喜树碱的研究进展

喜树碱的研究进展
摘要现代临床试验表明喜树碱（Camptothecin,CPT）是一种具有抗癌活性的生物碱，它对膀胱癌、脑癌、肝癌等30余种恶性肿瘤都有不同的程度的疗效。

本文从喜树碱的研究历史、喜树碱的抗癌活性、喜树(Camptotheca acuminate. Decne) 中喜树碱的资源、化学合成喜树碱以及采用生物技术获得喜树碱等方面综述了喜树碱的研究进展，旨在为今后喜树碱进一步开发利用提供依据。

关键词喜树碱；抗癌活性；喜树碱来源
Abstract Modern clinical experiment shows that Camptothecin is a kind of alkaloid possessing antitumor ctivities in different cancers,such as bladder cancer 、cerebrum cancer、liver cancer and so on.. In this paper, In order to offer foundation for further researching Camptothecin hereafter,
an overview is given on advances in the research of Camptothecin from the following aspects: the history of Camptothecin development、antitumor activity of Camptothecin、sources of Camptothecin in Camptotheca acuminate. Decne、composing Camptothecin in chemical method and obtaining Camptothecin in biological technology, etc.
Key words Camptothecin；antitumor activity；sources
喜树(Camptotheca acuminate.Decne.)为珙桐科(Nyssaceae)喜树属（Camptotheca Decne.）植物[1]，是我国的南方特有的落叶乔木树种,分布于我国长江流域及西南各省和印度部分地区，台湾、广西、河南等地也有栽培。

1998年8月被批准为第一批国家重点Ⅱ级保护野生植物。

研究表明，喜树中含有的一种生物碱—喜树碱（Camptothecin,CPT）具有抗癌活性。

现代临床试验表明CPT 及其衍生物对膀胱癌、脑癌、乳癌、宫颈癌、结肠癌、神经腹质癌、何杰金氏病（淋巴网状细胞癌）、肺癌、淋巴癌、黑色素癌、卵巢癌、胰腺癌、儿科癌瘤、前列腺癌和肝癌等30余种肿瘤都有不同的程度的疗效。

本文从喜树碱的研究历史、喜树碱的抗癌活性、喜树(Camptotheca acuminate. Decne) 中喜树碱的资源、
化学合成喜树碱以及采用生物技术获得喜树碱等方面综述了喜树碱的研究进展，旨在为今后喜树碱进一步开发利用提供依据。

1喜树碱的研究历史
喜树碱是喜树的根、皮、茎和种子中的生物碱。

1966年美国北卡罗纳大学、伊利诺伊大学和NCI的研究人员首次从喜树茎中分离得喜树碱并确定了它的化学结构式（见图1）。

喜树碱在体外对Hela细胞和L1210细胞及啮齿类动物显示较强的抗癌活性[2] ，该发现引起了人们的极大关注。

在70年代，人们将喜树碱初步应用于临床，发现喜树碱对部分病人胃肠癌的症状有所缓解，但对人体的消化系统和泌尿系统的毒性太大,引起病人难以忍受的生理反应，如恶心、呕吐、胃肠炎、出血性膀胱炎、尿频、尿痛等，同时喜树碱的溶解度低，将喜树碱制成钠盐后抗癌活性降低。

诸多原因几乎使喜树碱的临床研究陷于停顿，喜树碱的研究进入低潮阶段[3-6]。

1985年，Y.H.Hisang等发现喜树碱发挥抗癌活性是能特异性地抑制拓扑异构酶Ⅰ(TopoosomeraseⅠ，TopoⅠ)的活性而非拓扑异构酶Ⅱ（TopoosomeraseⅡ，TopoⅡ），这正是喜树碱独特的抗癌机理[7]，这一发现掀起了喜树与喜树碱研究的新高潮。

自1985年来,尤其是进入90年代后,美国、日本、加拿大和英国等国家积极投入大量的人力和物力进行喜树与喜树碱的研究，使喜树成为继红豆杉之后第二个重要的木本抗癌药用植物，对喜树的研究与喜树碱的开发已成为世界性的热门研究课题。

