HPLC-VWD法同时测定丹参及三七混合物中8种有效成分的含量

HPLC-VWD法同时测定丹参及三七混合物中8种有效成分
的含量
郭锦明;戚爱棣;李庆云
【摘要】目的建立HPLC-VWD法同时测定丹参、三七混合物中8种有效成分的含量.方法采用Eclipse XDB-C18(150mm×4.6mm,5ūm)色谱柱;流动相:乙腈-O.1%磷酸水梯度洗脱;流速:1.OmL·min-1,柱温:15℃;采用切换波长的方法:在203nm下检测三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re,人参皂苷Rb1;在286nm下检测丹酚酸B;在270nm下检测隐丹参酮、丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ.结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、丹酚酸B、人参皂苷Rb1、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA在相应的浓度范围内与峰面积呈现良好的线性关系,相关系数均大于
0.9995;平均回收率97.56%～103.O%,RSD均小于3.0%.结论该方法采用波长切换法同时测定不同吸收波长的化合物,方法简便、重复性好.
【期刊名称】《药学研究》
【年(卷),期】2010(029)001
【总页数】4页(P11-14)
【关键词】高效液相色谱法;可变波长检洲器;波长切换;丹参酮ⅡA;丹酚酸B;三七皂苷R1
【作者】郭锦明;戚爱棣;李庆云
【作者单位】天津中医药大学中医药研究院,现代中药发现与制剂技术教育部工程
研究中心,天津300193;天津中医药大学中医药研究院,现代中药发现与制剂技术教
育部工程研究中心,天津300193;天津中医药大学中医药研究院,现代中药发现与制
剂技术教育部工程研究中心,天津300193
【正文语种】中文
【中图分类】R927.2
复方丹参方由丹参、三七和冰片组成,是《中国药典》收载的治疗心血管疾病的重
要品种之一。

具有活血化瘀,理气止痛的功效,主要用于治疗冠状动脉(粥样)硬化,心
绞痛,高脂血症等疾病[1]。

丹参作为君药,主要活性成分为酚酸类(水溶性)及二萜醌
类(脂溶性)成分。

丹酚酸B是酚酸类的主要成分,具有抑制血小板聚集、抗氧化及
保护心脏微血管内皮细胞等作用;二萜醌类成分如丹参酮ⅡA、隐丹参酮等则具有扩张冠状动脉、提高冠脉血流、保护心肌及广谱抑菌的作用[2,3]。

三七为臣药,主要
活性成分为皂苷类成分如三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1和人参皂苷 Rb1,具有抗血
栓形成、扩张血管及保护心肌等作用[4]。

近年来,科研工作者开展了大量关于丹参、三七及其有效部位的研究。

本研究主要开展了三七皂苷、丹参酚酸及丹参酮有效部位中主要有效成分的测定,为后期开展有效部位配伍研究奠定基础。

为了提高检测
效率,将三七皂苷、丹参酚酸及丹参酮有效部位1∶1∶1混合,测定混合物中各成分
的含量,从而计算各有效部位中有效成分的含量。

文献报道有丹参水溶性成分或脂溶性成分[5,6]或两类成分同时测定[7],有三七中皂苷类成分的测定[8～10]。

主要采用HPLC-DAD[8,10]检测或 HPLC-ELSD检测[9]或HPLC-UV-ELSD[11]检测。

本文采用HPLC-VWD检测器,利用检测器波长切换的功能,对多类化合物进行同时测定,该方法简便、准确、高效,具有较好的推广价值。

1 仪器与试药
Waters 2695高效液相色谱系统,Empower色谱工作站(Waters公司);MET TLER
TOLEDO AX205(瑞士)十万分之一天平;BP121S万分之一天平(德国塞多利斯公司)。

三七皂苷R1(110745-200415),人参皂苷Rg1(110703-200424),人参皂苷
Re(110754-200421),人参皂苷 Rb1(110704-200420),丹酚酸B(111562-200302),隐丹参酮(110852-200305),丹参酮ⅡA(110766-200416),丹参酮
Ⅰ(0867-200205)对照品均购于中国药品生物制品检定所;三七总皂苷、总丹酚酸
及总丹参酮中间体由浙江大学药学院提供;甲醇、乙腈为色谱纯,磷酸为分析纯,水为超纯水。

