实验酶联免疫吸附测定

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免疫标记技术
用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原
或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可见的
或可测定的。
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免 疫 荧 光 技 术
用FITC-抗IgM单抗计数B细胞
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课程内容
▪ ELISA的原理 ▪ ELISA的分类 ▪ 间接ELISA的具体操作 ▪ ELISA在医学中的应用实例
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显色 反应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
黄色 红色
黄色 深蓝色
荧光 黄色
测定波长
nm
492 450 449 425 642
400 500
405 420
360,450 420
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结果的判定
肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜
色越深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。 根据颜色的深浅，以“＋”、“－”表示。各 组各人独立观察记录。
间接法的原理为 利用酶标记的抗抗 体以检测已与固相 抗原结合的受检抗 体，故称为间接法。
其优点在于只要 变换包被抗原就可 利用同一酶标抗抗 体建立检测相应抗 体的方法。可用于 传染病的诊断。
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夹心ＥＬＩＳＡ （检测抗原）
只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制 备酶结合物而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原， 例如HBsAg、HBeAg、AFP等。
▪ 弃去封闭液，用洗涤缓冲液（PBS/Tween20）洗板3次
▪ 加入一抗：加入不同稀释度的兔抗鼠IgG血清（ 100μl/孔），以 200×起始，空白对照孔用洗液代替， 37℃,20min
▪ 洗板3次
▪ 加入酶标二抗：加入HRP-驴抗兔抗体（ 100μl/孔）， 37℃,20min
▪ 洗板3次
▪ 显色：加入底物,100μl/孔。室温避光显色5-10min;
▪ 方法：直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA、竞争 ELISA等
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ELISA的原理
1.抗原抗体反应的特异性
2.抗原或抗体的固相化
E
3.抗原或抗体的酶标记
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ELISA的分类
（一）直接法 （二）间接法 （三）双抗体夹心法 （四）竞争法
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直接ELISA
酶标一抗
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间接法（测抗体）
酶联免疫吸附测定
（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA ）
免疫学教研室
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抗原-抗体反应的基本检测方法
凝集反应(agglutination):颗粒性抗原与抗体的反应。 沉淀反应(precipitation):可溶性抗原与抗体的反应。 补体参与的反应 免疫标记技术（immunolabelling technique）:用示 踪物质标记抗原或抗体，进行抗原-抗体反应的检测。
底 物/DH2
邻苯二胺(OPD) 四甲替联苯胺(TMB) 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉 磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
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竞争抑制法 （检测抗原）
待检抗原与标记抗原竞争结合抗体。
小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此 不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子 激素、药物等ELISA测定多用此法。
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待检HBcAb 标准HBcAg
wash
wash
标准酶标 HBcAb
TMB
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原 时，可用此法检测特异性抗体；如HBeAb， HBcAb；
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酶免疫测定(enzyme immunoassay, EIA)
酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)
▪ 原理：将抗原（抗体）固相化，与酶标记的相应抗 体（抗原）结合后，加入该酶作用的底物，底物被 酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质 的量直接相关，由此进行定性或定量分析。
Fc段
稀释液/稀： pH7.4 0.05M的PBS （磷酸盐缓冲液）
HRP-驴抗兔IgG(二抗)
洗液：PBST（PBS+0.1%吐温20）
显色液：OPD（邻苯二胺）
终止液/终：2M硫酸
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间接ELISA
操作步骤
▪ 包被：正常小鼠血清（IgG）包被，100μl/孔，4℃过夜
▪ 封闭：弃去包被液，加入5%脱脂奶粉封闭（ 200μl/孔）， 37℃,20min
空白对照无显色
加酶标抗体：1:5000稀释 的HRP标记的驴抗兔IgG抗 血清， 37 ℃ 15min
加底物液显色
A,B两排同样操作，每孔加１００ul!
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A,B排上样完全相同：复孔
A
B
123 4
5
6
78
9 10 11 12 无Ab,
仅稀释液
2-12号每孔１00uL稀释液，
１号孔加入200uL一抗，从１号孔吸取100uL加到２
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Байду номын сангаас
浓度方向进行 ▪ 终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准 ▪ 2M H2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢
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需要搞清楚的问题
1. 什么是免疫标记技术？为什么要进行标记?
三大免疫标记技术：放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免 疫技术。
2. ELISA的原理、定义及基本分类 3. 实验对照的设立及其意义 4. 了解ELISA在临床中的广泛应用
测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长
（OPD底物为490nm，TMB底物为450nm），以 空白孔调零后测各孔OD值。以高于阴性对照孔 OD值2倍为阳性。
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结果的判定
空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变浅
待检样品孔显色明显
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空白对照
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定量方法：标准曲线
待检样本
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注意事项
▪ 对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照） ▪ 倍比稀释时，要正确操作；加样时从低浓度向高
……
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ELISA在其他相关领域中的应用
食品安全
科研服务
环境卫生
……
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酶催化底物液显色
▪ DH2+ H2O2 E D+ 2H2O DH2为供氢体， H2O2为受氢体。
▪ DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色 的产物。
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酶 /E
辣根过氧化物酶 (HRP)
碱性磷酸酯酶 (AP) 葡萄糖氧化酶 (GOD) β-Ｄ－半乳糖苷 酶 (β-Gal)
2MH SO4终止反应 15
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→
洗涤：3次，
→1min/次
包被：1：5000稀释的正
封闭：5%脱脂奶粉， 加待检抗体：倍比稀释的兔
常小鼠血清，4℃过夜
37 ℃ 20min
抗鼠IgG抗血清，37 ℃ 15min
EE
底物液100ul
→洗涤：3次，
1min/次
→ 洗涤：3次，
1min/次
→ 终止液50ul 终止液终止显色
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间接ELISA
实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价 实验材料：包被抗原：小鼠血清
鼠IgG(抗原)
待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG 酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG
免疫
聚苯乙烯酶标板 水浴箱
移液器
枪头
兔抗小鼠IgG(一抗)
包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液 封闭液/ 封：5%脱脂奶粉(ALB)
号孔中，混匀，从２号孔吸取100uL加到３号孔中，
混匀，．．．．．１１号孔吸取１００uL，丢弃！
每孔终体积100uL
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ELISA在医学中的应用
临床疾病诊断中的应用
病原微生物及其抗体检测如:肝炎病 毒,SARS等
蛋白质测定:各种免疫球蛋白、补体、肿 瘤标记物
非肽类激素测定：T3、T4，性激素测定