分子生物学》第七章+RNA加工和核糖核蛋白

第七章RNA加工和核糖核蛋白
不论原核或真核生物的rRNAs都是以为复杂的初级转录本形式被合成的，然后再加工成为成熟的RNA分子。

然而绝数原核生物转录和翻译是同时进行的，随着mRNA开始的在DNA上合成，核蛋白体即附着在mRNA上并以其为模板进行蛋白质的合成，因此原核细胞的mRNA并无特殊的转录后加工过程，相反，真核生物转录和翻译在时间和空间上是分开的，刚转录出来的mRNA是分子很大的前体，即核内不均一RNA。

hnRNA分子中大约只有10%的部分转变成成熟的mRNA，其余部分将在转录后的加工过程中被降解掉。

第一节rRNA加工和核糖体
在细胞核内对基因产物(mRNA前体)进行各种修饰、剪接和编辑，使编码蛋白质的外显子部分连接成为一个连续的开放读框(open reading frame，ORF)的过程称为转录后加工．
一、RNA的加工类型
pre-RNA经过加帽(capping)、加尾(tailing)、剪接、剪切(splicing)、修饰(methylation)、编辑(editing )成为mature RNA的过程，叫做RNA加工。

核苷酸的切除（减少部分片段）、添加核苷酸（增加部分片段）、修饰、编辑（以gRNA为模板）
生物学意义;
（1）interrupted gene(interrupted RNA) →move introns (stop codon) →as template(protein translation)
（2）prevent pre-RNA from digested by RNase
二、原核生物rRNA加工
ΦProk.的mRNA半衰期只有几分钟（基因表达调控的一种手段），lacZ mRNA终止合成后9min就几乎全部消失。

mRNA很容易从5’-P被降解，但有些mRNA 5’-P 末端被修饰而得到保护，所以不易被降解，例如真核生物中的血红蛋白mRNA （hemoglobin mRNA）和蚕的蚕丝纤维蛋白mRNA（silk fibroin mRNA）。

ΦrRNA、tRNA比较稳定，半衰期几小时。

rRNA和tRNA的转录都是从启动子起始到终止子结束来完成的，从这一点来讲，rRNA和tRNA分子的合成过程与mRNA没有什么不同，但rRNA和tRNA有以下三个特性与mRNA不同：
成熟分子和转录产物的差别：
•所有RNA初级转录产物均是5’-单磷酸，而成熟rRNA和tRNA分子均是5’-单磷酸
•rRNA和tRNA比其初级转录产物小很多。

•所有tRNA除了含有A、G、C、U外，还含有稀有碱基，这些稀有碱基在初级转录产物中是没有的。

1、基因排列方式
★三种rRNA 基因（5S、16S、23S）与tRNA的基因形成操纵元（rrn）（E.coli 七个）
★每个rrn中tRNA 基因无固定模式
（种类、数量、位置）
★三个rRNA基因的相对位置有一定规律
…16S rDNA……间隔tDNA…….23SrDNA…….5S rDNA……收尾tDNA…
原核生物rRNA转录后加工，包括以下几方面：
①rRNA前体被大肠杆菌RNaseⅢ,RNaseE等剪切成一定链长的rRNA分子；
②rRNA在修饰酶催化下进行碱基修饰；
③rRNA与蛋白质结合形成核糖体的大、小亚基
三、真核rRNA的加工
真核生物rRNA前体比原核生物大，哺乳动物的初级转录产物为45s，低等真核生物的rRNA前体为38s，真核生物5sRNA前体独立于其他三种rRNA的基因转录
真核生物rRNA前体
中含有插入顺序，rRNA前
体要形成成熟的rRNA，需
要经过拼接反应。