2 方法与结果
2.1 样品的制备取三七总皂苷、丹参酚酸及丹参酮有效部位适量,过三号筛,精密称
定上述三类成分各1.00g,混合均匀后即得,备用。

2.2 色谱条件 Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6mm×150mm,5μ m);流动相:0.1%磷酸A-乙腈B,梯度洗脱(0～20min:乙腈20.9%;20～28min:乙腈 20.9%～30%;28～
70min:乙腈30%～55%;70～85min:乙腈 55%～85%),分析时间85min;检测波长(0.00～22.00min:203nm,22.01～32.00min:286nm,32.01～
35.00min:203nm,35.01～85.00min:270nm);柱温15℃;流速1.0mL·min-1;进样
量10μ L。

理论塔板数按丹参酮ⅡA计不低于4000。

2.3 供试品溶液的制备取“2.1”项下制备的混和中间体92.00mg,精密称定,置
50mL具塞锥形瓶中,加甲醇至刻度,密塞,称定重量,超声处理10min,放冷,补足减失重量,摇匀,0.45 μ m微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。

供试品、对照品溶液色谱图见
图1。

图1 供试品(A)和混合对照品(B)色谱图1.三七皂苷R12.人参皂苷 Rg13.人参皂苷Re 4.丹酚酸B 5.人参皂苷Rb16.隐丹参酮 7.丹参酮Ⅰ 8.丹参酮ⅡA
2.4 对照品溶液的制备及线性关系考察精密称取三七皂苷 R12.40mg,人参皂苷
Rg19.95mg,人参皂苷 Re 1.85mg,丹酚酸B 3.52mg,人参皂苷Rb17.68mg,隐丹
参酮2.74mg,丹参酮Ⅰ2.03mg,丹参酮ⅡA1.27mg分别于2mL量瓶中,加甲醇定
容至刻度。

取各标准品溶液1mL置同一10mL量瓶中,配成浓度分别为 120.0、497.5、92.5、176.0、384.0、137.0、101.5、56.34μ g· mL-1的混合对照品溶
液 ,逐级稀释成一系列不同浓度的对照品溶液,以峰面积对浓度作线性回归,得各成
分回归方程,结果见表1。

表1 8个化合物的回归方程、相关系数和线性范围(n=6)对照品名称检测波长(nm) 回归方程相关系数(r) 线性范围(μ g)三七皂苷R1 203 Y=3188.6 X-1232.3
0.9999 0.0375～1.20人参皂苷Rg1 203 Y=3105.7 X-1007.6 0.9998 0.1555～4.975人参皂苷 Re 203 Y=3413.1 X-4338.4 0.9995 0.0286～0.925丹酚酸B 286 Y=11140 X+25.896 0.9998 0.0550～1.76人参皂苷Rb1 203
Y=2584.2X+4224.6 0.9999 0.120～3.84隐丹参酮 270 Y=48253 X+311730
0.9998 0.0428～1.37丹参酮Ⅰ 270 Y=44029 X+102748 0.9956 0.03170～
1.015丹参酮ⅡA 270 Y=80584 X+8156.8 0.9997 0.01760～0.5634
2.5 精密度试验按“2.3”项下制备供试品溶液,连续进样6次,三七皂苷 R1、人参
皂苷 Rg1、人参皂苷 Re、丹酚酸B、人参皂苷 Rb1、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA色谱峰面积的RSD(n=6)分别为:0.86%、1.51%、1.25%、1.49%、1.42%、
1.63%、1.52%、1.50%,表明精密度良好。

2.6 稳定性试验取同一样品溶液,分别在0h,4h,6h,8h,12h,24h进样,以峰面积计算(n=6),三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Re、丹酚酸 B、人参皂苷Rb1、
隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的 RSD 分别为:2.95%、1.78%、2.09%、
2.77%、2.53%、2.53%、2.40%、2.32%。

