单 一 的约 ３ ０ ０ｇＬ琼 得 ９ ｂ ｐ大小 的 目的 片段 （ １ 。 图 ）
１２ 引 物 ．
２０ ０ｂ ０ ｐ
根 Ｓ ９荷 兰 ５ １ Ｓ ２ ８株设 计扩 增 ｃ ｓＨ基 因 弓 物 ：ｐ９ ： ｐ９ １ ｃ ｓ Ｈ１
５一 ＧＧＣ ＴＡＣ ＡＴＡＴ ＡＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣ一 ： ｐ ９ ３ ｃ ｓ Ｈ２： Ｃ ５ 一 ＣＧＡＡＧ
Ｔ Ｔ Ｔ Ｇ Ｃ Ａ Ｔ 一 预 期扩 增片段 长约 ３ ９ ｂ 。 Ａ Ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ｇ ３， ８ ｐ
Ｇ ｃ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ａ ０ ： Ｔ Ｔ Ｔ Ａ Ａ Ａ Ｃ Ｇ Ｔ Ｇ １ ’Ａ Ｔ Ｇ ＴＣＴＴ Ａ Ａ Ｇ 口 Ａ Ｔ Ａ ＡＴ Ａ Ａ Ａ Ｔ ＡＡ １ Ａ Ｃ Ａ Ｔ Ａ Ａ ０ ＡＣＡＧ６
Ｍｇ １ ２ ｏ ／） Ｌ 上下 游 引物 （５ｐ ｏ ／ Ｌ 各 ０５ Ｌ Ｃ２ ５ｍｍ ＬＬ １ ， （ ２ ｍ ＬＩ ） ． ｚ ， 加 ｄ Ｈ２ ｄ Ｏ补 至 ２ Ｌ， Ｐ Ｒ仪 中 ，５℃ 预 变性 ５ｍｉ ；４ ５ 置 Ｃ ９ ｎ ９
猪链球菌9型国内分离株毒力基因的检测及小鼠免疫试验
猪链球菌9型国内分离株毒力基因的检测及小鼠免疫试验修福晓;陆承平【期刊名称】《中国兽医科学》【年(卷),期】2008(38)2【摘要】通过检测7株猪链球菌9型(SS9)国内分离株的毒力基因,比对7株SS9荚膜合成基因cps9j的300 bp碱基序列,以及进行7株SS9对小鼠的毒力试验和免疫保护试验,初步探讨了国内SS9的毒力特性。
结果显示,7株SS9均缺失胞外因子(epf)和溶血素(sly)基因,溶菌酶释放蛋白基因(mrp)存在于GZ0665和GD0606株,orf2仅存于GZ0665株;病猪脑脊液分离株GZ0665与从健康猪扁桃体分离的6株SS9的cps9j同源性低;在7株SS9分离株和SS2分离株HA9801中,只有GZ0665和GD0606株能致死小鼠;用灭活的GZ0665菌株免疫的小鼠对同源菌株GZ0665及GD0606株攻击的保护率均为100%(10/10),用灭活的GD0606和未灭活的GD0627菌株免疫的小鼠对GD0606株攻击的保护率分别为80%(8/10)和50%(5/10),而对GZ0665株攻击的保护率分别为60%(6/10)和30%(3/10)。
证实,SS9病猪脑脊液分离株的毒力基因有别于SS9健康猪扁桃体分离株和SS2。
表明,小鼠可以用来区分SS9病猪脑脊液分离株与健康猪扁桃体分离株的致病力。
【总页数】4页(P97-100)【关键词】猪链球菌9型;毒力基因;cps9j基因;小鼠【作者】修福晓;陆承平【作者单位】南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室【正文语种】中文【中图分类】S852.611【相关文献】1.国内病猪中猪链球菌2型分离株溶血素基因的PCR检测及序列分析 [J], 倪艳秀;陆承平;何孔旺;俞正玉;温立斌;吕立新;张雪寒;郭容利;周俊明;茅爱华2.4株猪链球菌2型分离株主要毒力因子(MRP、EF)的全基因序列分析 [J], 倪艳秀;段志涛;何孔旺;陆承平3.猪链球菌2型安徽分离株毒力基因cps2J、mrp、epf、sly的检测及其序列分析[J], 许大文;魏建忠;孙裴;殷宗俊;赵洪武;李郁4.猪链球菌2型四川分离株毒力基因的检测及其序列分析 [J], 赵永刚;王伟伟;田晓灵;王君玮;王志亮;赵云玲;王清华;张维;陈义平;刘华雷;王华5.血清2型猪链球菌河南分离株毒力基因的鉴定及其cps2j全基因序列分析 [J], 张九州;李乔晶;郑逢梅;常洪涛;陈陆;杨霞;姚惠霞;王川庆;迪丽拜尔·阿木提因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪链球菌9型钦州分离株cps9H基因序列分析
链球 菌增 菌培 养基 购 自中 国进 出 口商 品技 术研 究 所 。质粒 Ｄ Ａ小量提 取试剂 盒 购 自杭 州博 日科 技 Ｎ
有 限公 司 。Ｌ 培 养 基 购 自 Ｇ Ｂ Ｏ Ｂ Ｉ Ｃ Ｌ公 司 ； Ｔ Ｂ ＣＡ （ 代 十六烷基 三 甲胺 ） 自 Ａ ｒｓｏ 司 。 溴 购 ｍ ｅｃ 公 １ ４ 液体 培 养 ． Ｄ Ａ抽 提前 ２ ４株 Ｓ ９钦州 分离 株接 种 Ｎ ４ｈ将 Ｓ 于含 １ Ｏ％ 马血 清 的链 球 菌 增 菌 培 养 基 内 培 养 ，
ＧＧＣＴＡＣＡＴＡＴＡＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣ 一 ３、 ｐ ９Ｈ２：５、 ；ｃ ｓ 一
Ｃ Ｃ Ａ ＴＴＴ Ｇ ｃＡ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ｇ一３， 物 由宝生 物 工 、 引
程 （ 连 ） 限公 司合成 ， 大 有 预期 扩增 片段长 ３ ９ｂ 。 ８ ｐ
１ ３ 主 要 试 剂 ．