例如，
四膜虫的rRNA前体的拼
接是一种无酶催化的自动
拼接过程。

四膜虫基因组
内，26srRNA编码的区域
内有413bp的插入顺序。

该插放序列可以不消耗能
量从rRNA前体中被除掉。

用SDS煮沸和用蛋白酶处
理等破坏酶活性办法，都
不能破坏拼接活性，但反应中Mg2+和鸟嘌呤核苷酸是必在的。

用32P-GTP进行追踪实验表明，起始过程是GTP在插入顺序5’端发生亲核反应，同时GMP与5’端切点的切除
段形成磷酸二酯键并使原RNA断开。

第二步是5’切点的外元3’-OH与3’切点的外元5’-P 共价连接，获得成熟的rRNA，被切除部分最后环化，形成一个环状结构，同时从5’端去掉一个15核苷酸碎片。

剩余部分连接成399核苷酸的环状产物，再经过几步，最后切下一个19个核苷酸的线性内含子序列即L-19，它具有催化活性，上面的剪接作用，是由内含子本身的催化性质决定的。

四膜虫rRNA前体的自我剪接
这种rRNA的自身剪接反应给人们一个提示：即RNA分子也有酶的催化活性。

这向酶的化学本质是蛋白质这一传统概念提出了挑战。

这种有酶催化活性的RNA分子命名为Ribozyme。

T.Cech和S.Altman各自分别发现RNA具有催化作用，他们的发现对于了解生命进行过程有重要意义。

很可能在原始生命中，RNA所催化的断裂一连接反应是最早出现的催化过程。

为此，他们共同获得了1989年Nobel化学奖。

从大多数Ribozyme的结构中发现一些特征，例如：锤头状结构的RNA分子有13个保守的核苷酸序列，如果它们中的碱基改变会使这种催化活性失去作用。

根据这种特点，科学家们在体外设计并人工合成这种RNA分子，用于抗肿瘤及抗病毒的实验中。

锤头结构模式
四、核糖体的组成
核蛋白体RNA(ribosomal RNA)是细胞内含量最多的RNA，约占RNA总量的80%以上，是蛋白质合成机器核蛋白体(核糖体)(ribosome)的组成成分。

核糖体蛋白(ribosmal protein,rp)有数十种，大多是分子量不大的多肽类，分布在核蛋白体大亚基的蛋白称为rpl，在小亚基的称rps。

原核生物和真核生物的核蛋白体均由易于解聚的大、小亚基组成。

对大肠杆菌核蛋白体的研究发现其质量中三分之二是rRNA，三分之一是蛋白质。

rRNA分为5S、16S、23S三种。

S是大分子物质在超速离心沉降中的一个物理学单位，可反映分子量的大小。

小亚基由16SrRNA和21种rps构成，大亚基由5S、23S rRNA和31种rpl构成。

真核生物核蛋白体小亚基含18S rRNA和30多种rps，大亚基含28S、5.8S、5S三种rRNA，近50种rpl。

各种生物核蛋白体小亚基中的rRNA具有相似的二级结构。

无论在试管内或细胞内，大、小亚基都易于组成核蛋白体整体或分离成两部分。

几十种多肽是如何互相联结，又怎样与几种rRNA相连的呢?用提纯了的亚基所有的肽和rRNA在试管内混合，发现不需加入酶或ATP就可以自动组装成为有活性的亚基，但rRNA之间却不能互相替代，也即说这种自我组装过程是以rRNA为主导的。

