中药注射剂生物活性试验的指导原则- 修改稿

中药注射剂生物学活性测定的指导原则（讨论纲要）
中药注射剂具有成分复杂多变，活性成分和未知成分多，功能和主治面广，作用部位和作用靶点多等特点。

为保障中药注射剂临床用药的有效性和质量可控性，在质量标准中理化分析的基础上增加与功能主治、主要药效相关的”生物学活性测定”项目,可进一步完善质量标准、提高药品质量。

中药注射剂可参考本指导原进行设立”生物学活性测定”项方法学研究和适用性研究。

一．方法选择：
应选择与功能主治相关的1-2(或更多)种主要药效学动物模型作为生物学活性测定方法，方法力求设计合理、操作简便、指标明确、灵敏度高、重现性好，尽可能使用小动物，以限度试验为主。

可用体内试验，也可用离体器官、血清、培养细胞、微生物等进行试验。

试验设计：
可采对照组和给药组进行比较、或给药前后比较的方法，用质反应或量反应指标进行统计学处理。

小动物5～10只一组、也可根据试验要求用更少的动物。

初试时可仅设阴性对照组和给药组比较，结果统计学处理如为阳性（差异显著）则符合要求。

结果评价：
如结果为阴性或可疑阳性（差异不显著），在复试中再增加动物数并增设阳性对照组，复试结果可单独评价，也可与初试结果合并统计计算综合评价,如阳性对照组结果阳性而供试品仍为阴性，则生物学
活性测定结果”阴性”。

鉴于中药注射剂成分及生物学活性测定方法的复杂性和变异性，在试行标准生物活性测定项目中可考虑采用2项以上生物活性测定方法，规定其中有1项阳性即为结果”阳性”而符合规定。

生物学活性测定方法内容：
内容一般包括试验设计、操作方法、供试品配制、给药限值剂量、阳性对照品、观察指标、结果评价（初试和复试）
二．剂量限值：
按临床用药剂量（平均公斤剂量）的30倍以下（一般20倍以下）计算最大给药剂量，以不同剂量静脉注射或其他注射途径，一次或多次给药，按观察指标观察量效反应关系，选择作用明显和确切的剂量作为剂量限值。

限值一般应低于急性毒性试验的最小致死量（MLD）。

三.阳性对照：
限度检查中的阳性对照药主要用于检测方法的可靠性和结果的重现性而非生物活性的定量测定。

为提高复试时阳性对照组反应结果的重现性,可选用含量和纯度高、具有确切类似药理作用的中药有效单体成分注射剂或化学药品注射剂作为阳性对照药，首选药理作用类似的中药注射剂。

