结直肠癌组织KRAS、BRAF基因突变情况及其临床意义

结直肠癌组织KRAS、BRAF基因突变情况及其临床意义陈伊;韦常宏;宁淑芳;韦文娥;刘海洲;利基林;张力图
【摘要】目的探讨结直肠癌组织KRAS、BRAF基因突变情况及其临床意义.方法选择行手术治疗的结直肠癌患者262例,采用ARMS-PCR法检测其结直肠癌组织KRAS基因外显子2第12、13位密码子及BRAF V600E基因突变情况,分析其与患者临床病理参数、肝转移及预后的关系.结果 262例结肠癌患者中女性患者98例.262例份结肠癌组织中,KRAS基因突变49例(18.7%),其中第12位密码子突变37例(包括1例KRAS复合突变),第13位密码子突变12例;184例份结肠癌组织中,BRAF V600E基因突变6例.结直肠癌组织KRAS基因突变与患者性别(女性)、原发肿瘤直径、远处转移情况均有关,BRAF基因突变与民族、家族史、原发肿瘤分化程度均有关(P均<0.05).同时性肝转移患者KRAS基因突变率高于异时性肝转移患者,KRAS基因G13D突变率低于异时性肝转移患者(P均<0.05).KRAS基因突变的结直肠癌患者生存时间短于未突变者(P<0.05).KRAS基因突变是结直肠癌患者预后的独立危险因素(P<0.01).BRAF基因突变与未突变者生存时间比较差异无统计学意义(P>0.05).结论结直肠癌组织KRAS基因突变率高,BRAF基因突变率低;KRAS基因突变多发生于女性,与结直肠癌的发生、发展有关.
【期刊名称】《山东医药》
【年(卷),期】2017(057)016
【总页数】4页(P77-80)
【关键词】结直肠癌;KRAS基因;BRAF基因;基因突变;预后
【作者】陈伊;韦常宏;宁淑芳;韦文娥;刘海洲;利基林;张力图
【作者单位】广西医科大学附属肿瘤医院,南宁 530021;广西医科大学附属肿瘤医院,南宁 530021;广西医科大学附属肿瘤医院,南宁 530021;广西医科大学附属肿瘤医院,南宁 530021;广西医科大学附属肿瘤医院,南宁 530021;广西医科大学附属肿瘤医院,南宁 530021;广西医科大学附属肿瘤医院,南宁 530021
【正文语种】中文
【中图分类】R735.3
KRAS基因是EGFR信号通路上的一个重要作用靶点，抗EGFR单克隆抗体(西妥昔单抗、帕尼单抗)治疗结直肠癌的疗效与KRAS基因突变状态密切相关，只有KRAS野生型患者才可从抗 EGFR单克隆抗体单药治疗或联合化疗中获益[1]。

BRAF V600E基因是KRAS基因下游的作用位点，其突变状态可能会影响抗EGFR 单克隆抗体的治疗效果。

2009年1月～2012年12月，本研究观察了结直肠癌组织KRAS与BRAF基因的突变情况，现分析结果并探讨其临床意义。

1.1 临床资料选择同期于广西医科大学附属肿瘤医院行手术治疗的结直肠癌患者262例，男164例、女98例，年龄24～87岁、中位年龄55岁；民族：汉族182例、壮族70例、其他10例；家族史：结直肠腺癌家族史4例、大肠腺瘤家族史2例、溃疡性结肠炎家族史2例、家族性腺瘤性息肉病1例；组织学类型：腺癌229例、黏液腺癌+印戒细胞癌33例；肿瘤部位：左半结肠81例、右半结肠70例、直肠111例；原发肿瘤分化程度：低分化93例、中分化161例、高分化8例；原发肿瘤直径：≤5 cm 146例、>5 cm 116例；T分期：T1、T2期20例、T3、T4期242例；N分期：N0期95例、N1期98例、N2期69例；远处转移情况：无转移70例、肝转移135例、其他部位转移57例；肝转移情况：同时性肝转移105例、异时性肝转移30例；临床分期：Ⅰ、Ⅱ期35例、Ⅲ、Ⅳ期227例。