虽然所有多肽在组装中也是缺一不可的，但不同的肽可能有酶的作用或起别构效应。

现已证明某些核糖体蛋白具有酶的功能，但基中大多数还未弄清其具体作用。

第二节tRNA加工
一、tRNA基因
★转录单元大多是多基因的（同一个tRNA基因、不同tRNA基因）
★有两种类型的tRNA 基因：
Ⅰ型具有3‟端的CCA序列
Ⅱ型没有3‟端的CCA序列
★Ⅰ型需在酶的作用下切除CCA下游一段序列
（Prok. 的tRNA多为Ⅰ型）
Ⅱ型需要在酶的作用下添加CCA序列（少数Phage 、Euk.）
二、参与tRNA后加工的酶
（1）RNAaseP：内切核酸酶，核蛋白使tRNA产生成熟的5‟端，识别tRNA的空间构象
（2）RNAaseD：外切核酸酶，使Ⅰ型tRNA暴露出CCA端（CCA会立刻氨酰化而得到保护）
a、RNAaseP 存在时RNAaseD可达最大活性
b、RNAaseQ、RNAaseY、RNAaseP3与此酶功能相同
（3）tRNA核苷酸转移酶（tRNA nucleotidyl transferase）
以ATP和CTP为前体，催化tRNA（Ⅱ型）的3‟端生成CCA
a、E.coli中该酶基因突变后，会影响菌株生长（CCA末端常丢失）
b、识别tRNA的空间结构，无种属特异性
（4）RNAase Ⅲ：与RNAaseO、RNAaseP2的功能相似，负责切开间隔序列
三、原核生物tRNA加工
原核生物tRNA转录单位一般为多基因转录。

tRNA的加工分成3个阶段：
（1）“掐头”，形成5…末端
（2）“去尾”，形成3…-OH
缺-CCA的tRNA要用tRNA核酸转移酶加-CCA
（3）修饰：形成稀有碱基，如二氢尿嘧啶，假尿苷（ψ）等
有一个tRNA Tyr1的转录单元的原始转录物的修饰过程
四、真核生物tRNA加工
真核tRNA的基因和原核不同：(1)真核的前体分子tRNA是单顺反子，但成簇排列，基因间有间隔区。

如在爪蟾中每个基因组中各个tRNA基因超过200拷贝，是一种重复序列；(2)真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多得多，如酵母约有400个tRNA基因；(3)5’端全有单磷酸核苷酸，表明已被加工过；(4)tRNA的前体分子中含有内含子，其特点是①位置相同，都在反密码子环的下游；②不同tRNA的内含子长度和序列各异；
③外显子和内含子交界处无保守序列，不符合Chambon法则，故其内含子的剪切是依靠RNase异体催化。

进行剪切；④内含子和反密码子配对形成茎环，改变了反密码子臂的结构，保护了反密码子，使其免受某些酶的降解。

真核tRNA的加工和原核相似，
但也有区别：(1)真核tRNA前体中
无二聚体和多聚体；(2)增加了剪接
内含子的过程；(3)都要加CCA。

真核tRNA的加工多以酵母为
材料进行研究。

同样通过诱变可以
获得tRNA加工的温度敏突变型，
来获得未加工的tRNA前体，然后
在体外加入野生型酵母细胞的抽
提物和控制ATP来观察，结果发现
酵母tRNA的加工主要分成二步：
（1）切除内含子；
（2）连接外显子。

内含子的切除：在未处理前先
进行凝胶电泳，结果只显示一条
带，且跑得较慢，显然此是tRNA
的前体分子；当加入核酸内切酶后
无需加入ATP，反应后再走电泳，
结果出现二条带，一条是剪切后游
离出的内含子，另一条是互补的外显子，称为tRNA的半分子（tRNA half-molecules）。

切除tRNA内含子的核酸酶很特殊，不是形成3′-OH和5′-P，而是产生了2′-3′环磷酸和5′-OH，因此不能直接连接。

此步反应无须ATP。

必须通过环磷酸二酯酶（phosphodiesterase）将2′-3′环磷酸打开，形成3′-OH，2′P。

5′端须在激酶作用下将5′-OH磷酸化，再通过连接酶将两个半分子连接起来。

5’磷酸化需要ATP的参加。

哺乳动物的RNA连接酶可将2′-3′环磷酸与5′-OH直接连接起来，无需环磷酸二酯酶和激酶的介入。

真核tRNA内含子的切除和其它内含子的切除是不同的(1)即没有交界序列，也没有内部引导序列；(2)是依赖于蛋白质性的RNase，而不是核糖拟酶或snRNP；(3)反应的本质不是转酯反应。

