生物技术制药问答题

三、问答题（共计50分）1．基因工程菌的遗传不稳定性的两种主要表现形式是什么？基因工程菌的遗传不稳定性的主要机制是什么？（10分）基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，这种不稳定性具有下列两种表现形式：1．结构不稳定性：重组DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失2．分配不稳定性：整个重组DNA 分子从受体细胞中逃逸。

基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制1．受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA 分子的降解2．外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢3．重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配，这是重组质粒逃逸的基本原因4．受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排2．在人胰岛素AB链分别表达法中，为何将AB链编码序列与b-半乳糖苷酶基因融合？小分子蛋白在大肠杆菌中表达后不稳定，容易被细胞内蛋白酶降解失活。

表达融合蛋白的优点是基因操作简便；在菌体内比较稳定，不易被细菌酶类所降解，容易实现高效表达。

人胰岛素AB链分别表达法中，将A、B链编码序列与b-半乳糖苷酶基因融合，分别表达出融合蛋白，使表达的蛋白分子量足够大，避免被蛋白水解酶分解，提高其稳定性及表达率。

3．动物细胞大规模培养的方法有哪些？各自的特点是什么？（10分）1．悬浮培养悬浮培养即让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖。

它适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。

该培养方法的优点是操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可借鉴许多有关细菌发酵的经验。

不足之处是由于细胞体积较小，较难采用灌流培养（perfusion culture )，因此细胞密度一般较低。

2．贴壁培养贴壁培养是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。

它适用于一切贴附依赖性细胞（贴壁细胞），也适用于兼性贴壁细胞。

该方法的优缺点与悬浮培养正好相反，优点是适用的细胞种类广（因为生产中所使用的细胞绝大多数是贴壁细胞），较容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度；不足之处是操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差。

3．贴壁—悬浮培养微载体培养既可创造相当大的贴附面积供细胞贴附生长增殖，满足了绝大多数细胞的基本要求，又由于载体的体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥了悬浮培养的一切优点。

4. 阐述基因工程药物研制有那些主要过程（10分）基因工程药物的生产必须首先获得目的基因，然后用限制性内切酶和连接酶将所需目的基因插入适当的载体质粒或噬菌体中并转入大肠杆菌或其他宿主菌（细胞），以便大量复制目的基因。

对目的基因要进行限制性内切酶和核苷酸序列分析。

目的基因获得后，最重要的就是使目的基因表达。

基因的表达系统有原核生物系统和真核生物化的难易。

将目的基因与表达载体重组，转入合适表达系统，获得稳定高效表达的基因工程菌（细胞）。

建立适于目的基因高效表达的发酵工艺，以便获得较高产量的目的基因表达产物。

建立起一系列相应的分离纯化、质量控制、产品保存等技术。

5．阐述鼠源性单克隆抗体改造后的小分子抗体类型（10分）（1）人－鼠嵌合抗体将鼠MAb的可变区和人抗体的恒定区组成嵌合抗体由于这两部分在空间结构上相对独立，其独特的抗体亲和力保持得很好，但因鼠单抗可变区的存在，应用时仍有较强的排斥反应。

（2）改形抗体在嵌合抗体的基础上进一步将鼠MAb可变区中相对保守的FR替换成人的FR，保留与抗原结合的CDR部位（3）Fab抗体Fab段由重链V区及CH1功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。

Fab抗体只有完整IgG 的1/3。

（4）单链抗体单链抗体(Single chain Fv，scFv)是由一段弹性连接肽(Linker)把抗体可变区重链(VH)与轻链(VL)相连而成，是具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位。

（5）单域抗体只含V区基因片段的小分子抗体，即只有VH或VL一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的特异性。

这种小分子的抗体片段就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个Ig分子的1／12。

（6）分子识别单位只含有一个CDR多肽的抗体。

6动物细胞的生理特点？答：1 细胞分裂周期长（动物细胞分裂所需时间一般为12~48h。

）。

2 细胞生长需贴附于基质，有接触抑制现象。

3 二倍体细胞寿命有限（异倍体细胞系寿命长）。

4 对生长环境要求敏感。

5 培养基要求高。

6 合成的蛋白质有修饰。

7动物细胞培养时加入血清的作用机制？答：提供基本营养物质；提供激素和各种生长因子；提供贴附因子和伸展因子；对培养中的细胞起到某些保护作用；提供PH\缓冲物质，调节培养基PH；影响培养系统中的某些物理特性如：剪切力、黏度、渗透压和气体传递速度等。

8无血清培养基的优点？答：优点：①可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性。

②避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染；③避免血清组分对实验研究的影响；④有利于体外培养细胞的分化；⑤可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。

（缺点：主要表现为细胞的适用范围窄，细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养的保存和应用不如传统的合成培养基方便。

）9动物细胞大规模培养的方法有哪些？答：③根据生产实际：贴壁培养、悬浮培养和贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）。

（①根据培养细胞的种类：原代细胞培养和传代细胞培养。

②根据培养基的不同：液体培养和固体培养。

）10动物细胞悬浮培养的优缺点？答：优点：适用的细胞较广；容易更换培养液；容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度。