阳性对照药应经量效试验确定在各实验室间可重现的确切的剂量限度。

四.方法验证：
生物学活性测定要进行重复性、检出限、重现性的验证，考察生物检定方法与理化分析和功能主治的相关性，方法的可靠性。

重复性验证应在同实验室用符合理化分析质量标准的同一批供试品进行6次试验或2批不同来源供试品各进行3次试验。

检出限验证可采用多家企业的多批（6批以上）同种供试品进行测定。

重现性验证应在2个以上不同实验室进行同一批供试品试验。

验证用供试品理化分析必须符合质量标准规定。

有条件时，应结合理化分析结果进行全面评价（如不同含量的供试品与生物学活性测定的相关性）。

五.生物学活性测定方法参考：
1．活血、化瘀、舒脉、通络─大鼠血小板聚集试验、血小板聚集试验(体外法)、小鼠耳廓微循环试验、大鼠动静脉短路血栓检定法2．中风、脑缺血─小鼠脑循环障碍试验(颈总动脉结扎法)、小鼠脑缺血和体内血栓形成试验(胶原蛋白-肾上腺素法)、小鼠耐缺氧试验
3．胸痹、心肌缺血─大鼠垂体后叶素致心肌缺血试验、小鼠耐缺氧试验(异丙基肾上腺素预处理法)
4．清热、镇痛一大鼠、家兔解热试验，小鼠扭体试验
5．祛风湿、抗炎一小鼠耳肿胀试验，大鼠角叉菜肿试验、大鼠酵母足肿试验（抗炎、解热）
6．厥脱症、抗休克一大鼠、家兔、猫失血性休克试验,小鼠、大鼠、家兔内毒素性休克，微循环障碍
7．解毒一体内外抑菌试验，小鼠碳末廓清试验等免疫增强试验8．利胆、保肝一小鼠、大鼠急性肝功能损伤试验、大鼠利胆试验9．子宫收缩一大鼠离体或在体子宫试验(用药液或动物血清) 10．平喘一离体豚鼠气管试验，小鼠、豚鼠过敏性止喘试验、小鼠扩瞳试验(适用于洋金花类中药)
六．中药注射液生物学活性测定举例：
(一).心脑血管药物
例1：活血化瘀功能—大鼠血小板聚集功能试验：
取体重约200g~240g的大鼠，雌雄各半，随机分组,每组6~10只,设阴性对照组,阳性对照组,给药组。

阴性对照组注射氯化钠注射液，阳性对照组注射磷酸川芎嗪注射液或双嘧达莫注射液、阿魏酸钠注射液，给药组注射限值剂量供试品，单次或多次注射给药。

测定前夜停食不停水，末次给药后1小时，麻醉，腹主动脉取血，3.8%枸缘酸9︰1抗凝，1000rpm 离心5分钟制成富血小板血浆（PRP），2000rpm 离心10分钟制成贫血小板血浆（PPP），用血小板聚集测定仪比浊法测定血小
板最大聚集率,每只大鼠取PRP 0.2ml置于比浊试管中,将0.2mlPPP置于另一对照测定管中校正100%透光率,预热2分钟,在0.2mlPRP测定管中加入50μmolADP溶液20μl(或其他血小板聚集剂),记录5分钟内血小板最大聚集率,计算各组平均值和标准差,分别比较给药组、阳性对照组与阴性对照组之间差异的显著性（t测验）,差异应有显著意义(P<0.05),并计算给药组和阳性对照组相对于阴性对照组的抑制率,应在30%以上。

(尚可考虑用血小板凝集体外测定法)
例2：活血化瘀、主治脑缺血—小鼠脑缺血和体内血栓形成试验
取体重20~30g小鼠,随机分成3组,每组10只, 设阴性对照组,阳性对照组,给药组。

阴性对照组注射氯化钠注射液，阳性对照组注射尼莫地平注射液（0.4mg/Kg）或磷酸川芎嗪注射液，给药组注射限值剂量供试品，单次或多次注射给药。

末次给药后1小时,各组小鼠尾静脉注射氯化钠注射液配制的血栓诱导剂0.1ml/10g体重(内含胶原蛋白300μg/ml盐酸肾上腺素13μg/ml,用前等量混合制成诱导剂)。

注射后即刻观察15分钟内小鼠偏瘫恢复数。

结果以卡方测验(确切概率法)进行统计,差异应有显著意义(P<0.05),或计算小鼠体内血栓的保护率,阴性对照组应在20%以下,阳性对照组和给药组应在30%以上。

(尚可用大鼠动静脉短路血栓检定
法)
例3: 活血化瘀、舒脉通络，主治脑缺血—小鼠脑循环障碍试验
取小鼠，雌雄各半，体重25 1g，随机分为3组，每组10只，模型阴性对照组，给予等量的氯化钠注射液；给药组；阳性对照组注射尼莫地平注射液0.4mg/kg或川芎嗪、葛根素注射液。

于试验当日，各组小鼠以乌拉坦1.0g/5ml/kg腹腔麻醉，仰卧位固定，颈中线切口，分离左、右两侧颈总动脉，以0号手术线将双侧颈总动脉连同迷走神经一同结扎，随即自小鼠尾静脉注射给药一次，给药体积20ml/kg，给药速度为1ml/2min，给药后记录小鼠存活时间（每分钟呼吸少于或等于5次为死亡，存活时间超过60秒以60秒计），结果经对数转换进行t测验。