真核tRNA内含子的精确剪切以什么为信号呢？内含子的序列和大小都不重要。

内含子的突变并不影响剪切。

其剪切原则上依赖于对tRNA共同的二级结构的识别（Johnson 等（1980），而不是内含子的保守序列。

分子不同部分的区域对于剪切是重要的，包括受体臂，D环，TψC环和反密码子环。

酵母tRNA Leu基因的内含子插入一大段E.coli的乳糖操纵基因中的21bp后，在爪蟾胚泡（germinal vesicle）抽提液中离体转录，转录产物中即有tRNA，也含有21bp外源序列的前体tRNA分子。

此表明内含子结构改变不影响转录和其转录后的正确剪切（Johnson 等1980）。

前体tRNA Lle，tRNA Len,tRNA Tye及tRNA Phe等内含子的上游切点都是在反密码子3’端之后的一个核苷酸上,另一切点常在不配对的泡上。

这些tRNA的反密码子和内含子的序列都不同，可见剪切的核酸酶不识别一级结构，而是依赖于tRNA的二级结构（Peeble 等1983）。

切点的碱基或序列是否是剪切信号呢？现在来看Colby等（1981）的实验。

tRNA Tyr 的反密码子为5′GUA 3′，当其突变为UUA时使可与终止密码子配对，而抑制无义突变。

当突变了的反密码子3′的A再突变为G后，它的抑制效率大大下降，而细胞中此种tRNA的前体大大增加（7倍），说明很多前体不能剪切，但剪切的位点仍是正确的，实验结果表明切点的碱基只影响剪切效率，不影响酶的识别。

现在发现内含子环中的一个碱基与茎上的一个碱基进行配对这对剪切来说是重要的。

影响此配对的其它位点的突变也会影响剪接（如产生另一种配对）。

此标准有利于控制tRNA前体的精确剪接，这种情况类似于tRNA对氨基酸识别的副密码子。

第三节mRNA加工
Pre-RNA processing
不论原核或真核生物的mRNAs都是以更为复杂的初级转录本形式被合成的，然后再加工成为成熟的RNA分子。

然而绝大多数原核生物转录和翻译是同时进行的，随着mRNA开始的DNA上合成，核蛋白体即附着在mRNA上并以其为模板进行蛋白质的合成，因此原核细胞的mRNA并无特殊的转录后加工过程，相反，真核生物转录和翻译在时间和空间上是分天的，刚转录出来的mRNA是分子很大的前体，即核内不均一RNA。

hnRNA分子中大约只有10%的部分转变成成熟的mRNA，其余部分将在转录后的加工过程中被降解掉。

一、mRNA加工概述
原核生物中转录生成的mRNA为多顺反子，即几个结构基因，利用共同的启动子和共同终止信号经转录生成一条mRNA，所以此mRNA分子编码几种不同的蛋白质。

例如乳糖操纵子上的Z、Y及A基因，转录生成的mRNA可翻译生成三种酶，即半乳糖苷酶，透过酶和乙酰基转移酶。

原核生物中没有核模，所以转录与翻译是连续进行的，往往转录还未完成，翻译已经开始了，因此原核生物中转录生成的mRNA没有特殊的转录后加工修饰过程。

真核生物转录生成的mRNA为单顺反子，即一个mRNA分子只为一种蛋白质分子编码。

真核生物mRNA的加工修饰，主要包括对5’端和3’端的修饰以及对中间部分进行剪接。

1、核不均一RNA（hnRNA）
RNApol I →18s, 5.8s, 28s rRNA (nucleolus)
RNApol II →mRNA, U1, U2, U4, U5-SnRNA(nucleoplasm)
RNApol III →tRNA, 5s rRNA, U6-SnRNA(nucleolus & nucleoplasm)
pre-mRNA : X ≈7 kb ±; Max.≈20 kb; 4-10×mature RNA; X≈8 Introns
编码蛋白质的结构基因是在核浆中被转录的。