图1、喜树碱的化学结构式
2 喜树碱的抗癌活性机制
喜树碱的独特抗癌活性机制被誉为二十世纪90年代抗癌药物的三大发现之一[8] 。

喜树碱的抗癌活性与TopoⅠ有关，人的TopoⅠ为单体酶，共含765个
氨基酸，定位于第20号染色体上[9]。

人的TopoⅠ是存在于人体细胞内具有调节细胞核空间结构变化和控制核酸生理功能的酶,参与调节DNA的拓扑构象,涉及DNA复制,DNA修复以及RNA转录等机制。

喜树碱主要作用细胞周期的S期，使细胞终止在G2期。

DNA在复制的过程中，DNA双链解开分成两股单链，在复制过程中形成一种Y字形结构的结构即复制叉（replication）。

随着复制叉上DNA的分离，叉前的双链的DNA变得更加正超螺旋化，而这种超螺旋的积累是DNA解旋酶消除了两链间碱基部分的结果。

如果没有机制来消除这些超螺旋累积的话，复制机器将在不断上升的压力面前陷于停顿[10]。

（图2、DNA复制过程中产生正超螺旋。

）
图2、DNA复制过程中产生正超螺旋
（来源：J.D.沃森，T.A.贝克，S.P.贝尔，A.甘恩编著，M.莱文，R.M.洛斯克，杨焕明等译.基因的分子生物学[M].科学出版社，2007：202。

）
研究表明TopoⅠ能够消除超螺旋的积累。

TopoⅠ为了发挥功能，能够催化DNA双链中的一条的断裂与再连接反应。

首先TopoⅠ与正超螺旋结合，TopoⅠ活性部位的酪氨酸残基攻击DNA的一条链上的磷酸二酯键，可使DNA的一条链断裂产生一个缺口，可使链的末端沿螺旋轴按拧松超螺旋的方向转动，从而消除这种正超螺旋累积。

同时TopoⅠ通过磷酸-酪氨酸键连接其中一个断端。

DNA的另一端带有一个游离的羟基，这个末端被酶牢牢的控制。

当来自DNA断端的游离羟基攻击磷酸-酪氨酸键，最终重新形成磷酸二酯键，重新连接DNA链，并释放拓扑异构酶1。

即将切开的DNA 单链再连接[10]。

（图3、TopoⅠ与DNA的复合体结构；图4、TopoⅠ通过酪氨酸-DNA中间体切开DNA；图5、TopoⅠ催化反应模型。

）
图3、TopoⅠ与DNA的复合体结构
（来源：刘展眉，崔英德，宾淑英。

喜树及喜树碱研究中的生物技术应用[J]。

广东化工：2006（6）33：67～69。

）
图4、TopoⅠ通过酪氨酸-DNA中间体切开DNA。

a.断开和重连接反应。

为简便起见，这里只显示单条DNA链。

b.磷酸—酪氨酸共价中间体的详细结构。

（来源：J.D.沃森，T.A.贝克，S.P.贝尔，A.甘恩编著，M.莱文，R.M.洛斯克，杨焕明等译.基因的分子生物学[M].科学出版社，2007：124。

）
图5、TopoⅠ催化反应模型
5.1.2 以喜树的茎为外植体进行组织培养
在1974年，日本的Sakato等[36] 报道了以喜树的茎为外植体诱导出愈伤组织，其喜树碱的含量为0.0025%。

1992年，荷兰的Hengel等[37]也以喜树的茎为外植体诱导出了愈伤组织。

马林[38] 以茎段为外植体进行组织培养，以MS 为基本培养基，添加不同质量浓度的6-BA、NAA和2,4-D，通过研究愈伤组织培养的适宜条件，结果表明，在MS+6-BA 2mg/L+NAA2 mg/L+2,4-D2mg/L的诱导较好，愈伤组织在MS+6-BA1mg/L+ 2,4-D1mg/L的培养基上继代培养，愈伤组织生长速度快。

林桂芸[39]等用喜树带芽茎段为外植体，采用正交试验法，研究不同浓度激素对离体愈伤组织和腋芽诱导的影响。

试验结果表明：最佳启动培养基和诱导培养基分别为MS+6-BA 2.0mg/L +IBA1.0 mg/L和B5 +6-BA 2.0 mg/L +IBA.0 mg/L。

吕立堂等[40] 以喜树幼苗的茎尖作为外植体，在附加不同激素的培养基上培养。

结果表明，在B5+6-BA0.2 mg／L+IBA 0.05 mg／L+AS(afenine sulfate)10 mg／L的培养基上培养对丛生芽的诱导与增值效果最佳，在B5+IBA 0.5 rng／L+KT0.1rng／L+AS10 rng／L的生根效果最佳。

试管苗移栽到珍珠岩-土壤(3：7)的基质中生长良好，成活率高达96 %。

5.2 喜树细胞悬浮培养
植物细胞悬浮培养技术是当今药用植物实现工业化生产的必经之路，目前已在红豆杉、甘草、人参和黄连等多种药物的生产中取得了成功。

通过不断改善植
物细胞体外培悬浮培养条件，可大大地提高生物细胞中次生代谢的含量，并且还可以通过向培养基中添加药物合成的前体物质，经培养将其转化为目的化合物，以此来增加有效成分的含量；另外，对悬浮培养的细胞进行特定的生物遗传转化反应，也将获得新的药物成分，从而可很好地实现了天然植物大规模工业化生产药物的目的。

