2型糖尿病肾病大鼠肾小管间质病变及TGF-β1、HGF和CTGF表达的变化及意义

2008年6月 第29卷　第3期 首都医科大学学报Jour na l of Capita lMedical U niversity Jun .2008Vol .29　No .3基础研究2型糖尿病肾病大鼠肾小管间质病变及TGF 2β1、HGF 和CTGF 表达的变化及意义安　娜　刘惠兰3　王　英(首都医科大学附属复兴医院肾内科)【摘要】　目的　通过2型糖尿病肾病(T2D N )大鼠模型,探讨早期糖尿病肾病(DN )肾小管间质的病理变化及转化生长因子β1(TGF 2β1)、肝细胞生长因子(HG F )和结缔组织生长因子(CTG F )表达变化及意义。

方法　高热量饲料喂养加腹腔注射链脲佐菌素(STZ ),复制T 2DN 模型。

14周和20周时用HE 染色及PAS M 染色方法观察肾小管及间质的病理变化;用免疫组织化学的方法观察肾小管间质中T GF 2β1、HGF 和CTG F 的表达变化,并进行半定量分析。

结果　模型组大鼠具有血糖异常、胰岛素抵抗及肾小球高滤过率、白蛋白尿等特点;部分肾小管上皮细胞萎缩、脱落、空泡化,基底膜增厚及小管间质纤维化。

免疫组织化学方法提示TGF 2β1和HGF14周及20周时在2组大鼠小管间质的表达差异有统计学意义(P <0.01);CT GF 在2组大鼠肾小管间质有少量表达,差异无统计学意义。

结论　早期D N 大鼠模型中肾小管间质已开始出现纤维化改变;TGF 2β1、CTGF 和HGF 在早期DN 的肾小管及间质中的表达发生变化,提示TGF 2β1、CTG F 和HGF 在肾小管间质的表达失衡与D N 肾小管病变的进展相关。

【关键词】　2型糖尿病肾病;肾小管间质;转化生长因子;肝细胞生长因子;结缔组织生长因子【中图分类号】　R 587.1,R 692.6C han ges i n Tubu l ar 2i n ter stit i a l Pa thom or phology an d Expr essi on of TGF 2β1,HGF and C TGF i n a Ra t M odel of Type 2D i a be ti c Nephr opa thyAn Na,L iu Huilan 3,W ang Ying(D ep a rt m ent of N ephrop a thy ,Fu Xing H os pita l,Capita lM edica lU niv ersity)【ABSTRAC T 】　O b ject i ve T o devel op a rat mode l of t ype 2diabeti c nephropa thy and t o inv e stig a te change s in tubula r 2inte rstitia l pa tho morphology and ex p ressi on of TGF 2β1,HGF and CTGF in early 2stage diabe tic nephropathy .M ethods Fort y 2f our eight 2week 2old ma le W istar ratswe re fed a nor ma l or high 2ene rgy (46%of t o t a l ca l ories fro m fat )diet for 20weeks,and at week 6ra ts rece ived onceintrape ritonea l injecti on of c itric ac id buffer or STZ (30mg/kg ).In the eighth week,t wo groups under went intraperit oneal injection gl ucose t olerance te st (I PGTT ).Body weight,fa sting blood glucose,ins ulin,24h our urine album i n exc re ti on and c reatinine clearance ra t e were monit o red after t he feeding programm e .The tubula r struc tural changes we re exa m i ned with HE sta ining and periodic acid 2silver me thenam ine staining a tweek 14and week 20.The protein ex p re ssi on of TG F 2β1,HGF and CTGF in tubul a r 2interstitial were dete r m ined by i mm unohist ochem istry a t week 14and week 20.Re sults 1)The rats fed high 2energy m arkedl y sh owed obesity,hyperglycae m ia,hyperinsulinem ia,insulin re sistance and a lbu m inuria .2)The re we re s evere structura l alt e ra ti ons of hepa tic tissue,panc reas and tubular 2int e rstitiu m in rats fed high 2ene rgy diet .3)The p rot e in expre ssi on of T GF 2β1and HGF i ncreased si gnificantly in rats fed high 2fat (P <0.05),while CTGF had no signi f i cantly chang ed .C on clusio n 1)Tubular 2inte rstitial patho morph ology in the ra ts of the early 2stage diabe tic nephropa t hy have been fibr osis .2)The p r o t e in expressi on of TGF 2β1,HGF and CT GF in tubular 2interstitiu m are unba lanced,which m ay be a ss oc i a ted with diabetic nephropathy progressi on .【KEY WO RD S 】　ty pe 2diabetic nephropathy;tubular 2inte rstitial;transfor m ing gr o w th fac t or;hepa t ocyte gro wth factor;connectivetissue gro wth fact or基金项目北京市西城区科技创新基金(36)资助项目,S 2y S T y I F f X D 2,B j (36)3,2f x @y 随着社会的进步、生活水平的改善、诊断技术的提高,2型糖尿病的患病人数在大幅度的增长。