但是核浆中的RNA却并不像mRNA。

核浆RNA要大得多，很不稳定，并且其顺序的复杂性也要大得多。

由于它的大小很不一致，故称核内不均一RNA(hnRNA)。

已经证明mRNA确实是从hnRNA生成的。

细胞浆内的mRNA 平均只有1800-2000个碱基。

而哺乳动物的hnRNA平均有8000-10000个碱基，其范围很广泛，从2000-14000碱基均有，所以一般要比mRNA大4-5倍。

如果以5倍计算，由于正常哺乳动物细胞中测得mRNA仅占hnRNA量的5%，则相当于有25%的hnRNA可转变为mRNA。

这意味着有3/4的hnRNA即在核内降解。

hnRNA被切除内含子后即成为mRNA，并进入细胞浆内。

但在切除内含子之前，hnRNA可先加帽和加poly(A)尾链。

有一种称为poly(A)聚合酶的酶可以用ATP为底物，以加上poly(A)尾链，这是hnRNA转变为成熟的mRNA所必须的。

在哺乳动物细胞中，仅约30%的hnRNA被多聚腺苷酸化，而mRNA 中却约70%是有poly(A)尾链的。

可能多聚腺苷酸化是hnRNA分子要被加工的信号。

hnRNA 的尾端要被切去一段，然后才加上poly(A)。

因为RNA聚合酶在转录时即已通过了相当于加上poly(A)的位点，故hnRNA尾端的多余部分要由内切核酸酶切去，才能加上
poly(A)。

2、核不均一RNP（hnRNP）
由RNA聚合酶II合成的hnRNA主要是前mRNA。

hnRNA与蛋白质结合形成核不均一核糖核蛋白颗粒(hnRNP), mRNA前体的加工在hnRNP上进行。

hnRNP所涉及蛋白质被分为A~U类。

三种非常丰富的hnRNP蛋白
是A、B、C，每一种均有两种构型。

从核中提纯这
些物质，可得到一种约30~40S的同源性相当高的、
被称为hnRNP的颗粒。

这些颗粒直径约为20nm，
每个颗粒包含一个600~700nt的RNA分子，并与三
种不同四聚体的三个拷贝形成复合体。

这些四聚体
是(A1)3 B2、(A2)3 B1、(C1)3 C2。

HnRNP被认为有助于：
保持hnRNA的单链状态
辅助RNA加工反应
3、snRNP
真核生物细胞核和细胞质中含有大量的小分子RNA。

在高等生物中，小分子RNA 大小大约100~300NT，在酵母中可长达1000Nt左右，它们在细胞中相当丰富达105~106分子，种类也很多，但它们的浓度太低而不能直接检测，但它们与mRNA加工过程有关。

核内的小分子RNA叫做snRNA(small nuclear RNA)，细胞质中的小分子RNA叫scRNA（small cytoplasmic RNA），在自然状态下，它们与特定蛋白质形成snRNP和scRNP（有时称为snurp和scyrp）。

snRNAs、cRNA富含尿嘧啶，因此被命名为U1、U2等。

含量最丰富的是那些参与前mRNA剪切的U1、U2、U4、U5和U6。

一个snRNP通常只含有单一的snRNA 分子和8个碱性蛋白质及多种snRNP特定蛋白质构成。

在剪接装置中有几种snRNPs 和大量的附加蛋白，称为剪接因子。

二、5’端加帽
1．帽子的种类
成熟的真核生物mRNA，其结构的5’端都有一个m7G-pppNmpN结构，该结构被称为甲基鸟苷的帽
子。

新生RNA起
始合成大约
25~30个碱基
后，7-甲基鸟嘌呤就被加到5’末端。

鸟苷通过5’-5’焦磷酸键与初级转录物的5’端相连。

当鸟苷上第7位碳原子被甲基化形成m7G-pppNpN时，此时形成的帽子被称为“帽0”，在帽子0中，核糖不被甲基化；如果除m7G-pppNpN外，这个核糖的第“2”号碳上也甲基化，形成m7G-pppNmpN，称为“帽1”，如果5’末端N1和N2中的两个核糖均甲基化，成为m7G-pppNmpNm2，称为“帽2”。

