蛋白质免疫印迹实验WesternBlot新

三 操作步骤
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2024/2/12
转 有 样 品 的 硝酸纤维素薄膜用含有 5% 脱脂牛奶的 PBS缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔 抗GST第一抗体，平缓摇动，室温保温1小时。然后 用PBS缓冲液将硝酸纤维素薄膜漂洗4次，每次 30分
钟。将辣根过氧分物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白第二 抗 体用封闭液稀释50倍后，加入吐温20至终浓度为 0.05%，然后与上述漂洗的硝酸纤维素薄膜进行反应
2024Βιβλιοθήκη Baidu2/12
一 实验原理
• 电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物 上是通过电转移仪器完成的。它是将固 体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二 者结合在一起，然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治 ”结构，放入电转移仪器上，加入电泳 缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝 胶上转移到固体支持物上。
2024/2/12
一 实验原理
其定量关系符合以下公式： • Ve=Vo+KV1 • Ve：某一溶质的洗脱体积 • Vo：层析柱的外水体积 • Vi：层析柱的内水体积 • K：某一溶质的分配系数
2024/2/12
二试剂和器材
1．试剂
电转移缓冲液 pH8.3 • 39mM甘氨酸 • 4.8mM Tris碱 • 0.037% SDS • 20% 甲醇 • 混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲
二试剂和器材
2．器材 • 电转移仪器 • 恒温摇床 • 硝酸纤维素薄膜 • Whatman 3MM滤纸 • 电泳仪 裁纸刀 • φ25cm培养皿
玻璃棒
2024/2/12
三 操作步骤
• 1蛋白质电转移 • 戴上手套，取下SDS-PAGE凝胶，小心剥离凝胶。裁剪与凝胶同样大的
硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角 剪去一角作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面，使水从 膜的下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液 中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，在 滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小 心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶 舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿 的滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最后加上石墨电极板，接通电源 进行电转移，电流的大小由凝胶的大小决定，为0.65mA/平方厘米。电 转移2小时后，停止通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰 染色，以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干 滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。
四 思考题
• 1. 为什么裁剪的滤纸必须与凝胶大小 完全一致？若不是这样结果会怎样？
• 2. 电转移时为什么都必须带手套小心 操作并除去气泡， 否则结果会怎样？
• 在进色后应时应注意哪些问题？ • 请简述免疫印迹实验的原理，并将之与
免疫学相关概念联系起来。
2024/2/12
2024/2/12
三 操作步骤
• 2显色反应 • 首先进行分子量标记的氨基黑染色。切
下转有分子量标记的硝酸纤维素薄膜， 用含有0.3%吐温20的PBS缓冲液漂洗 三次后（每次15分钟），再将其浸入氨 基黑染液中，室温染色5分钟，然后置 于氨基黑脱色液中脱去背景，水中漂洗 后景干备用。
2024/2/12
醇，定容到1000ml. 封闭缓冲液：5%（W/V）脱脂奶粉溶于PBS中
2024/2/12
二试剂和器材
1．试剂
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PBS: NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO4 0.24g 加双蒸水800ml,用HCl调pH到pH7.4,再加水到 1000ml,分装后，15磅20分钟灭菌。
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
2024/2/12
一 实验原理
• Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
• 首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离 ，然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到 固体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄 膜。随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称 为第一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免 疫反应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶 的抗第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫 反应，只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第 二抗体发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显 色剂存在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二 抗体的待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
4-氯萘酚显色液：用30mg 4-氯萘酚（简称4-CN）溶 于1ml无水乙醇中制成母液。将50μ14-CN对母液和 5μ130%的H2O2加入到5ml 0.05M/L Tris-Cl(pH7.6)中 。
氨基黑染色液：0.1%氨基黑10-B、45%甲醇、10% 冰乙酸
氨基黑脱色液：90%甲醇、2%冰乙酸、8%水
，将膜浸于其中，平放在平缓摇动的摇床平台上，室 温温育 1小时后，用PBS缓冲液将硝酸纤维素薄膜漂 洗 4 次 ， 每 次 5 分 钟 ， 再 加 入 4- 氯 萘 酚 显 色 液 ， 加 入 5μ1 的30%H2O2，将硝酸纤维素薄膜置于其中缓慢
摇动，待所检测的蛋白带显色达到最深程度后，将硝 酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出 硝酸纤维素薄膜，自然晾干后拍照保存结果。