喜树细胞悬浮培养体系的建立受多种因素影响，合理的外植体的类型、激素水平以及培养中的其他物质对喜树细胞培养体系的建立起着重要作用。

潘学武等[41]用喜树幼苗的下胚轴诱导的愈伤组织进行悬浮培养,研究了基本培养基、激素和培养条件对培养物生长的影响,测定了培养细胞生长和喜树碱积累的动态变化。

结果表明，在在MS培养基中细胞生长良好,细胞分散性和喜树碱积累优于在其他类型的培养基。

最佳激素组合为2,4-D 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+ 6-BA 0.5 mg/L,细胞继代周期以12 d左右为宜,悬浮细胞适合在22-26℃,120 r/min下生长。

高桂珍等[42]以喜树幼嫩叶片为材料进行细胞悬浮培养，结果表明，在光照条件下培养细胞生长周期30 d;在黑暗条件下培养细胞生长周期为27 d,细胞的增殖曲线呈“S”形;在黑暗和光照(2000 lx,10 h/d)下下培养，其培养液pH值先下降后回升；培养细胞中可溶性蛋白质含量及过氧化物酶活性均出现两个峰值,但出现的时间不同。

顾青[43]等用喜树的顶芽、叶片、茎段为外植体诱导喜树愈伤组织进行细胞悬浮培养，在B5+NAA1.0mg/l+2,4-D0.5 mg/l+KT0.5 mg/l培养基上培养，同时在培养基中添加了0.001、0.002 mg/ml L-色氨酸，结果表明，L-色氨酸对喜树愈伤细胞的生长没有明显影响,但是促进喜树愈伤组织细胞合成喜树碱,喜树碱含量比未添加L-色氨酸培养的愈伤组织细胞增加了3倍。

顾青[44]以喜树的嫩枝条为材料，在添加了Cu2+的B5培养基中培养，结果表明，在B5培养基中添加0.008mg/mL CuCl2时,对喜树愈伤细胞的生长没有明显影响,但是对喜树愈伤细胞合成CPT的促进作用最强, CPT含量比未诱导前增加了约30倍。

于放等[45] 将水杨酸（SA）应用于喜树细胞培养体系中，通过添加不同浓度的水杨酸，结果表明SA可以增强喜树细胞的次级代谢作用，有利于代谢产物喜树异碱A和喜树异碱B（与喜树碱有部分类似结构的生物碱）的合成。

5.3 喜树毛状根培养
当今在全球范围内，人们都在不同程度地使用中药材，中药材由于其价格低廉副作用低被越来越多的人所认可，消费量与日俱增，但随之中药材资源被大范围的破坏，部分珍贵的野生药用资源面临灭绝的局面，同时,许多中药材生存环境特殊,很难大面积栽种或在自然状态下有效成分含量很低,因此单纯依靠野生和栽培资源很难满足工业化生产要求,同时易造成资源枯竭。

因此如何采取有效措施保护与保存现有资源、寻找和开发新资源已迫在眉睫。

利用生物技术的方法生产药用植物的有效成分，为保护中药材的野生资源和生态环境，具有重要理论和应用的价值。

毛状根培养是20世纪80年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项技术,它是将发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA整合到植物细胞的DNA上,诱导植物细胞产生毛状根.如今,植物毛状根培养被认为是获得有用次生代谢产物的重要途径.如何在培养过程中提高毛状根中有用次生代谢产物的积累能力成为人们关注的焦点.毛状根培养相对于细胞培养具有遗传和生物化学方面的稳定性,毛状根可以在不含激素的培养基上快速生长并可以大量积累经济价值较高的次生代谢产物.因此,毛状根被认为是极好的获得植物次生代谢产物的原材料.近年来培养珍贵药用植物毛状根来获取次生代谢产物成为国内外研究的热点.1998年以前就已建立了大约31科100余种植物毛状根的培养系统,其中大多为珍贵药用植物,如黄花烟草、曼陀罗、颠茄、莨菪、长春花、紫草、红豆杉、人参、黄连等.之后,国内科研人员相继成功建立了大黄、栝楼、菘蓝、野葛、决明、龙葵、何首乌、商陆等毛状根培养系统.
5.3.1毛状根培养的原理
毛状根培养是通过将发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA整合到植物细胞的DNA上,诱导植物细胞产生毛状根.
发根农杆菌是存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌[46]。