为 ９． ６ ７％ 一１０％ 和 ９ ． ％ ～１０％ 。 ｏ １５ ０
诊 断和预 防控 制提供科 学依 据 。 来自１ 材 料 与 方 法
１１ 细菌 、 ． 菌种 和克隆 载体 所用 ４株 Ｓ ９钦 州 分离株 Ｑ ２ ／ ８ Ｑ ２ ／ ８ Ｓ Ｚ４０ 、 Ｚ６０ 、 Ｑ ３／ Ｓ Ｑ ４ ／８均 由本 实 验 室 分 离 鉴 定 和 保 Ｚ００ 、 ｚ ９Ｏ
靶
３ ．广西大学动物科学技 术学 院 ， 南宁 ５ ０ ０ ） ３０ ５
中图 分 类 号 ：８ ８ ２ ５ １ ￥ ５ ． ８ ．１ 文献 标 识 码 ： Ｂ 文章 编 号 ：０ ２— ２ ５ ２ １ ）６— ３ ３ ４ １０ ５ ３ （０ ０ ０ ０ ２ 一ｏ
摘 要 ： 据 已发 表 的 猪 链 球 菌 ９型 （ Ｓ ） 兰 ５ １ 根 Ｓ９ 荷 ２８分
钦州地区猪链球菌的分离鉴定与药敏试验
钦州地区猪链球菌的分离鉴定与药敏试验摘要采集疑似链球菌病的猪病料进行细菌分离,根据培养特性、染色特点、形态观察、生化试验鉴定为1株猪链球菌;药敏试验表明,该分离菌株对氨苄西林、包孢他啶、万古霉素、头孢氨苄、克林霉素、恩诺沙星高度敏感,对多黏菌素、环丙沙星、卡那霉素中度敏感,对红霉素、青霉素低度敏感,而对土霉素、四环素、强力霉素、复方新诺明有明显耐药性。
关键词猪链球菌;分离鉴定;药敏试验;广西钦州猪链球菌病是现代养猪业中的一种重要传染病,主要引发猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎和败血症[1]。
2型猪链球菌在全球范围内都是优势流行株。
2005年6—7月发生在四川省资阳、内江等地区的2型猪链球菌感染事件造成了极大的经济损失,引起社会广泛关注[2]。
另外,1型和9型是除2型外的流行株[3-4],也可使猪发病。
虽然理论上有很多药物能治疗猪链球菌病,但随着抗菌药物的广泛使用以及临床中不合理用药,使得病原菌的耐药现象日趋严重[5-6]。
本研究对地区猪场送检的疑似链球菌病病死猪的淋巴结、肺、脾、扁桃体等病变组织进行了细菌的分离鉴定,对分离菌进行了药敏试验,以期为该病的临床防治提供科学依据。
1材料与方法1.1试验材料试验病料为采自广西钦州地区某猪场疑似猪链球菌发病的仔猪淋巴结、肺、脾、扁桃体等病变组织。
试验试剂为:绵羊血琼脂平板、绵羊血琼脂斜面、普通琼脂培养基、营养肉汤、巧克力培养基等,均按常规方法制备,4 ℃冰箱保存备用;药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司;细菌微量发酵管购自杭州天和微生物试剂有限公司。
1.2细菌分离采用无菌法将采集的疑似链球菌病发病的仔猪淋巴结、肺、脾、扁桃体等病变组织,划线接种于含有8%绵羊血的琼脂平板、巧克力培养基和营养琼脂平板中,37 ℃培养24 h,观察细菌生长特性。
挑取绵羊血平板上针尖大小、表面光滑、灰白色、圆形、半透明、边缘整齐的单个菌落进行革兰氏染色。
革兰氏染色阳性、有链状排列或成对的球形细菌为可疑菌落,接种于葡萄糖肉浸液肉汤液体培养基内进行增菌培养,37 ℃纯培养24 h后再次进行革兰氏染色,对镜检为革兰氏染色阳性、成对、短链球菌,再做接触酶试验,结果为阴性者,即确定为猪链球菌,接种于绵羊血琼脂斜面上,置于4 ℃冰箱中保存备用。
猪链球菌的分离、16S rRNA鉴定及药敏试验
养猪 Ｓ ＷＩ Ｎ Ｅ Ｐ Ｒ Ｏ Ｄ Ｕ Ｃ Ｔ Ｉ Ｏ Ｎ ｆ ３ ３ １
２ ０ １ ５
猪链球菌 的分离 、 １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ 鉴 定 及 药 敏 试 验
何 芳， 周 望平 ， 邱 美珍 ， 杨 俊 （ 湖南省畜牧 兽医研 究所 ， 湖南 长沙 ４ １ ０ １ ３ １ ）
作者简 介 ： 何 芳（ １ ９ ７ ３ 一 ） ， 女， 湖检 测和 测序
向为 动 物 疫 病 防控 ． Ｅ — ｍａ ｉ ｌ ： ７ ５ ｏ ０ ８ １ ７ ６ ＠ｑ ｑ ． ｃ ｏ ｍ
１ ． ５ ． １ 细 菌基 因组 Ｄ Ｎ Ａ的提取
猪链球菌病是一种人畜共忠 的急性、热性传 染 病料 。鲜血琼脂、 巧克力琼脂购 自江门市凯林贸易有 病， 可致猪脑膜炎、 关节炎 、 肺炎 、 心 内膜炎、 多发性浆 限公司， 即用型 Ｐ Ｃ Ｒ Ｍ ｉ ｘ 试剂盒购 白 北京天恩泽基因 膜炎［ １ 】 。 临床表现为急性 出血性败血症、 哺乳仔猪下痢 科技有 限公司， 药敏纸片购 自杭州微生物试剂公司。 和怀孕母猪流产等， 可致 生猪死亡 ， 危害较严重 。 据报 １ － ２ 试验 时 间 与 地 点 道， 猪链球菌血清型众多 ， 目前有 ３ ５ 个血清型 ， 而且 试验 时问为 ２ ０ １ ４年 ５ —７月，采样地 点为湖 南
中图分类号 ： ￥ ８ ５ ８ ． ２ ８ ２ ． ６ １ 文献标 志码 ：Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ２ — １ ９ ５ ７ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ３ — ０ １ ０ ８ — ０ ２
