高中生物 实验二 密度梯度离心法分离提纯叶绿体及叶绿体荧光观察

叶
绿 体
叶 脉
叶 肉 细 胞
菠菜叶横切图（10×40）
保卫细胞
叶绿体
菠菜表皮细胞
（匀浆后，示表皮细胞、保卫细胞、叶绿体。 10×40）
蔗糖梯度离心分离菠菜叶绿体（10×40）
菠菜叶肉细胞、表皮细胞（匀浆后10×40）
（叶绿体浓度过大）
荧光显微镜的光路及主要部件
光源 激发光挡片 激发光滤色镜 分色镜
实验二 密度梯度离心法分离提 纯叶绿体及叶绿体荧光观察
一、实验目的
学习密度梯度法，分离提纯菠菜叶 绿体及叶绿体的荧光显微镜观察。
二、实验原理
一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗 粒的大小、形状和密度，也同离心力以及 悬浮介质的粘度有关；
用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在 离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小 的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降 系数较大的细胞组分沉到离心管底部， 这样，可粗 器材：光学显微镜、台式高速冷冻离心机，
研钵、剪刀、托盘、玻皿等 3. 试剂： （1）匀浆介质（0.25 mol/L蔗糖、
0.05 mol/L Tris-HCI缓冲液，pH7.4） （2）50%蔗糖溶液，（3）15%蔗糖溶 液。
四、实验步骤
1. 洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去掉叶柄、 主脉后，称取2~3g，剪碎置研钵中。
2. 加入10ml匀浆介质于研钵中，研磨成糜状。 3. 用双层纱布过滤捣碎液到烧杯中。 4. 将滤液倒于离心管内，500rpm离心10min，
轻轻吸取上清液。
5. 先将50%蔗糖溶液0.4ml加入离心管，再取 15%蔗糖溶液0.4ml小心沿管壁缓缓注入， 不能搅动50%蔗糖液面，使两种溶液界面 可见，制成密度梯度。
6. 加入0.4ml上清液，严格平衡离心管后，用 水平转头8000r/min离心，20min。
7. 用滴管轻轻吸出界面处的溶液，滴于载玻 片上，盖上盖玻片后，显微镜下观察。另 取部分溶液在暗室内用荧光显微镜直接观 察。（角转取中间靠壁的叶绿体）
五、作业
分离的叶绿体是否纯净？试分析原因。 实验报告