从真核生物帽子结构形成的复杂可以看出，生物进化程度越高，其帽子结构越复杂。

其中，单细胞真核生物只有 Cap—0；Cap—1 是其余真核生物的主要帽子形式；Cap—2 存在于某些真核生物中。

2、帽子结构的生成
☆甲基供体都为S—腺苷甲硫氨酸（SAM）
☆RNA鸟苷酸转移酶-----戴帽酶（capping enzyme）
RNA加工过程中，这个步骤的起始由二聚体加帽酶催化，该酶与RNA聚合酶II的CTD的磷酸化有关（加帽酶专门针对RNA聚合酶II转录产生的产物进行催化反应）。

加帽酶的一个亚基催化RNA聚合酶II合成的新生RNA的5’末端除去γ磷，另一亚基将来自于GTP的GMP转移到新生RNA的5'-二磷酸上，产生鸟嘌呤5'-5'-三磷酸结构，最后又单独的酶将甲基转移到鸟嘌呤的N-7位和新生RNA的5’端核糖的2’-O位上。

3、真核生物mRNA 5’端帽子结构的重要性（帽子结构的功能）：
（1）对翻译起识别作用------为核糖体识别RNA提供信号
核糖体与mRNA的5' 末端结合，然后沿着mRNA扫描直至AUG。

在此过程中，末端的5' 帽子结构对翻译起始极为重要。

越来越多的实验表明，其重要性依赖于起始因子eIF4F复合物。

eIF4F是一种依赖RNA的ATP酶，促进mRNA与预起始复合物结合。

它有两个核心亚基（core subunit）：eIF-4E和eIF-4G。

eIF-4E为帽子结合蛋白（cap binding
protein），结合于mRNA的5' 末端帽子结构。

而eIF-4G，它通过C-末端与另一延伸因子eIF3（协助形成预起始复合物）与核糖体相连，而N-末端则通过eIF-4E与mRNA 的5' 末端相连。

由此假设，eIF3和eIF-4E在eIF-4G的连接下，使核糖体富集于mRNA 的5' 端的帽子结构上
Cap—0 的全部都是识别的重要信号
Cap—1,2 的甲基化能增进识别
（2）增加mRNA 的稳定性，使5’端免遭外切核酸酶的攻击
（3）与某些RNA病毒的正链合成有关（Cap—1、Cap—2 ）
（4）对mRNA前体的剪接是必需的
除帽子结构外的Euk.mRNA内部甲基化－－－m6A形式
三、3’端加尾
1、概念
在动物细胞内，除组蛋白以外，所有mRNA都有3’端的多聚尾巴（A)，多聚（A)尾巴大约为200bp。

多聚（A)尾巴不是由DNA编码的，而是转录后在核内加上去的。

受polyA聚合酶催化，该酶能识别mRNA 的游离3’-OH端，并加上约200个A残基。

加尾信号：
①AAUAAA：近年来已知，在大多数真核基因的3’一端有一个AATAA序列，这
个序列是mRNA 3’-端加polyA尾的信号。

靠核酸酶在此信号下游10-15碱基外切断磷酸二酯键，在polyA聚合酶催化下，在3’-OH上逐一引入100-200个A
碱基。

②GU丰富区或U丰富区，在切割位点周围的50个核苷酸之内。

在动物细胞中，
切割位点下游的第二个信号对于多数前体mRNA的切割和poly(A)是必需的。

2、过程；
CPSF（cleavage and polydenylation specificity factor, 四条链组成，360kDa）首先与第一个poly(A)信号上游AU丰富区形成不稳定复合物，
然后，三个外加蛋白与CPSF-RNA复合物结合。