摘 要 从湖南某猪场病猪组织中分离出６ 株细菌， 通过培养形态、 菌落特征、 细菌染色特性、 镜检、 １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ基因扩增及序列 Ｂ Ｌ Ａ Ｓ Ｔ 分析等系统鉴定 ， 确定为猪链球菌， ６ 株分离菌的 １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ基因序列与收录 菌株同源性为９ ９ ％； ２ 上。药物敏感性试验结果表 明， 分离细菌对头孢喹肟、 先锋霉素、 青霉素药物高度敏感。 关键词 猪链球菌 ； １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ； 药敏试 验
猪链球菌的实验室分离与鉴定
将预处理的样品接种到选择的培养基上，在适宜的温度和环境下进行培养。观察 菌落的形态、颜色等特征进行初步鉴定，并进行生化试验、血清学试验等进一步 鉴定。
03
猪链球菌的鉴定
形态学鉴定
革兰氏染色
猪链球菌为革兰氏阳性菌，呈球形或 卵圆形，常呈链状排列。
培养特性
在血液琼脂平板上培养，形成圆形、 隆起、光滑、湿润的菌落，周围有完 全透明的溶血环。
生化鉴定
01
02
03
触酶试验
猪链球菌为阳性，可与其 他链球菌相鉴别。
氧化酶试验
猪链球菌为阴性，可与其 他链球菌相鉴别。
糖发酵试验
猪链球菌能发酵多种糖类 ，如葡萄糖、果糖、乳糖 等，可与其他链球菌相鉴 别。
分子生物学鉴定
01
16S rRNA基因ຫໍສະໝຸດ 列分析通过对猪链球菌的16S rRNA基因进行扩增和测序，可以确定其属、种
及亚种水平上的分类地位。
02
多位点序列分析（MLSA）
通过对多个基因位点的序列进行分析，可以更准确地鉴定猪链球菌的种
和亚种。
03
分子分型技术
如脉冲场凝胶电泳（PFGE）、多位点酶电泳（MLEE）等，可以用于研
究猪链球菌的分子流行病学特征，追踪其传播途径和溯源。
04
猪链球菌的致病性研究
致病机制研究
入侵机制
猪链球菌通过何种方式侵入机体，如通过呼吸道、消 化道等途径。
毒素作用
猪链球菌产生的毒素如何引起疾病，如溶血素、细胞 外酶等的作用。
免疫逃逸
猪链球菌如何逃避机体的免疫系统，如通过荚膜、鞭 毛等机制。
临床症状与病理变化
临床症状
猪链球菌感染后，猪可能出现的临床症状，如发热、咳嗽、 呼吸困难等。
猪链球菌的实验室分离与鉴定
猪链球菌的实验室分离与鉴定作者：李树民来源：《农家致富顾问·下半月》2015年第04期摘要：随着我国国民经济水平的进一步提高，人们对生活的质量以及健康的饮食也越来越关注了。
但是近些年来，相关部门在对很多地区的规模猪场进行防疫检查，发现有很多猪身上都带有猪链球菌，如果这些生猪流入市场，被人们所食用的话，那么其后果将会是不堪设想的，下面就对猪链球菌进行分离的细菌进行实验鉴定，以此来保证人们的饮食健康。
关键词：猪链球菌；实验室；分离与鉴定业内人士都应该知道，猪链球菌的危害是非常大的，而且其是一种人和兽可以共患的一种病原菌，在世界上的各个国家都有分布，从20世纪50年代以来，人们就一直受到猪链球菌的感染，不仅导致了大量猪的死亡，而且还深深的影响人们的生活健康。
下面就对这种猪链球菌做进一步的实验分析，希望可以给临床的防制工作提供有价值的参考作用。
一、实验中所使用的材料和研究方法探析1.1实验中所涉及到的材料病料在实际的实验中，所选择的疑似猪链球菌病的病料，都是从广东省的广州，韶关，还有增城以及湛江等地一些比较有规模的猪场选择的，一共对这些疑似猪链球菌病的病料平均分成了20份，同时也分别标注了1到20号，这样在实验分析中会非常的方便。
1.2实验中都需要用到的仪器主要有基因的扩增仪，是杭州的博日科技有限公司所生产的。
还有型号是DYY-Ⅲ4的稳压稳流电泳仪器，其生产厂家是北京市的六一仪器厂。
而型号为8823B的紫外线透射的分析仪，是生产于珠海的星马医学仪器有限公司生产。
这些仪器通过相关部门的检测，都是完全符合其实验要求的，所以在一定的程度上，实验的结果是有保证的。
1.3实验中所应用到的试剂主要有新生的牛血清，这种试剂是从北京的鼎国生物技术有限责任公司购买而来，还需要用到血平板试剂，以及一些可以用来对细菌微量进行生化反应的试管，同时还要用到托休二氏液体培养基以及托休二氏固体培养基，这些试剂都是从广东的环凯微生物科技有限公司购买而来的，因为这些都是比较知名的大企业，所以试剂的有效性是毋庸置疑的。
猪肺炎支原体不同毒力株黏附因子基因序列分析
各 地 。国 内外 对该 病 的病 原进 行 了大量 研 究 ， 目前
Ｍ ｐ 是引起猪气喘病的主要病原 ， ｈ） 广泛存在于世界
收 稿 日期 ：０ ９０ －９ ２ ０ －８２
对猪 肺炎 支原 体 的毒 力 因 子研 究 还不 是 特 别清 楚 ， 但是 Ｐ ７作 为黏 附 因子 的功 能 现 在 已经 确定 ， ９ 它在 猪肺炎支原体感 染猪过程 中起 重要作用 。因此 ， 研究
ＬＵ Ｍ ｏ ｕ Ｓ Ａ ｕ ．ｉｇ ， Ｚ Ａ Ｇ Ｙ ｎ Ｉ ａ － ｎ ， Ｈ Ｏ Ｇ ｏｑｎ ｊ Ｈ Ｎ ｉｇ
