定量PCR反应体系优化及实验实例

特异性的荧光探针法 －Taqman探针法
利用荧光标记的特异性探针和引物来识别模版，优点是特异性更 高，适用于序列专一扩增检测，不过增加了荧光探针的成本。
定量PCR实验基本流程
1. 2. 3. 4. 5. 准备模板(DNA或RNA，RNA反转录成cDNA) PCR反应(DNA/cDNA+引物探针+PCR mix) 样品编辑(样品名、样品类型) 设置参数(循环参数、反应体积、熔解曲线) 运行PCR，自动分析数据
2－4 mM
0.2-0.4uM 0.2-0.4uM 0.2uM 1－2U 补足总体积20ul
Taq酶
DDH2O
Tips：2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应 ： 液作为cDNA(1-100 ngRNA反转录所得cDNA) 模板时的添加量不要超过 PCR反应液总体积的10%。
引物二聚体的解决（续）
4.软件操作、 4.软件操作、程序设置 软件操作
用四步法可以去除引物二聚体，就是在PCR延伸之后加一 个介于二聚体Tm与目片段Tm之间的温度,在这个温度采集 信号即可，这样二聚体产生的荧光信号就检测不到
Cycle（40）Βιβλιοθήκη 94℃ 59℃ 72℃ 83℃
15s 20s 20s 采集信号
电泳条带
28S、18S条带应清晰 锐利，并且28S条带 的亮度在18S条带的 两倍或者两倍以上， 无DNA杂带 70℃条带和-20℃条 带无明显差异。
这项指标是关键性 指标
低温实验
如果内源性RNA酶 的污染，两者间的 条带差异是非常明 显的。
引物的设计原则
1. 上下游引物要保守 为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200bp 片段进行PCR扩增。 上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62℃之 间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。 确保引物中GC含量在30-80%。应避免引物中多个重复碱基的 出现，尤其是要避免4个或超过4个G碱基出现。引物的3’端最 好不为G或/和C。引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。 避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应 避免引物间配对形成引物二聚体。 跨外显子设计引物，用于区别或消除基因组DNA的扩增。
实例分析Case 实例分析Case by case
标准品稀释不规范：SYBR Green(R) I 2006-05-16 (1)wang.rex； SYBR Green(R) I 2006-06-11 (1)fu.rex 稀释样品的水污染：SYBR Green(R) I 2006-03-16 (2)fan.rex PCR管质量问题：Run 2006-07-06 FYD.rex；0607211FYD.rex 试剂盒的问题：2005120701香港，Dual Labeled 试剂盒
模板的制备
RNA样品 real time RT-qPCR 是检测样本中特定基因表达量的 有效方法，包含逆转录步骤和定量PCR步骤。组织 或细胞总RNA抽提，以mRNA为模板反转录得到 cDNA；以cDNA为模板进行定量PCR. DNA样品 组织或细胞的DNA抽提
总RNA的质量评价方法
1.检测RNA溶液的吸光度
跨内含子设计引物（一）
跨内含子设计引物（二）
PCR效率对实验结果影响
扩增效率低（扩增效率不一致）
1. 扩增效率低，可适当提高体系中Mg2+的浓度，以50nM为梯度 2. 降低Sybr-Green的浓度，一般在0.2-1×之间调节 3. 如果同时扩增两个基因，而扩增效率不一致，请首先明确以下问 题： 两组引物的退火温度是否一致或接近 两条扩增片段长度和GC含量是否一致或接近 如果上述两点有一点不能满足就会导致扩增效率不一致，需 从新设计引物 。特别是在做相对定量分析时，应尽量将两条目 的片段的扩增长度和引物的退火温度设计接近
280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景 （溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只 看OD260/OD280（Ratio，R）。R在1.8－2.0时，我们认为RNA中蛋 白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用 Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是 〈2.2的）。R〈1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较 明显，当R〉2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。
如果以2℃为温度梯度，提高退火温度，寻找最佳的退火温度
引物二聚体的解决（续）
3. 其它因素
Mg2+的浓度，以50nM为梯度进行调节； 引物浓度过高也会引起二聚体增多，一般使用浓度在50-500nM之 间，可降低引物浓度； Sybr-Green的浓度，Sybr-Green浓度越高对扩增的抑制越明显，同 样会表现在二聚体较多 样品浓度的问题，如果引物设计不是十分完美，则在样品浓度较低 时会表现出二聚体 ，如果必需操作低浓度的样品，则要从退火温 度和引物设计上再想解决方法
基因组DNA的污染
1. 跨内含子的引物
将引物设在两个外显子的结合部，以穿过mRNA中的连接区,这 样DNA就不能作为模板参与扩增反应 在内含子的前面设计5‘引物，在内含子的后面设计3’引物，以基 因组DNA 和cDNA 为模板的PCR产物大小不一样,达到去除污染 的目的