而糖尿病肾病的患者也将随之增加[1]。

近期研究[2,3]发现糖尿病肾损伤同时也发生在肾小管,而且糖尿病患者肾功能的恶化程度与其肾小管间质损伤程度密切相关。

但是关于糖尿病时肾小管的损伤机制不太明确。

有学者认为在慢性肾脏病变中,肾组织中异常表达的细胞因子发挥了重要的作用。

为此,本实验通过高热:20070uppor ted b cience and echnol og nnovation und o icheng is trict ei i ng 20070Co rres ponding au t ho r E m ail :l gg u ing ahoo 首都医科大学学报第29卷量饮食结合适量的链脲佐菌素(STZ)腹腔注射复制与人类2型糖尿病肾病类似的动物模型,观察其早期肾小管及其间质的病理变化,并研究转化生长因子β1 (TGF2β1)、结缔组织生长因子(CTGF)和肝细胞生长因子(HGF)蛋白表达变化及意义。

1　材料和方法1.1　动物模型的建立44只健康清洁级雄性W istar大鼠,体质量160～230g,周龄8周,由首都医科大学实验动物科学部提供(许可证号:S CXK京200520006),在首都医科大学实验动物科学部的屏障设施内饲养。

采用抽签法随机分成对照组(A组,20只)和模型组(B组,24只),分别饲予基础料和高热量饲料(70%常规饲料加10%的猪油、5%胆固醇、5%豆油和10%蔗糖构成),由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心配制(许可证号: SCXK2军20022018)。

喂养5周后,裁尾采血测夜间禁食血糖(F B G)、血胰岛素水平(F I NS),并计算血胰岛素敏感指数(I S I);第6周,B组按30m g/kg的剂量一次性腹腔内注射STZ(现溶于0.1mol/L柠檬酸2柠檬酸钠缓冲液,pH4.2),A组按相同剂量注射柠檬酸缓冲液。

B组继续高热量饮食喂养。

第8周,大鼠夜间禁食后,按2g/kg的剂量腹腔内注射50%葡萄糖溶液,并于注射前、注射后1h及2h,分别裁尾采血测血糖。

将糖耐量试验中1h血糖≥13mmol/L,伴胰岛素抵抗作为判定2型糖尿病大鼠模型成功的标准。

按照上述标准,B组有3只大鼠因未达标准而剔出。

1.2　标本收集于实验开始后第6周、14周和20周用代谢笼收集24h尿,离心,保存于-70℃冰箱中待测尿白蛋白及肌酐。

14周和20周分别用2%戊巴比妥钠(35m g/kg)腹腔麻醉后处死大鼠,14周时A、B两组各10只,20周时A组10只,B组11只。

留取标本,包括经腹主动脉采血,离心,保存于-70℃冰箱中待测血胰岛素;采血后快速取出肾脏和胰腺,用冰盐水灌洗后滤纸吸干,立即用中性甲醛溶液固定24h后,石蜡包埋,切片,进行HE、PAS M及免疫组织化学染色。

1.3　生化指标血糖用葡萄糖氧化酶法检测;肌酐由B eck m an自动生化分析仪进行检测;尿白蛋白及血胰岛素的测定采用放射免疫法,按北京北方生物研究所的操作手册进行。

1.4　病理检测常规方法制备光镜切片,分别作H E和P AS M染色观察肾小管间质,免疫组织化学染色观察TGF2β1、HGF和CTGF的表达,并用Leica Qw in Standard医学图像分析系统进行图像分析处理,每张组织切片随机在皮质区选取10个不重叠的视野(尽量避开肾小球及血管),计算阳性着色面积与整个视野的相对面积比,平均值为该切片的相对阳性着色面积比。