（．ｎｔｕ ｅ ｒ ａｙ Ｓｉ ｃ，ＪａｇｕＡａ ｅ ｙｏ ｇｉ ｌ ｒｌＳｉ ｃｓ ａｊ ｇ ２０ １ ，Ｃ ｉａ ． ｏｅｅｏ ｎｍ ｌＳｉ ｃ ｎ ｅｈ ｏ ｇ ， １Ｉｓｔｔ ｏ Ｖｔｉ ｒ ｃ ｎｅ ｉｎｓ ｃｄｍ Ａ ｒｕｔ ａ ｃ ｎｅ，Ｎ ｎｉ １０ ４ ｈｎ ；２ Ｃ ｌｇ Ａ ｉ ａ ｃ ｎｅａ ｄ Ｔｃｎｌ ｙ ｉ ｅｆ ｅ ｎ ｅ ｆ ｃ ｕ ｅ ｎ ｌ ｆ ｅ ｏ
物进行测序 ， 将猪肺炎支原体不 同毒力株的 Ｐ ７ 因序列 的碱 基组成 和推导 的氨基酸序 列进行 比较 ， ９基 分析猪 肺炎 支原体黏附因子 Ｐ ７基 因变化与致病性的关系 。结果表明 ， ９ 猪肺炎支原体黏附因子 Ｐ ７ 因与菌株致病性 有一定 ９基 关系 ， 但除 Ｐ ７基因之外 ， ９ 还有其他与致病 有关 的基 因存在 。 关键 词 ： 猪肺炎支原体 ；黏附因子 ；毒力 ；序列
猪链球菌的分离鉴定及16S rDNA序列分析
猪链球菌的分离鉴定及16S rDNA序列分析2021年第2期猪链球菌的分离鉴定及16S rDNA序列分析周婷婷，李媛，任立松，侯凤，贺笋，张飞*（天康生物股份有限公司，新疆乌鲁木齐830010）摘要：为明确导致新疆某猪场猪急性死亡的病原菌，试验对采集的猪病变淋巴结、肺脏进行病原菌分离培养、形态观察、16S rDNA测定、生化鉴定、药敏试验以及PCR血清型鉴定。
将该分离株与国内外13株分离株构建系统进化树进行比对分析。
结果显示：分离菌株镜检观察为革兰氏阳性长链状球菌，具有β溶血性，可发酵大多数糖类，符合猪链球菌的生化特性；分离菌株16S rDNA序列与猪链球菌标准菌株ATCC43765（GenBank登录号：NR_115737.1）同源性为100%；采用PCR方法对分离菌株进行血清型鉴定扩增出约390bp的荚膜血清9型特异性条带。
分离菌株对林可霉素、多西环素、青霉素钠、环丙沙星、头孢噻呋、氟苯尼考、替米考星、氧氟沙星、磺胺嘧啶钠、硫酸黏菌素、氨苄西林钠11种药物敏感，对四环素、庆大霉素、阿莫西林表现耐药。
研究表明，分离株为猪链球菌，荚膜血清9型，命名为XJS9。
关键词：猪链球菌；分离鉴定；16S rDNA中图分类号：S855.1文献标识码：A文章编号：1672-9692（2021）02-0057-05 Isolation,identification and16S rDNA sequencehomology of Streptococcus suisZhou Tingting,Li Yuan,Ren Lisong,Hou Feng,He Sun,Zhang Fei*(Tecon Bio-technology Co,Ltd,Xinjiang Urumqi830010)Abstract:In order to clarify the pathogenic bacteria that caused the acute death of pigs in a pig farm in Xinjiang,the test carried out the isolation and culture of pathogenic bacteria,morphological observation,16S rDNA determination, biochemical identification,drug sensitivity test and PCR serotype identification on the collected diseased lymph nodes and lung tissues of pigs.A phylogenetic tree was constructed from this isolated strain and13domestic and foreign isolates for comparative analysis.The results showed that the isolated strain was gram-positive long-streptococcus observed under microscopy.It hadβ-hemolytic properties which can ferment most sugars,and conforms to the biochemical characteristics of Streptococcus suis.The16S rDNA sequence of the isolated strain was comparable to the standard strain ATCC of Streptococcus suis.43765(GenBank accession number:NR_115737.1)had a homology of100%.The serotype identification of the isolated strains by PCR method was used to amplify a type9-specific band with a size of about390bp. The isolated strains were p-lincomycin,doxycycline,penicillin sodium,ciprofloxacin,ceftiofur,florfenicol,tilmicosin, ofloxacin,sulfadiazine