2. 将RNA 提取物用RNase-free 的Dnase I 处理， Dnase I灭活时RNA可能降解
实例分析Case 实例分析Case by case（续） case（
荧光阈值的调节：051107-ct gz 二聚体的问题：SG-Qiagen-CD民院-2005-11-20，SG-QiagenCD民院- 2005-11-22 不同试剂盒在退火温度选择上的差异：SG-TaKaRa-CD民院2005-11-20，SG-Qiagen-CD民院-2005-11-20 循环数对扩增结果的影响：SYBR Green(R) I 2005-12-21 (2)
2.RNA的电泳图谱
电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值， 或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清 晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带 的两倍以上，我们认为RNA的质量是好。
总RNA的质量评价方法（续）
3.保温试验
引物二聚体的解决（一）
1.引物的设计问题 1.引物的设计问题
如何判断问题产生于引物的设计？ 常规PCR实验中能否通过调节退火温度消除引物二聚体 常规PCR是否同样存在大量引物二聚体 如果常规PCR实验无法消除二聚体，则说明二聚体是由引物设计造 成的，需从新设计引物
2.退火温度的问题 2.退火温度的问题
方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的 RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul 的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温 1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。 时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者 的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条 带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污 染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解， 则说明RNA溶液中有RNA酶污染。
2. 3.
4. 5.
探针的设计原则
1. 保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。 2. Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间， 确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10℃。 3. 确保探针中GC含量在30-80%。 4. 避免探针中多个重复碱基的出现，尤其是要避免4个或超过4个的G 碱基 5. 探针的5’端不能为G，因为G碱基可以淬灭FAM基团所发出的荧光信 号，从而导致假阴性的出现。 6. Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条 链上的上游引物。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有 一个碱基。 7. 避免探针与引物之间形成二级结构。 8. 对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的 中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。
谢 谢!
RNA质量判定标准
项目
Ratio
合格
2.0≥ X≥1.8
不合格
X＜1.8或X＞2.2 28S、18S条带不清 晰锐利，有向前拖 尾。28S条带的亮 度与18S条带亮度 相当或者更低，有 DNA杂带 70℃条带和-20℃ 条带有明显差异。
备注
一般是1.8－2，但 不能高于2.2，如 果高于2.2可能是 完全水解了。
SYBR I染料法实验优化方案 I染料法实验优化方案
Components DNA PCR buffer dNTPs MgCl2 Forward Primer Reverse Primer SYBR Green I Taq酶 DDH2O Final Conc. 4-40 ng （2－5ul） 1× 各0.2mM 2－5 mM 0.2-0.4uM 0.2-0.4uM 0.2－1× 1－2U 补足总体积20ul
Tips：提高镁离子浓度可以降低SYBR Green I对PCR反应的抑制作用。我们 ： 建议在用SYBR Green I进行荧光PCR反应时，镁离子浓度要比无SYBR Green I 的普通 PCR 反应要高出 0.5 到3mM。
Taqman探针法实验优化方案 Taqman探针法实验优化方案
Components DNA PCR buffer dNTPs MgCl2 Forward Primer Reverse Primer Taqman Final Conc. 4-40 ng （2－5ul） 1× 各0.2mM
定量PCR反应体系优化及实验实例分析 定量PCR反应体系优化及实验实例分析 PCR
基因有限公司市场部
黄国庆
荧光定量PCR的定量方法 荧光定量PCR的定量方法
通用型的荧光染料检测法 －SYBR Green I法
利用荧光染料（如SYBR Green I）与双链DNA分子结合发光的特 性来指示扩增产物的增加，优点是：无需另外设计荧光探针，无 需特别优化条件，简便易行，成本较低，能适用于任何一款定量 PCR仪，缺点是专一性不如探针法 。