缺点：操作比较麻烦；培养条件不易均一；传质、传氧较差；不能有效监测细胞的生长；需要合适的贴附材料和足够的面积；扩大培养比较困难，投资大。

11动物细胞贴壁培养的优缺点？答：优点：操作简单，培养的体积大、成本低；培养条件比较均一；传质、传氧较好；传代时无需消化分散；容易扩大培养规模。

缺点：由于细胞体积较小，难采用灌流培养，细胞密度较低12动物细胞包埋或微囊培养的优点？答：（1）、包埋在在体内的细胞可以获得保护，避免了剪切力的损害。

（2）、可以获得较高的细胞密度，一般都在10^7~10^8个/ml以上。

（3）、可以使产品浓缩在微囊内，利于下游产物的纯化。

（4）、可以采用多种生物反应器进行大规模培养。

13动物生物反应器的作用、类型及应满足哪些条件？答：应满足的条件：材质无毒；结构的传质、传热和混合性能；密封性好；参数能自动检测和调控；长期连续运转；内面光滑、无死角；拆装、清洁、维修和消毒；设备成本。

动物生物反应器的作用：是给动物细胞的生长代谢提供一个最优化的环境，从而使其在生长代谢过程中产生出最大量、最优质的所需产物。

反应器类型：搅拌罐式反应器、气升式生物反应器、中空纤维式生物反应器、透析袋或膜式生物反应器和固定床或流化床式生物反应器。

14免疫导向疗法为什么没有成功？从哪些方面可以对单克隆抗体进行改造？答：阻碍：A．单克隆抗体的均是鼠源性抗体，应用于人体可内可产生人鼠源抗体，加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有5-6h，难以维持有效药物的作用靶组织时间。

B．完整的抗体份子Ig分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。

改造：A．降低单克隆抗体的免疫原性。

B．降低单克隆抗体的相对分子质量（1）人-鼠嵌合抗体：由人抗体的恒定区与鼠源单抗的可变区融合得到。

（2）.改型抗体：把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体（3）小分子抗体小分子抗体包括：Fab、Fv或ScFv、单域抗体、最小识别单位。

这些部位都可以改造。

15单克隆抗体的制备流碳胺椒ā?流程：将有用抗原免疫过的淋巴细胞与骨髓瘤用PEG进行杂交融合。

①把融合的细胞在HAT培养基上选择出来。

②将选择后的整合细胞分散，培养成杂交瘤细胞。

③使能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆化。

④杂交瘤细胞抗体的性状的鉴定。

⑤单克隆抗体的大量制备，一是在培养液中大更是繁殖，二是注入纯系小鼠腹腔中大量繁殖。

⑥单克隆抗体的纯化。

制备方法：体内诱生法和体外法。

16动物体内诱生法制备单克隆抗体的优缺点答：优点：简单，比较经济，所得单克隆抗体量较多且效价较高，可有效地保存杂交瘤细胞株和分分离已污染的杂菌的杂交瘤细胞株。

缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。

鼠源性单克隆抗体改造后的抗体类型及各自的特点？答：①人-鼠嵌合抗体：保持鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性，但对人免疫原性大幅下降了。

②改型抗体：鼠源性单克隆抗体的互补决定区（CDR区）序列替换人的Ig分子中的CDR序列。

基本消除免疫原性。

③小分子抗体：a) Fab 将Iｇ的重链在铰链区的C端裂解，获得两个完全相同的抗原结合片段。

才铰链区和二硫键相连。

有完整的生双价抗体活性，相对分子质量减少为三分之一，排斥反应也降低，人体内很稳定。

b) Fv 含有L链和Fd链一半的N端可变区。

有完整的抗体相似的结能力，相对分子质量减少为六分之一。

④单链抗体scFv：单链易改造；体内半衰期短，免疫原性低；稳定性低，重轻链之间的分子间作用力弱；功能单一，只能与一种抗原特异性结合；亲和力低，稳定性差，体内清除过快。

⑤单域抗体：只由一个CDR构成。

17．多功能抗体的优点。

答：具有高亲和力性能，由于具有多个结合价，可同时与细胞膜上相邻的两个或多个靶抗原结合，与肿瘤细胞表面抗原的多价结合有利于肿瘤的影像分析及治疗。

18．有应用价值的多功能抗体应具备有哪些特征。

a) 能高选择性，高亲和性地同靶抗原或肿瘤相关抗原结合。

b) 在血循环中，与效应细胞或细胞毒触发分子有较低亲和力。

c) 应为人源化抗体，最大限度地减少人抗鼠蛋白的排斥反应，使得复给药不受限制。

d) 分子应大小适中，既能渗透到肿瘤组织内部，又能保证适当的滞留时间。

19 抗体导向酶-前药疗法中酶和前药有哪些要求？答：（1）、对酶的要求：活化酶最好来自非哺乳动物，而人体内不存在相应的类似物，以保证高度的特异性。

酶还能通过化学交联与单抗结合，在较长的一段时间内保持稳定性和活性。

对前药的要求：前药本身应无活性或活性很低，只能被相应的酶活化为高度扩散性的小分子，以实现在肿瘤组织内的广泛分布和杀伤肿瘤细胞。

而且前药还应具有极短的生物半衰期，避免重新进入循环产生非特异性毒性。

1、次级代谢作用的定义及产物的特征？答：（1）定义：是由特异蛋白质调控产生的内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合体现。

2）产物特征：a：有明显的分类学区域界限。

b：其生物合成需在一定的条件下才能发生。

c：缺乏明确的生理功能。

d：是生物活动的多余成分。