sodium,colistin sulfate,ampicillin Cillin sodium was sensitive to11drugs and was resistant to tetracycline,gentamicin,and amoxicillin.The study indicated that the isolated strain was Streptococcus suis,capsular serotype9,named XJS9.Key words:Streptococcous suis;isolation and identification;16S rDNA猪链球菌病（swine Streptococcosis）是由多种不同菌群的链球菌感染引起的一类传染病的总称[1]，以败血症、淋巴脓肿、心内膜炎、多发性浆膜炎等为典型特征，也可引起人的化脓性脑膜炎、败血症、关节炎，主要表现为发热和毒血症状，导致器官衰竭而死亡，是一种人畜共患病。
猪链球菌2、7、9型多重PCR检测方法的建立及应用
猪链球菌2、7、9型多重PCR检测方法的建立及应用刘琪;王娟;周如月;甘振磊;贾爱卿;王贵平【摘要】根据GenBank中猪链球菌(Streptococcus suis,Ss)2、7、9血清型的荚膜多糖基因簇中的斜基因序列,分别设计3对引物,在完成最佳条件筛选、特异性、敏感性试验的基础上,建立了一种快速区分猪链球菌2、7、9三种血清型的多重PCR检测方法,并对我国广东省分离鉴定的猪链球菌进行分型鉴定.结果表明,建立的多重PCR检测方法分别对猪链球菌血清2型、7型和9型扩增出特异性片段,片段大小分别是360、600、800 bp.该方法特异性良好,与副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)、多杀性巳氏杆菌(Pasteurellamultocida,Pm)、波氏杆菌(Brodetella bronchiseptica,Bb)、沙门氏菌(Salmonella,Sal)、大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)以及猪链球菌其他29个血清型均无交叉反应.用建立的多重PCR方法对临床分离的341株猪链球菌菌株进行血清型分型鉴定,并与传统的血清凝集分型结果进行比较,二者符合率为97.36％.与传统的血清凝集方法相比,本研究建立的PCR方法具有快速、灵敏、特异等特点,可应用于实验室的快速诊断以及猪链球菌的流行病学调查.【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2016(024)003【总页数】6页(P35-40)【关键词】猪链球菌;多重PCR;血清型;鉴定【作者】刘琪;王娟;周如月;甘振磊;贾爱卿;王贵平【作者单位】广东海大畜牧兽医研究院,广州511400;广东海大畜牧兽医研究院,广州511400;广东海大畜牧兽医研究院,广州511400;广东海大畜牧兽医研究院,广州511400;广东海大畜牧兽医研究院,广州511400;广东海大畜牧兽医研究院,广州511400【正文语种】中文【中图分类】S852.611猪链球菌（Streptococcus suis，Ss）是一种重要的人畜共患病的病原，感染猪可导致脑膜炎和败血症等[1]，感染人可引起脑膜炎和中毒性休克综合症等，严重的可导致人畜死亡[2]。
猪链球菌分子生物学检测研究进展
猪链球菌分子生物学检测研究进展作者：董维垚来源：《兽医导刊》 2018年第8期猪链球菌病是由猪链球菌引起的一种人畜共患的传染病，会导致猪关节炎、心内膜炎以及肺炎等的发生，同时还可以穿过胎盘屏障导致母猪流产，是我国养猪业面临的重大传染病之一。
对猪链球菌病进行快速诊断对于该病的控制意义重大。
目前对该病的检测方法主要是通过建立在常规的分离培养以及生化鉴定的微生物学鉴定方法，不仅费时费力，而且检测灵敏度不高。
近年来，随着分子生物学技术的不断发展，为猪链球菌的检测提供了新的途径。
因此，本文就目前国内外猪链球菌分子生物学方面的检测方法进行具体的论述，以期为同行提供帮助。
一、聚合酶链式反应（PCR）技术PCR 敏感性强，特异性高，还具有高度的重复性，可以快速准确的对病原菌做出诊断，是近年来猪链球菌检测的常用技术。
1. 群特异性PCR。
谷氨酸脱氢酶基因以及溶血素基因具有良好的群特异性，同时在猪链球菌不同分离菌株之间具有一定的保守性。
Okwumabua 等根据猪链球菌2 型菌株的溶血素基因序列设计了一种引物从而建立了PCR，但是由于受到检测范围的限制，该法对一些血清型以及致病型菌株无法检测出来。
因此，Okwumabua等依据猪链球菌2 型菌株的谷氨酸脱氢酶基因序列设计了引物并建立了猪链球菌定群PCR，该法能特异性的检出猪链球菌所有血清型菌株。
此外，Smith 等依据荚膜多糖是猪链球菌血清型鉴定的直接依据这一特点对猪链球菌的主要菌株荚膜基因的DNA 序列设计了引物，建立了血清型特异性PCR 的检测方法。
2. 多重PCR。
多重PCR 技术能够同时扩增不同的基因片段，因而与普通PCR 技术相比具有明显的优势。