（1个切割刺激因子（cleavage stimulatory factor, CStF）：200kDa，异源三聚体（CStF和poly(A)信号下游GU 丰富区或U丰富区的相互作用能稳定的多蛋白复合物）；一个称为切割因子
（cleavage factor I,CFI）：150kU，异源三聚体和另外一个切割因子（CFII）。

最后，poly(A)聚合酶（poly(A) polymerase PAP）结合到该复合物上，并切割产生自由3’末端后迅速形成poly(A)。

加poly(A)紧接在poly(A)位点之后，加poly(A)分两个时期：
第一时期是慢速加上12个A，
第二时期是快速加上200~250个以上A。

需要含RNA结合蛋白结构域的poly(A)结合蛋白的多拷贝结合，该蛋白命名为PABII以区别结合在细胞质mRNA poly(A)尾巴的poly(A)结合蛋白。

PABII与PAP起始加上的短poly(A)尾结合，可以进一步促进PAP 催化的poly(A)化反应。

3、poly(A) 的功能
（1）可能与核质转运有关（2）与mRNA的寿命有关
（3）与翻译调控有关
a、缺失可抑制体外翻译的起始
b、胚胎发育中，poly(A) 对其mRNA的翻译有影响（非poly(A) 化的为储藏形式）
c、对含poly(A) 的mRNA 失去poly(A) 可减弱其翻译
（4）poly(A) 在分子生物学实验中有很大应用价值
a、也可将oligo (dT) 与载体相连，从总体RNA中分离纯化mRNA
b、用寡聚dT（oligo (dT)）为引物，反转录合成cDNA
poly(A)的存在有重要的应用价值。

mRNA的poly(A)区域可以与Oligo(U)或
Oligo(dT)配对；此反应可用于分离poly(A)+ mRNA。

最方便的技术是在一个固体支持物上固定化Oligo(U 或dT)。

当总RNA 通过柱子时，只有poly(A)+RNA 被保留在柱子上。

它可通过用能破坏结合的溶液处理来释放RNA 分子。

这个过程的唯一缺点在于它分离所有带有poly(A)的RNA 分子。

如果用整个细胞的RNA，那么核质与胞质的poly(A)+ RNA 都将被分离出来。

如果制备的是多聚核糖体(一个通常的操作)，多数被分离的poly(A)+RNA 将是有活性的mRNA。

然而，除了多聚核糖体中的mRNA，胞质内的核糖核蛋白颗粒也带有poly(A)+mRNA，但后者不被翻译。

这些RNA可能被保存留到其余时间使用。

因此分离总poly(A)+RNA并不等同于分离活性mRNA 群。

对纯化的mRNA的“克隆”方法包括将mRNA复制成其互补DNA (Complementary DNA，cDNA)的操作步骤。

cDNA能作为模板用于合成与初始mRNA 序列相一致的DNA链。

这些反应的产物仅是与mRNA 序列相对应的双链DNA，此DNA 能被大量复制扩增。

被克隆的DNA的存在使通过杂交技术分离mRNA 成为可能。

通过此方法，那些在胞内只存在很少拷贝的mRNA 能够被分离。

事实上，只有以相对较大数量存在的mRNA 才能不用克隆方法直接分离。

几乎所有的细胞mRNA 都拥有poly(A)，明显的例外是编码组蛋白的mRNA 不具有poly(A)。

此类mRNA 组成了所有poly(A)—mRNA 组分的决大部分。

组蛋白mRNA 缺少poly(A)的意义尚不清楚，在功能上并不存在什么因素使poly(A)必需存在。

四、mRNA前体（hnRNA）的拼接
（一）概述
1、概念
原核生物的结构基因是连续编码序列，而真核生物基因往往是断裂基因，即编码一个蛋白质分子的核苷酸序列被多个插入片断所隔开，一个真核生物结构基因中内含子的数量，往往与这个基因的大小有关，例如胰岛素是一个很小的蛋白质，它的结构基因只有两个内含子，而有些很大的蛋白质，它的结构基因中可以有几十个内含子。