或计算20分钟内动物死亡数，进行卡方测验，差异应有显著意义。

(尚可用小鼠耐缺氧试验)
例4..主治心肌缺血—垂体后叶致大鼠心肌缺血法
取体重约200g~240g的大鼠，雌雄各半，随机分组,每组10只,设阴性对照组,阳性对照组,给药组。

阴性对照组注射氯化钠注射液，阳性对照组注射灯盏花乙素、磷酸川芎嗪、葛根素等。

给药一定时间后静脉注射垂体后叶素0.5或0.75u/kg,注射速度为5~10秒。

注射后即刻、15秒、30秒、1分、2分、5分重复记录Ⅱ导联心电图（可根据示波器异常显示），判断心肌缺血反应动物,反应变化阳性指标为T波升高、ST段抬高0.1mv(30秒以内),以及T波低平、双向、倒置、ST下移超过0.1mv、P-R及Q-T间期限长、心率变慢。

记录各组具有上述反应指标一项以上的反应动物数,用精确概率法对给药组、阳性对照组与阴性对照组进行卡方测验,差异应有显著意义(P<0.05)。

(尚有小鼠异丙肾上腺素给药后耐缺氧试验、培养心肌细胞缺血样损伤法、测走心肌缺血动物血清中生化指标的方法)
例5：活血化瘀、舒脉通络—对微循环障碍小鼠耳廓微循环的影响
取体重为18～22g的小鼠，随机分为3组，分别为供试品组、阳性对照组和模型对照组，每组10只，雌雄各半。

各组分别给供试品、氢溴酸山莨菪碱和氯化钠注射液，末次给药后1h，腹腔注射戊巴比妥钠50mg/kg麻醉，麻醉后，在载玻片上滴一滴橄榄油，将小鼠左耳平展、固定。

用透射或反射冷光源在50～80倍光镜和目镜测微尺观测微管管径、毛细血管网交点、红细胞聚集程度、微血管血细胞流速（选择最显著指标，可因药而异）。

造模采用皮下注射肾上腺素注射液0.8mg/kg（或10%高分子右酐10ml/kg），造模前和造模后5、10、20、30分钟观测同一部位上述指标（时间选择可因药而异），计算造模前后不同时间的变化值和统计给药组、阳性对照组与模型对照间变化值差异的显著性，差异应显示显著意义(P<0.05)。

(尚可用微循环测定仪测定耳廓微循环和其他部位微循环)
观察指标的标准[7]
微血管管径（+）
微血管血细胞琉速（+）
红细胞聚集程度：（+）
0级：血流无胶囊感。

1级：轻度聚集，血流明显有胶囊感，轴流、缘流混杂。

2级：中度聚集，红细胞聚集成较大的、大小不等的团块，较紧密。

3级：重度聚集，多个红细胞聚集成密集团块，外形不整，大小不等，与血浆分离。

毛细血管交点数：（+）
选取面积为1mm2的四周由毛细血管围成边界的固定区域，计数该区域内毛细血管与边界血管的交点数。

例6：活血化瘀—对大鼠血浆纤维蛋白原含量的影响
取体重300g左右大鼠。

按性别、体重随机分为组，每组均为6~10只，雌雄各半。

设阴性对照组、供试品组和阳性药对照组（注射用降纤酶10U/kg IV给药1次），各组分别给药
（给药容量均为10 ml/kg），末次给药后30分钟均用毛细管从眼眶静脉丛取血1ml，3.8%枸橼酸钠抗凝（抗凝剂与全血的比为1：9），2500rpm离心15min，取上清夜在LG-PABER 凝血因子分析仪上测定血浆纤维蛋白原的含量，经t测验比较。