2009 年，聂小想等建立了多重PCR 检测体系，实现了对蛋白溶菌酶释放蛋白、溶血素基因以及胞外因子等猪链球菌独立相关因子基因的同步检测。
通过对背景明确的试验菌株进行检测分析，具有一定的检测效果。
3. 实时荧光定量PCR。
一株猪链球菌的分离鉴定及其生物学特性研究
一株猪链球菌的分离鉴定及其生物学特性研究猪链球菌是一种广泛存在于动物体内的细菌，对人畜都有一定的危害。
本文主要探讨了一株猪链球菌的分离鉴定及其生物学特性。
我们从患有传染性疾病的猪体内分离出了一株可疑的细菌。
为了确认其是否为猪链球菌，我们进行了一系列的实验。
通过对该菌进行革兰染色，我们观察到该菌呈现出典型的球状和链状结构，这与猪链球菌的形态特征一致。
我们利用血琼脂斑试验进行了进一步鉴定。
结果显示，该菌在血琼脂平板上形成了清晰的β溶血斑，表明它具有溶血能力，也是猪链球菌的特性之一。
我们对该菌的16S rRNA基因进行了测序和比对分析，结果显示其与已知的猪链球菌的序列一致性高达99%，进一步确认了其身份。
接下来，我们对该株猪链球菌的生物学特性进行了研究。
我们探究了其在不同环境条件下的生长特性。
实验结果显示，该菌在适宜的温度（37摄氏度）和pH（7.4）下，能够快速生长，并产生大量黏液质地的菌落。
我们研究了该菌的生理和生化特性。
实验结果显示，该菌对碱性环境和高温敏感，对氧气不需求，可在无氧条件下生长。
该菌对一些糖类和氨基酸类物质具有发酵能力，并能产生一些特殊的代谢产物。
我们还研究了该菌的致病性。
实验结果显示，该菌通过产生多种抗原物质和外毒素，能够引起机体的炎症反应，并损伤宿主的细胞和组织。
该菌能够在血液和其他体液中传播，引起全身性感染。
该菌对抗生素的敏感性较低，使得它在治疗上存在一定的难度。
总结而言，本研究对一株猪链球菌进行了分离鉴定，并探究了其生物学特性。
通过研究，我们对猪链球菌的分子特征、生理特性和致病机制有了更深入的了解，对进一步研究和防控该菌引起的疾病具有一定的指导意义。
江西省猪链球菌的分离鉴定及耐药基因、毒力基因检测分析
·研究论文·摘 要：为了解猪链球菌临床分离株的生物学特性、耐药基因与毒力基因的携带情况。
采集疑似链球菌感染病死的猪肺脏和关节液，用常规方法分离细菌，通过镜检、16S rRNA 序列测定分析、分子分型、动物实验鉴定分离菌的生物学特性，用药敏试验进行药物敏感度测定，并利用PCR 检测耐药基因及毒力基因。
结果可知，从8个养猪场的10份肺脏和关节液中共分离到10株菌，经16S rRNA 序列比对和血清分型，10株分离株均为猪链球菌，其中9型7株，1型1株，其余2株为猪豕链球菌和猪生殖道链球菌；小鼠致病性试验结果显示，分离株JXNC1906、JXJJ1904和JXNC1904的毒力较强；毒力基因检测显示，JXNC2103可检出6种毒力基因，JXNC2011株只检出mrp 毒力基因，毒力型mrp +ef -gdh +sly +mmum +Orf2+2株、mrp -ef +gdh +sly -mmum +Orf2- 4株、mrp -ef -gdh +sly -mmum +Orf2+ 1株、mrp +ef +gdh +sly -mmum +Orf2+ 1株；药敏试验结果，10株分离菌的耐药性均不强，对大观霉素、恩诺沙星、丁胺卡纳、氨苄西林和头孢曲松均在中度以上敏感；耐药基因检测结果，10株链球菌分离株均能检测出氟喹诺酮类耐药基因，除JXNC1906外，其他9株还能检测出四环素类、大环内酯类以及磺胺类耐药基因，分离菌JXNC1906检测出β-内酰胺类blaTEM 和氨基糖苷类Aph3’耐药基因，其他分离菌株可检测出vanA 、vanD 、strA 、strB 、floR 以及多重耐药基因optrA 和Lsa(E)等。
结果表明，从临床病死猪中分离的链球菌致病性高低不一，对临床常见药物仍较为敏感，不同分离株的耐药基因表型和毒力基因表型相差较大。
本实验结果为进一步研究猪链球菌的致病机理和临床有效防控措施提供基础。
多重PCR检测猪链球菌种及主要致病血清型
多重PCR检测猪链球菌种及主要致病血清型作者：王海丽徐公义赵德明来源：《江苏农业科学》2014年第08期摘要：根据猪链球菌种特异性基因gdh及血清2、7、9型的特异性基因cps2J、cps7H、cps9H序列，分别设计4对引物，通过对单项PCR、多重PCR扩增条件和反应体系的优化，建立了快速检测猪链球菌种及主要致病血清型2、7、9型的四重PCR方法；并利用建立的多重PCR方法对鲁西区域致病性猪链球菌的流行情况进行了调查研究。
关键词：猪链球菌；菌种；致病血清型；多重PCR；检测方法中图分类号：S852.61 文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）08-0212-02猪链球菌（Streptococcus suis，SS）是一种危害公共安全和现代养猪业的人兽共患病原体，有致从业人员感染的危险，猪链球菌病几乎危及所有规模化养猪国家[1]。
猪链球菌血清型众多，其中猪链球菌2型（SS2）对猪的致病性最强，流行亦最广；此外，猪链球菌 7型（SS7）和猪链球菌9型（SS9）等也是引起猪感染发病的重要血清型。
谷氨酸脱氢酶（GDH）是细菌的一种十分重要的功能蛋白，其基因保守性高，点突变率极低，是病原体种属鉴定的重要诊断性抗原。