结果表明:室温条件下,供试品溶液中各成分在24h内稳定。

2.7 重复性试验按“2.3”项下平行制备6份供试品溶液,依法测定含量,结果见表2。

表2 重复性试验结果(n=6)样品含量/(mg/mg)样品三七皂苷R1 人参皂苷Rg1 人
参皂苷Re 丹酚酸B 人参皂苷Rb1 隐丹参酮丹参酮Ⅰ 丹参酮ⅡA 1 0.01613 0.1197 0.009016 0.1448 0.1037 0.01974 0.009075 0.04987 2 0.01655 0.1214 0.008976 0.1422 0.1083 0.01986 0.009011 0.05013 3 0.01669 0.1223
0.008731 0.1463 0.1076 0.01912 0.008527 0.04790 4 0.01647 0.1166
0.008491 0.1465 0.1049 0.01935 0.009049 0.04916 0.01662 0.1980
0.008492 0.1446 0.1065 0.01940 0.008942 0.049 65 6 0.01665 0.1218
0.008700 0.1472 0.1067 0.01881 0.008784 0.04777平均值 0.01652 0.1203
0.008735 0.1454 0.1063 0.01938 0.008898 0.04908 RSD(%) 1.25 1.71 2.59
1.31 1.60
2.00 2.35 2.07 5
2.8 加样回收率试验称取已知含量的混合中间体46.00mg,置50mL量瓶中,加入已知浓度分别为1.098、4.155、0.901、1.542、
3.475、1.183、0.454、
0.212mg ·mL-1的三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Re、丹酚酸 B、人参皂苷Rb1、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ 、丹参酮ⅡA0.7、1.2、0.39、3.6、1.3、0.8、0.8、9.8mL,按“2.3”项下平行制备 6 份供试品溶液,测定,结果见表3。

表3 加样回收率试验结果(n=6)成分基础值(mg) 加标值(mg) 测得值(mg)平均回收率(%)RSD(%)三七皂苷R1 0.739 0.769 1.489 97.56 2.49人参皂苷Rg1 5.379 4.985 10.515 103.0 1.96人参皂苷Re 0.391 0.351 0.737 98.52 2.75丹酚酸B 6.507 5.551 12.118 101.2 3.00人参皂苷Rb1 4.755 4.517 9.333 101.4 2.68隐丹参酮 0.867 0.946 1.832 101.9 2.80丹参酮Ⅰ 0.398 0.363 0.766 101.2 2.70丹参酮ⅡA 2.197 2.078 4.289 100.7 2.92
2.9 样品含量测定按样品检测方法测定各样品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、丹酚酸B、人参皂苷Rb1、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的含量,结果见表4。

表4 丹参、三七混合物中各成分测定结果(n=3)含量(mg·mg-1)化合物Batch 1
Batch 2 Batch 3三七皂苷 R1 0.01622 0.01513 0.01490人参皂苷Rg1 0.1210 0.1112 0.1073人参皂苷 Re 0.009207 0.008490 0.008680人参皂苷 Rb1
0.1013 0.1025 0.1019丹酚酸B 0.1447 0.1465 0.1344隐丹参酮 0.01893
0.01949 0.01829丹参酮ⅡA 0.04748 0.04692 0.04615丹参酮Ⅰ 0.008110 0.007940 0.007850
3 讨论
3.1 流动相的选择皂苷类成分的最大吸收值为203nm,为末端吸收。

甲醇、乙腈的截止波长分别为205nm及190nm,在使用甲醇为流动相时导致明显的基线噪音,故选用乙腈为流动相的有机相。

试验最初选用0.1%的甲酸作为流动相的水相,但甲酸紫外吸收明显,使基线向下漂移,故选用0.1%磷酸作为流动相的水相。

3.2 提取溶剂及体积的选择试验中曾考察用100%甲醇,70%甲醇,50%甲醇作为提取溶剂,结果表明100%甲醇提取效果最好,且50mL及100mL甲醇提取效果近,故选用50mL甲醇作为提取溶剂。

3.3 柱温的考察文献表明[4]:对于分离人参皂苷Rg1和Re、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ柱温多设定为30℃或35℃,但本试验在上述柱温条件下人参皂苷Rg1和Re、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ的分离度均小于1.5,故分别考察了20℃,15℃柱温下的分离情况,结果表明:15℃柱温下人参皂苷 Rg1和 Re、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ分离较好。

这与多数文献所载的条件不一致,其原因可能是所采用的色谱柱长度不同,文献中所记载的多为(
4.6mm×250mm,5μ m)规格的色谱柱,而本试验采用的为
(4.6mm×150mm,5μ m)规格的色谱柱。

3.4 检测波长的选择本文选取复方丹参方中主要药效物质:三七皂苷 R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷 Re、丹酚酸B、人参皂苷 Rb1、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮
ⅡA作为定量指标进行检测。

皂苷类的紫外最大吸收在203nm,丹酚酸B在
286nm,隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA在270nm,为使各成分达到吸收强、干
扰小的目的,根据这8种化合物的结构特点及其在C18柱上出峰顺序的先后,结合流动相的梯度配比,最终确定检测波长。

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