均经病理组织学检查确诊为结直肠癌，术前均未接受抗EGFR靶向治疗。

本研究经医院伦理委员会审核，患者及其家属均签署知情同意书。

1.2 癌组织KRAS、BRAF基因突变检测采用ARMS-PCR法。

收集262例患者术中切除的新鲜肿瘤组织，立即放入液氮中冷冻， -80 ℃冰箱保存。

将组织进行甲
醛固定、石蜡包埋，4 μm厚切片，脱蜡、水化，共10张切片。

取1张切片进行HE染色，显微镜下选择肿瘤细胞富集区域，确保其肿瘤细胞比例≥80%。

取其余
9张切片，参照DNeasy Blood &Tissue Kit和QIAamp DNA FFPE Tissue Kit
试剂盒(德国Qiagen公司)说明书提取样本DNA，采用ARMS-PCR法检测KRAS 基因外显子2第12、13位密码子突变情况。

其中184例份结直肠癌组织仅行BRAF V600E突变检测。

参照人类KRAS基因7种突变检测试剂盒和人类BRAF
基因V600E突变检测试剂盒说明书，KRAS基因外显子2上游引物：5′-AGGCCTGCTGAAAATGACTG-3′，下游引物：5′-GGTGCAGGACCATTCTTTGA-3′，目的片段：173 bp；BRAF基因第15号外显
子上游引物：5′-GCTFGCTCTGATAGGAAAATGAG-3′，下游引物：5′-GTAACTCAGCAGCATCTCAGG-3′，目的片段：237 bp。

反应循环参数：95 ℃、5 min；95 ℃、25 s，64 ℃、20 s，72 ℃、20 s，循环15次；93 ℃、25 s，
60 ℃、35 s，72 ℃、20 s，循环31次。

每次试验均按要求设定阴性、阳性对照
孔及空白对照孔。

使用Roche480Ⅱ实时荧光定量PCR仪进行检测，PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳确定后，根据突变检测试剂盒说明书提供的判读原则，将样品
ΔCt值(突变Ct值-外控Ct值)与信号阈值比较，样品检测结果分为阳性和阴性。

1.3 相关性分析分析KRAS、BRAF基因突变与患者临床病理参数的关系；随访至2015年12月，以死亡为终点事件，绘制生存曲线，分析KRAS、BRAF基因突变与患者生存时间及预后的关系。

1.4 统计学方法采用SPSS19.0统计软件。

KRAS、BRAF基因突变率与临床病理
参数的关系采用χ2检验或Fisher确切概率法。

采用Kaplan-Meier法绘制生存曲
线，Log-Rank检验法分析KRAS、BRAF基因突变对患者生存时间的影响，COX 比例风险回归模型进行预后影响因素分析。

P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 KRAS、BRAF基因突变情况 262例份结肠癌组织中，KRAS基因突变49例(18.7%)；第12位密码子突变37例(14.1%)，包括1例KRAS复合突变(G12V和G12R同时突变)，第13位密码子突变12例(4.6%)，未检出第12、13位密码子
同时突变；其余均未发生突变。

184例份结肠癌组织中，BRAF V600E基因突变6例(3.3%)。

见表1。

同时性与异时性肝转移患者KRAS基因突变率分别为
27.6%(29/105)、6.7%(2/30)，二者比较P<0.05； KRAS基因G13D突变率分别为4.8%(5/105)、30%(9/30)，二者比较P<0.05；同时性与异时性肝转移患者KRAS基因其他类型突变率比较P均>0.05。

2.2 结直肠癌组织KRAS、BRAF基因突变与患者临床病理参数的关系见表2。

2.3 结直肠癌组织KRAS、BRAF基因突变与患者预后的关系患者术后随访2.37～77.31个月，失访8例，随访率为96.9%。

共30例患者死亡，中位
生存时间为22.43个月。

生存曲线分析结果显示，KRAS基因突变的结直肠癌患者生存时间为(27.43±3.2)个月，未突变者为(46.22±4.25)个月，二者比较P<0.05；BRAF基因突变的结直肠癌患者生存时间为(31.23±3.61)个月，未突变者为(35.93±2.19)个月，二者比较P>0.05。