在发根农杆菌细胞中含有Ri 质粒, 其上有一段T- DNA。

发根农杆菌能够感染大多数的双子叶植物和少数单子叶植物[47]及个别的裸子植物[48、49]的伤口，在感染植物的伤口时，它将细胞中的Ri 质粒中上的T- DNA 插入到植物基因组中，诱导植物的伤口产生毛状根。

根据Ri质粒转化植物后产生的毛状根合成冠瘿碱(opine)的类型不同，将Ri质粒分为4种类型：甘露碱型(Mannopine type)、黄瓜碱型(Cucumopine type)、米奇矛型（Mikimopine-type）和农杆碱型(Agropine type)。

但农杆碱型的质粒的发根农杆菌一般比其他三种类型的农杆菌具有更广泛的宿主范围和更强的致根特性[50]。

Ri质粒具有2个非常重要的功能区即转移区(T- DNA)和致病区(Vir区)。

农杆碱型Ri 质粒上的T- DNA 是不连续的, 分为TL- DNA 和TR- DNA（图10、农杆碱型Ri质粒的结构。

）
TL- DNA 和TR- DNA 可分别插入寄主植物的基因组中。

TL- DNA 上存在rol（root loci）A、B、C、D基因群（称core T—DNA）[51]，它决定形成毛状
根和毛状根的形态特征以及再生植株的茎、叶的形态和一些生理性状。

TR- DNA 区域含有编码合成农杆碱的基因(ags)和合成生长素(IAA)的基因(tms-1和tms-2), 后者指导IAA 的合成, 因此转化产生的毛状根是激素自养型的,诱导成功的毛状根可无激素的液体培养基疯狂地生长。

甘露碱型和黄瓜碱型Ri质粒的T- DNA 是连续的。

图10、农杆碱型Ri质粒的结构。

三种类型的质粒的Vir 区具有很高的保守性, 它们在转化过程中并不发生转移, 但它对T- DNA的转移起着极其重要的作用。

它的缺失或突变都不能形成毛状根。

Vir区含有
7个基因（VirA- G）, 在通常情况下,除VirA 一直处于活性表达状态而其它的6 个基因通常情况下处于抑制状态。

植物受伤后会在伤口处产生特殊的小分子酚类化合物，如乙酰丁香酮。

当发根农杆菌感染寄主时，酚类化合物可以与Vir A 基因的表达产物结合，诱导其他6个基因（VirB- G）的活化，产生一系列限制性核酸内切酶, 在限制性核酸内切酶的作用下，将Ri质粒中的T- DNA切断。

然后T- DNA与细菌细胞膜上的特定部位结合，再向植物细胞转移，进入细胞核，最后整合到细胞核的基因组中[52、53]。

Lorence等[54]用发根农杆菌ATCC15834 诱导喜树的子叶、下胚轴和真叶都得到了喜树的毛状根，每克干重的毛状根CPT的含量也为1. 0mg。

刘展眉等[55] 用发根农杆菌A41.2526诱导喜树外植体产生了毛状根，初步建立了喜树碱毛状根产生体系。

经过PCR和甘露碱检测，结果表明发根农杆菌Ri质粒的rolB基因已经整合到喜树毛状根基因组中并得到表达。

6 喜树碱的其他功能
根据冉玉平报道[56]喜树碱对治疗银屑病有很好的疗效，喜树碱能治疗银屑病的作用可能是因为喜树碱抑制皮肤中分裂较快的上皮细胞的有丝分裂,使棘层细胞增殖减慢和角化不全消失。

刘晓明等[57] 探讨了喜树碱在体外对人脐静脉
血管内皮细胞ECV304增殖抑制和凋亡诱导作用，结果显示喜树碱可能具有抗血管生成作用,这种作用可能与喜树碱能抑制TopoⅠ的活性有关.。

以色列Ben Gurion大学的Priel 和其他同事发现TopoⅠ在HIV 复制中非常活跃，低剂量的CPT能阻断被感染细胞HIV 的复制[58]。

7 展望
进入21世纪以来，癌症已经成了人类健康的一大隐患，严重威胁着人类的健康。

传统的抗癌药物紫杉醇、长春碱等，由于价格昂贵、产量低，难以满足医药卫生事业的需求，寻找新型抗癌药物势在必行。

喜树碱的独特抗癌活性机制掀起了喜树与喜树碱研究的高潮，
美国、日本、加拿大和英国等国家积极投入大量的人力和物力进行喜树与喜树碱的研究，我国是喜树资源的大国，我们应当积极地运用现代生物学、现代化学、现代物理学等当今最新科学技术,走自主创新道路，积极开发喜树碱资源，将我国喜树资源优势转化为经济优势，促进我国经济的发展，服务于人类。

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