Okwumabua等根据gdh基因设计猪链球菌种特异性引物，通过对306株链球菌的检测发现，目前发现的35个猪链球菌血清型中均检测出了gdh基因，而化脓链球菌、乳房链球菌、牛链球菌、链球菌兽疫亚种、马链球菌均未检测出gdh基因，因此，gdh 通常作为猪链球菌的一种重要检测抗原[2]。
荚膜多糖（CPS）是区分猪链球菌血清型的重要依据之一[3]。
SS2 cps2J基因仅可以与2型和1/2血清型产生杂交，显示cps2J基因为SS2的特异性基因可以作为鉴定SS2 的依据。
根据SS7型、SS9型基因与其他血清型的同源性比对，选择同源性低的阅读框基因作为检测基因。
本试验以我国及山东等地SS血清型流行病学调查为参考，借鉴已发表的SS gdh基因作为种特异性引物，筛选2、7、9型cps特异性基因作为检测引物，在建立单项PCR的基础上优化反应体系和反应条件，建立特异性的多重PCR检测方法，可在诊断猪链球菌的同时进行主要致病血清型的分型。
钦州地区猪链球菌的分离鉴定与药敏试验
备用 ； 药敏 纸 片购 自北京天 坛药 物生物 技术 开发公 司 ； 菌 细
微量发 酵管 购 自杭 州天和 微生物试 剂有 限公 司。
１ ． 细 菌 分 离 ２
分 离 菌株 接 种 于各 个 微量 生 化 反应 管 ． 同时 做 ＭＲ试 验和 Ｖ Ｐ试验 ， 结果 见表 １ 。
表 １ 分 离 菌 生 化 试 验 结 果
引发 猪脑 膜炎 、 关节 炎 、 内膜炎 和败 血症 ｌ ２型猪 链球 菌 心 ｌ ｌ 。 在 全球范 围内都 是优势 流行株 。０ ５年 ６ ２０ —７月发生在 四川
１ ． 药 敏 试 验 ４
采用纸 片扩 散 法 。 将所 保存 的纯 化 菌株分 别在 ３ ７℃营
养肉 汤 中培 养 ２ ， 无 菌生 理盐 水将 菌 液稀 释 至浓 度约 ４ｈ 用
不能 生长 。
２２ 生化 试 验 结 果 ．
试 验病 料为 采 自广 西钦 州地 区某猪 场疑 似猪 链球 菌发 病 的仔 猪淋 巴 结 、 、 、 肺 脾 扁桃 体 等病 变 组织 。 试验 试 剂为 ： 绵羊 血琼 脂 平板 、 绵羊 血琼 脂 斜 面 、 普通 琼 脂培 养基 、 养 营 肉 汤 、 克力 培 养基 等 ， 按 常规 方 法 制 备 ， 巧 均 ４℃冰 箱 保 存
不 合理 用药 ， 使得 病原 菌的 耐药现 象 日趋 严重 。 研究对 本 地 区猪 场送 检 的疑 似链 球 菌病 病死 猪 的淋 巴 结 、 、 、 肺 脾 扁 桃体 等 病变 组 织进 行 了细 菌 的分 离鉴 定 ， 分离 菌 进行 了 对 药敏试验 ， 以期为该病 的临 床防治提 供科学 依据 。
１ 材 料 与 方 法
１１ 试 验 材 料 ．
２１ 培 养 结 果 ．
猪链球菌的实验室分离与鉴定
在 实 际 的实 验 中， 所选 择 的 州 的 博 日科 技 有 限 公 司 所 生 产
染， 不 仅 导 致 了大 量 猪 的死 亡 ， 而 疑似猪链球菌病 的病料 ，都是从 的 。还有 型号 是 Ｄ Ｙ Ｙ — Ｉ Ｉ Ｉ ４的稳 压
且 还 深 深 的 影 响 人 们 的 生 活 健 广 东 省 的广 州 ， 韶关， 还有 增 城 以 稳 流 电泳仪 器 ，其生 产 厂 家是 北
方法结合为宜 。即 ５ ０ ｋ ｇ 一 ６ ０ ｋ ｇ以 季 水 温 保 持 在 １ ５ ℃ 左 右 ， 夏 季
前 采 用 自 由采食 ， 以提 高猪 的增 ５ １ ３左右 为宜 。
１ ２１
分离纯 化和 Ｄ Ｎ Ａ的提取工 作，
门 的检 测 ，都 是 完全 符 合 其实 验 所以选择用病猪的扁桃体来进行
、
是 一种 人和 兽 可 以共 患 的 一种 病 研 究方 法探 析
原菌，在世界上的各个国家都有
１ ． １ 实 验 中 所 涉 及 到 的 材 仪器
分 布 ，从 ２ ０ 世纪 ５ ０年 代 以来 ， 料病 料 人 们 就 一 直 受 到 猪 链 球 菌 的 感
主要有基 因的扩增仪，是杭
康 。 下 面就 对 这种 猪 链 球 菌做 进 及 湛 江等 地 一些 比较 有规 模 的猪 京 市 的 六 一 仪 器 厂 。 而 型 号 为
一
步 的 实验 分 析 ， 希望 可 以给 临 场 选择 的 ，一共 对 这 些 疑似 猪 链 ８ ８ ２ ３ Ｂ的紫外 线透 射 的分 析仪 ， 是
验 鉴定 ． 以此 来保证人 们 的饮食 健 康 。 关键 词 ： 猪链 球 菌； 实验 室； 分 离与鉴定
业 内人士都应该知道，猪链 作用 。
猪链球菌的分离鉴定及自家灭活苗研制
猪链球菌的分离鉴定及自家灭活苗研制
王金合;江青东
【期刊名称】《江西农业学报》
【年(卷),期】2009(021)005
【摘要】为确诊猪链球菌病,筛选敏感药物和研制自家灭活苗防治该病,从送检病猪体内分离病原菌,通过对分离菌的形态染色、分离培养、生化试验、血清型鉴定等方法鉴定菌株;并通过药敏试验筛选敏感药物,配制铝胶佐剂,制备自家铝胶灭活苗对其进行防治.实验结果表明,分离鉴定的菌株为2型猪链球菌,分离菌对恩诺沙星、氨苄青霉素、庆大霉素、阿莫西林、头孢拉定高敏,用研制的猪链球菌自家铝胶灭活苗防治该病安全有效.结果提示,猪场链球菌病须经实验室分离鉴定病原才可确诊,临床治疗用药应筛选敏感药物,用自家灭活苗防治有较好效果.