COX比例风险回归模型多因素分析结果显示，KRAS基因突变是结直肠癌患者预后不良的独立危险因素(β=2.044，
RR=7.725，95% CI：2.722～21.927，P<0.01)。

结直肠癌的发生、转移是一个受多基因、多因素影响的过程，EGFR与肝转移密切相关[2]。

KRAS、BRAF基因是该信号通路下游的重要位点，其中BRAF基因又是KRAS基因下游的重要位点，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。

KRAS基因野生型患者能从抗EGFR靶向治疗中获益，但仍有部分患者对抗EGFR药物治疗无反应；BRAF基因与抗EGFR治疗效果的关系目前无统一定论，尚不能单独作为预测因子。

本研究结直肠癌组织KRAS基因突变率为18.7%，BRAF基因突变率为3.3%，与目前国内外研究报道接近[3～5]。

一项来自多地区、纳入6 346例患者的研究表明，G12R突变为我国罕见突变类型[6]。

本研究检出1例G12R突变，该患者同时伴
有G12V突变；并未检出KRAS基因第12、13位密码子同时突变，表明各密码
子突变是相互独立的。

V600E为BRAF基因的常见突变位点，本研究显示该位点
突变率较低，仅为3.3%。

高静等[4]研究认为，KRAS突变更易发生在女性且分化程度较好的右半结肠癌患
者中，并与年龄有关。

也有研究认为，KRAS基因突变与结直肠癌患者的年龄、性别、分化程度、肿瘤位置等临床病理参数均无关[7，8]。

本研究结果显示，结直肠癌组织KRAS基因突变与患者的性别、原发肿瘤直径、远处转移情况均有关。

Chen等[9]大样本Meta分析结果显示，女性、老年患者以及右半结肠癌患者BRAF基因突变率较高；但也有研究显示BRAF突变与临床病理参数之间无显著性关系[10]。

本研究中结直肠癌组织BRAF基因突变与患者的民族、家族史、原发肿瘤分化程度均有关。

KRAS、BRAF基因突变对结直肠癌患者肝转移及预后的影响报道不一[10,11]。

Bazan等[12]认为，KRAS基因第13位密码子突变与高度侵袭性结直肠癌相关，
预示其可能是肿瘤扩散和导致患者死亡的独立危险因素。

Yaeger等[13]研究表明，BRAF基因突变与转移性结肠癌预后差有关，伴有该基因突变的患者更容易发生肝、腹膜转移，且转移瘤术后生存期更短。

Modest等[14]研究结果表明，KRAS基因第13位密码子突变与结直肠癌发生同时性肝转移及局部转移相关。

梁立等[15]指出，结直肠癌同时性肝转移与RAS-RAF-ERK、P13K-PTEN-AKT通路同时激活有关，异时性肝转移与P13K-PTEN-AKT单独激活、RAS-RAF-ERK不激活有关。

本研究结果显示，同时性肝转移患者KRAS基因突变率高于异时性肝转移患者，KRAS基因G13D突变率低于异时性肝转移患者。

G13D突变有一定的疗效评估作
用，G13D突变的结直肠癌患者能从一线西妥昔单抗治疗中获益，而且其获益程度与KRAS野生型相仿，提示KRAS基因G13D突变的特殊性。

由于已经得出BRAF基因突变与患者远处转移情况无关的结果，故本研究未对同时性与异时性肝转移患者的BRAF基因突变率进行对比分析。

文献报道，KRAS第13位密码子突变的患者较未突变者生存期更短[5, 16]。

但本研究结果显示，KRAS基因突变的结直肠癌患者生存时间明显短于未突变者，KRAS基因突变是结直肠癌患者预后的独立危险因素，提示KRAS基因突变患者预后较差；但本研究并未发现KRAS基因G13D突变、BRAF基因突变与预后的关系，可能与样本量小、随访时间短有关。

综上所述，结直肠癌组织KRAS基因突变率高，BRAF突变率低；KRAS基因突变多发生于女性，与结直肠癌的发生、发展有关。

未来将进一步明确KRAS基因在结直肠癌肝转移中的作用，及其突变相关生物标志物的表达变化，以期为结直肠癌的快速诊断、病情判断及预后评估提供理论依据。

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