供试品组和阳性药对照组与阴性对照组间差异应有显著意义。

例7：耐缺氧-小鼠耐常压耐缺氧试验
取20g±1g小鼠20只，随机分为两组，每组10只，设给药组和空白对照组，注射等容量的供试品和氯化钠注射液(或连续给药)，末次给药后3分钟，将小鼠放入盛有钠石灰的250ml 广口瓶内，每次每组1只，用凡士林将瓶口密封，立即计时，以停止呼吸为标准观察小鼠存活时间。

进行组间存活时间显著性统计。

(1.也可采用LT50作为指标，2.可预先皮下注射硫酸异丙肾上腺素20mg/kg,测存活时间或用特定装置测氧耗量)。

(二).抗休克药物
例1：感染性休克-D-氨基半乳糖(或放线菌素D)敏化小鼠内毒素攻击试验(中-292,291)
取昆明种小鼠30只,随机分成3组，雌雄各半，地塞米松组于内毒素攻击前30分钟皮下注射,给药组注射供试品，对照组注射氯化钠注射液，末次给药后1小时，各鼠腹腔注射800mg/kg(放线菌素D125mg/kg)及大肠杆菌内毒素100μg/kg(Difco产品),观察动物死亡情况。

(D-氨基半乳糖由于肝毒性可提高内毒素的敏感性，剂量在600～1000mg/kg调节,同时调节内毒素剂量使小鼠90%左右死亡,放线菌素D由于免疫抑制作用而提高内毒素的敏感性,大肠杆菌内毒素剂量约为50μg/kg,灵敏度约可提高200～400倍)
例2: 感染性休克-对小鼠内毒素性休克死亡的影响(中-1108)
取同种系小鼠(体重18～22g)20只，随机分为2组，给药组注射供试品，对照组注射氯化钠注射液，末次给药后24小时，静脉注射2LD50的内毒素溶液，记录24小时内小鼠死亡数(细菌内毒素按其来源种类很多，常用有大肠杆菌、鼠伤寒杆菌、痢疾杆菌，可用毒力菌株增菌培养除菌分装后制得粗制内毒素,用鲎试剂测定效价并求出小鼠的LD50)。

例3.益气固脱、回阳救逆-肢体股动脉夹闭性休克生存率试验(中-1120)
取小鼠20只，随机分成2组，给药组注射供试品，对照组注射氯化钠注射液，末次给药30分钟后，小鼠均用16#橡皮圈在小鼠双后肢近端最高位置结扎(应扎紧，无水肿)，4.5小时后解除结扎，记录解除结扎后12、15、18、24小时各组动物生存数。

例4.解热-对致热家兔体温的影响(中-250)
取体温合格的健康家兔10只，按性别、体重分组2组，测肛温2次以均值作为正常体温，每兔分别注射致热物质后1～2小时升温0.8℃以上者作为致热家兔,按升温值均匀分成2组,给药组注射供试品，对照组注射氯化钠注射液，比较两组3小时内的升温值。

(致热物质包括细菌内毒素、啤酒酵母，2,4二硝基苯酚，用家兔也可用大鼠，用静脉注射也可用其他途径，以能取得稳定平稳的升温曲线为优,其中细菌内毒素国家标准品于家兔静脉注射10EU/kg或肌肉注射50EU/kg均可获得稳定的升温，但两者升温曲线不同。

5%、10%、20%酵母悬液于200g左右大鼠皮下注射10ml/kg在6小时℃至12小时间有不同程度的升温值，而且不同酵母升温值也不同; 2.4二硝基苯酚于大鼠皮下注射12.5～17.5mg/kg可在1～3小时得到近2℃的升温,因此用细菌内毒素标准品于家兔、2.4二硝基苯酚于大鼠比较适用于生物学活性测定)。