经过复杂的过程后，切去内元，将有编码意义的核苷酸片段（Extron外元也叫外显子）连接起来。

真核生物的结构的基因中具有可表达活性的外显子，也含有无表达活性的内含子，但内含子序列是无意义的，越来越多的实验证明有许多基因中的内含子参与基因表达调控，在转录时，外显子及内含子均转录到hnRNA中。

在细胞核中hnRNA进行剪接作用，首先在核酸内切酶作用下剪切掉内含子；然后在连接酶作用下，将外显子各部分连接起来，而变为成熟的mRNA，这就是剪接作用，也有少数基因的hnRNA不需进行剪接作用，例如α-干扰素基因。

mRNA加帽和加poly(A)之后，在核内发生拼接反应。

2、内元的分类
1982 Davies等人发现内含子含有：
中部核心结构（central core structure）：在有些内元中，含有4个重复的保守序列，长度为10 ~ 20bp，4个保守序列构成一种二级结构，在拼接中起重要作用。

由于并非所有的内元都有中部核心结构，所以有了内元的分类
Ⅰ类内元（group Ⅰ）：含有中部核心结构的（细胞器基因，核基因）
Ⅱ类内元（group Ⅱ）：不含有中部核心结构（细胞器线粒体基因，核基因）
Ⅲ类内元（group Ⅲ）：具有GU－AG 特征的边界序列（核基因mRNA前体）IV类内含子（group IV）：tRNA基因及其初级转录物中的内含子，剪切过程需酶及ATP。

均位于tRNA 的反密码环上
3、剪接方式
⑴自我剪接内含子：能够自发地进行剪接，又分为Ⅰ型内含子和Ⅱ型内含子两个亚类。

⑵由蛋白酶参与剪接的内含子：主要在tRNA前体中发现。

⑶由snRNP参与剪接的内含子：存在于绝大多数真核细胞的蛋白质基因中（Ⅲ型内含子）。

（二）第Ⅰ类内元的拼接
1、结构特点：
（1）5’拼接点和3’拼接点-------U↓… …G ↓
（2）内含子中具有中部核心结构
（Central core strucature）
所有的I类内含子中都具有二级结
构，右图表示四膜虫内含子中二级结构
模型，共九个配对区（P1-P9），其中
有2个配对区（P4和P7）是1类内含
子中共有的保守序列，P4由P和Q序
列形成，长10nt，有6-7碱基是可以配对的。

P7是由R和S序列构成的，长12nt，但只有5个碱基可配对。

其它的配对区在不同的内含子中是不同的，突变分析表明，P3，P4，P6，P7是核心结构，也就是可以执行催化的最小区域。

Davies（1982年）第一个提出了内部引导序列（internal guide seguence，IGS），它由六个nt组成，GGAGGG（四膜虫）。

有的配对反应是直接涉及到内含子的剪切，外显子连接的酶促反应。

P1含有左边外显子的3′端，内含子中可与外显子配对的序列称为内部引导序列（internal guide seguence,IGS）。

最初人们认为IGS的作用是通过和两个外显子近侧区域配对，使外显子并在一起，现在认为其作用是决定剪接的专一性。

而且使切点的U处于易于受到攻击的暴露点。

有的序列很短，在P7和P9之间配对，要在内含子3′端G激活前立即配对。

碱基的配对对于产生核心结构是很必要的，顺式作用位点的突变就会阻止1类内含子的剪接。

各种突变的线粒体内含子在体内都不能被切除，而四膜虫的内含子插入到细菌基因中，再转化到细菌中，它仍可以剪切。