【总页数】3页(P105-107)
【作者】王金合;江青东
【作者单位】郑州牧业工程高等专科学校,河南,郑州,450011;郑州牧业工程高等专科学校,河南,郑州,450011
【正文语种】中文
【中图分类】S855.11
【相关文献】
1.新城疫强毒河南株分离鉴定及二价油乳剂灭活苗研制 [J], 陈东景;黄俊英
2.猪链球菌病病原分离及多价灭活苗的研制 [J], 黄耿光
3.雏鹅的鸭瘟病原分离鉴定及油乳剂灭活苗研制 [J], 牛桂玲;索江华
4.猪链球菌的分离鉴定及其现地制灭活苗的研究 [J], 黄廷贺;郝振国;王卓;尹广东
5.副猪嗜血杆菌的分离鉴定及自家灭活苗的研制 [J], 王金合;石冬梅;郭素琴;祁画丽;陈益
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猪链球菌血清型9株新的毒力相关基因STP有助于降低小鼠死亡率
猪链球菌血清型9株新的毒力相关基因STP有助于降低小鼠
死亡率
佚名
【期刊名称】《中国猪业》
【年(卷),期】2011(005)011
【摘要】猪链球菌是一个重要的猪病病原，可造成一系列疾病。
猪链球菌血清2型（SS2）和链球菌血清9型（SS9）在中国广泛流行。
SS9的毒力凶子还不太清楚，分别从病猪和健康猪身上分离两个菌株GZ0565和SH040917。
抑制性消减杂交技术（SSH）用来识别与SS9病原相关的毒力基因。
【总页数】1页(P69-69)
【正文语种】中文
【中图分类】S852.611
【相关文献】
1.多重PCR方法检测猪链球菌主要致病血清型及其毒力因子 [J], 郑升博;华修国;陆伟芳;袁聪俐;杨志彪;崔立
2.在猪链球菌2型江苏分离株中发现新的orf2毒力相关基因 [J], 李干武;姚火春;陆承平
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猪链球菌9型钦州株的分离及其cps9H基因序列分析
摘要对临床疑似猪链球菌9型(SS9)的病料进行实验室诊断。
通过实验室检测结果证实,分离菌属于SS9,将其命名为QZ49;扩增其cps9H目的基因长为389 bp;与GenBank上国内外SS9毒株核苷酸同源性介于97.2 %~99.5 %之间。
关键词猪链球菌9型;cps9H基因;分离;序列分析
近年来,猪链球菌9型的流行趋势逐渐上升,在我国各省(市)均有不同程度的发生和流行[1-2],SS9已逐渐成为危害我国养猪业发展的疫病之一。
本研究就钦州疑似SS9症状的病料进行细菌分离、PCR扩增,并进行测序分析,以期为SS9的分子流行病学提供数据支持。
1材料与方法
1.1标准毒株及主要试剂
猪链球菌9型标准毒株(Y142株)由广西动物疫病预防控制中心实验室提供。
dNTP、Taq酶、蛋白酶K、SDS、饱和酚等购自TaKaRa公司;LB培养基购自GIBCOL公司。
1.2引物
根SS9荷兰5218株设计扩增cps9H基因引物:cps9H1:5′-GGCTACATATAATGGAAGCCC-3′;cps9H2:5′-CCGAAG TATCTGGGCTACTG-3′,预期扩增片段长约389bp。
1.3细菌培养、纯培养及涂片镜检
采集某猪场疑似SS9型症状的病料接种鲜血琼脂培养基,37 ℃培养12 h后观察。
挑选可疑的单个菌落接种于链球菌增菌培养基中,37 ℃培养20 h收取细菌液体培养物,涂片、革兰氏染色镜检。
1.4细菌的涂片镜检与DNA的抽提
取细菌纯培养物,涂片、革兰氏染色镜检。
之后取液体培养物1.5 mL按传统DNA抽提方法抽提DNA,获得的DNA模板用于下一步操作。
1.5cps9H基因扩增
取抽提的DNA模板进行cps9H基因的扩增,反应体系总体积25 μL,内含模板
2.0 μL,加10×Reaction Buffer 2.5 μL,dNTP(2.5 mmoL/μL)2.0 μL,Taq DNA酶(5 U/μL)0.25 μL,MgCl2(25 mmoL/L)1 μL,上下游引物(25 pmoL/μL)各0.5 μL,加ddH2O补至25 μL,置PCR仪中,95 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s,56 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,30个循环;72 ℃延伸10 min。
完毕后取PCR产物5 μL在10 g/L 琼脂糖凝胶上电泳,置凝胶成像系统中观察结果。
1.6cps9H基因序列分析
PCR阳性产物纯化后送宝生物工程(大连)有限公司测序。
应用DNAStar软件将测序获得的SS9毒株cps9H基因序列截短并进行整理,与国内外已发表的SS9 cps9H基因序列进行核苷酸同源性分析,建立系统发育树。
2结果与分析
2.1细菌培养特征
该细菌在鲜血培养基上菌落呈针尖大小,圆形隆起,湿润透明,灰白色,为β-溶血;在血清肉汤中管底混浊呈沉淀状。
革兰氏染色为G+菌。
初步证实该分离菌属于猪链球菌9型。
2.2PCR扩增结果
扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳,得到单一的约390 bp大小的目的片段(图1)。
2.3测序结果及核苷酸同源性分析
通过测序,得到389 bp核苷酸序列(图2)。
用DNAStar软化进行同源性分析,QZ49株与荷兰5218株的同源性是98.7%;与广西Y142、南京HA070725、湖北HB21都为99.5%;与河南HN、湖北HB22分别为98.2%和99.2%;与广州GZ0565同源性最低,仅为97.2%。
3结论与讨论
在猪链球菌35个血清型中,cps9H与其他34个血清型的序列同源性都很低,是国内外目前利用PCR技术鉴别诊断猪链球菌9型引物的主要基因组。
SS9是继SS2型之后的主要流行血清型,主要流行于澳大利亚、德国、比利时和荷兰[3]。
近些年来,在我国各省(市)也有关于SS9的报道[4-6],研究证实了SS9毒株确实已在钦州市的猪群中存在。
序列分析结果显示,钦州分离株与国内外其他SS9毒株核苷酸同源性都较高。
研究结果表明,钦州市现在流行的SS9毒株与国内外的流行毒株基本一致,没有发生太大的变异,预示在临床上重视控制SS2感染的同时,还应该加强防控SS9,以防在钦州市猪群中形成大规模的流行。
4参考文献
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[5] 陈炜,刘平,郭仕坤,等.六安地区猪链球菌分离鉴定及药敏学试验[J].畜牧与饲料科学,2009(2):183-184.
[6] 李鹏,刘军,祝令伟,等.猪链球菌2型新毒力相关基因lin缺失菌株的构建[J].中国兽医学报,2010,30(5):643-646.。