例5.厥脱症、失血性休克-猫失血性休克
将麻醉猫股动脉插管并连接储血瓶供放血和储血用，全身用肝素钠10mg/kg抗凝，开始放血每分钟为2mL，当血压低于10kPa(75mmHg)时，改为每分钟0.5mL放血使血压降至5.3KPa(40mmHg)，此时为失血代偿期，如血压下降，抬高储血瓶回输血液，待血瓶内最大放血量的40%的血液自动回输机体时作为失代偿期，总放血量为20～30ml/kg，此时再将全部放出的血液输出机体，同时静脉注射供试药，对照以等量氯化钠注射液注射，阳性药可用多
巴胺。

观察指标为平均动脉压、心率、体温、呼吸、心电图。

例6.厥脱症、失血性休克-家兔/大鼠失血性休克
家兔-麻醉，颈总动脉插管记录血压，股动脉放血，测血压、心率、体温等指标，快速放血于储血瓶(0.5克枸橼酸钠/100ml血，抢救用血)，血压降至40mmHg停止放血(约2/5全血量)，测各项指标后给药，再观察各项指标。

大鼠-iP戊巴比妥钠麻醉(50mg/kg)，股静脉插管注入肝素(1000U/kg)抗凝，颈动脉插管血压监测，股动脉在35℃下放血60分钟，前40分梯度放血(每10分钟分别为9ml/kg,6ml/kg,5ml/kg,2.5ml/kg均速放血)，本阶段放血为总量的40%(总血量按56ml/Kg 计算)，动脉压降至4.0kPa(30mmHg)左右。

后20分钟为血量调节期，失血后5～10分钟血压可回升至8.0KPa，此时开始慢速放血，并进行指标监测，当动脉压(MAP)降至4.0KPa即可停止放血。

即可给药。

平均失血率约为45～55%，平均存活时间为140分钟。

(三).清热解毒
例1.体内抑菌试验-对绿脓杆菌感染小鼠治疗试验(中-277)
菌液制备:培养，稀释，计活菌数，加5%胃膜素后制成细菌悬液备用
预试:选择引起80%～100%死亡的菌液量
实验治疗:18～22g小鼠20只，随机分成2组，给药组注射供试品，对照组注射氯化钠注射液，可在腹腔注射菌液前和后单次或数次给药，观察一定时间内各组动物的死亡率。

常用病菌感染浓度与死亡时间：金葡、10-2～10-3、24小时内。

痢疾、10-1、24小时内。

大肠、10-3～10-4、24小时内。

变形10-4～10-5、24～48小时。

绿脓、10-3～10-5、48～72小时。

肺炎、原液、24～48小时。

链球菌、原液、24～48小时。

例2．体液免疫功能—血清溶血素测定（血凝法保-26，HC50测定保27）
1．血凝法： SRBC制备--免疫动物及血清分离—凝集反应—数据处理及结果判断。

抗体水平=（S1+2S2+3S3+…nSn） 1、2、3、…n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别2．半数溶血值（HC50）测定法： SRBC制备—制备补体—免疫动物及血清分离—溶血反应—数据处理及结果判断。

HC50=稀释倍数×样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度。

例3．细胞免疫功能—迟发型变态反应（DTH，保24）
1．二硝基氟苯（DNFB）诱导小鼠DTH（耳肿胀法）
DNFB配制—致敏—DTH产生与测定（5天后攻击，测左右耳重）—数据处理与结果判定2．绵羊红细胞（SRBC）诱导小鼠DTH（足跖增厚法）
致敏（小鼠用2%SRBC腹腔或静脉免疫）—DTH产生与测定（4天后测足跖部厚度）—数据处理与结果判定
例4．单核-巨噬细胞功能：
1．小鼠碳末廓清实验（保28）
印度墨汁稀释—注射墨汁—注射后2、10min取血测定。

吞噬指数 a=（3√K×体重）/（肝重+脾重）， K=（lg0D2-lgOD10）/（t10-t2）
2．小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（保29，滴片法、半体内法）
（2006 。

8。

5）。