肠道微生物DNA提取

土壤微生物中提取总DNA
实验概要
从土壤微生物中提取总DNA并纯化，高质量的DNA可用于后续文库构建。

主要试剂
TENP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)
PBS缓冲液(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4)
DNA提取缓冲液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3PO4, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0)
蛋白酶K(25 mg/mL)
溶菌酶(50 mg/mL, pH 8. 0)
20% SDS
氯仿
异戊醇
异丙醇
70%乙醇
RNAse 20 mg/mL
QIAXⅡ大片段凝胶回收试剂盒(Qiagen)
主要设备
50mL、1.5 mL离心管
摇床
高速离心机
水浴锅
电泳槽
电泳仪
涡旋仪
实验材料
土壤样品
实验步骤
1. 总DNA提取：
(1) 取2 g土样，置于50mL灭菌的离心管中；
(2) 加入10 mL TENP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)悬浮土样，200转摇床振荡10min充分混匀；
(3) 10 000 r/min离心5 min，弃上清，重复洗涤多次至上清基本为无色；
(4) 用5 mL PBS缓冲液(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4)漂洗一次；
(5) 沉淀加入13.5 mL DNA提取缓冲液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3PO4, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0)，混匀后加入100 μL蛋白酶K(25 mg/mL)和200 μL溶菌酶(50 mg/mL, pH 8. 0)，37℃水浴30 min，每隔10 min颠倒混匀；
(6) 加入2 mL 20% SDS，65℃水浴2 h，每隔20 min颠倒混匀；
(7) 8 000 r/min室温离心15 min，取上清，用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次；
(8) 水相中加入0.6倍体积的异丙醇，4℃沉淀过夜；
(9) 11 000 r/min 4℃离心20 min收集DNA沉淀；
(10) 70%乙醇漂洗两次，干燥后用100 μL ddH2O(含RNAse 20 mg/mL)溶解，转入1.5 mL离心管。

2. 总DNA纯化：
(1) 配制0.8%琼脂糖凝胶；
(2) 每个上样孔加入50 μL粗DNA，进行低电压长时间电泳(4℃, 25 V, 8 h)；
(3) 电泳结束后，切下主带所在的凝胶(胶的体积尽可能小)；
QIAXⅡ大片段凝胶回收试剂盒(Qiagen)回收：加入3倍体积的Buffer QXⅠ及适量的QIAXⅡ(Glassmilk)，55℃温浴10 min，每隔2 min轻轻用手指弹起沉淀(回收大片段时不要涡旋)，待凝胶完全溶解，12 000 g离心1 min，弃上清；再加入500 μL Buffer QXⅠ洗涤沉淀1次以消除剩余凝胶；再用500 μL Buffer PE 洗涤沉淀2次，将沉淀晾干，加入适当体积的ddH2O，离心后收集上清，琼脂糖凝胶电泳确定回收效率。

肠道微生物DNA的提取
实验概要
肠道微生物DNA是进行微生物分子生态学研究的前提。

能否获得高的DNA提取率和高质量的DNA，从而真实地反映微生物群落的实际情况，是保障研究结果是否可靠的关键。

如何获取高质量、较完整的肠道菌群基因组DNA是肠道微生物研究中的关键。

本研究采用物理方法，化学方法，酶解法等进行DNA提取，并对其进行比较，经过优化得到最佳的提取方法，使其符合以后PCR扩增要求以及其它后续研究工作。

试验结果表明用液氮研磨加CTAB 提取液的方法提取的肠道微生物总DNA的效果高于其它方法。

并且通过电泳以及PCR检测，所提取的DNA的质量适于进一步的分子生物学研究。

实验材料
健康成年对虾购于市场，挑取生长较好、大小均一的，于超净台下取肠道，无菌操作。

实验步骤
1. DNA提取方法
方法A：
1) 取0.02g虾肠加入总量1mL PBS匀浆，液氮研磨
2) 加入250uL 0.5% Tween-80，吹打洗脱3min
3) 300g离心5min，取上清
4) 10000g离心l0min，弃上清
5) 加入250uL DNA裂解液，涡旋混和器上混合30s
6) 65℃水浴20min，期间每5min混合一次
7) 12000g离心15min，取上清
8) 加等体积酚/氯仿，14000g离心15min，取上清
9) 加入2.5倍体积异丙醇，-20℃静置1-2h
10) 4℃14000g离心15min，弃上清
11) 加入300uL 70%预冷乙醇，14000g离心l0min，弃上清
12) 超净台下干燥，加50uL TE重悬，冻于-80℃
方法B：
1) 取0.02g虾肠，加130uL CTAB提取液，冰浴超声100W，5min
2) 放入液氮中冰冻20min，迅速放入65℃水浴中5min，重复3次
3) 放入37℃摇床，加10uL溶菌酶，振荡30min
4) 加15uL 20%(W/C)SDS } 65℃温育2h
5) 4℃3200g离心l0min，取上清
6) 加100uL CTAB液和25uL 20 %SDS，涡旋，65℃温育l0min
7) 3200g离心，取上清
8) 加等体积酚/氯仿，14000g离心15min，取上清
9) 加0.7倍体积异丙醇，-20℃静置1-2h
10) 4℃14000g离心15min，弃上清
11) 加入300uL 70%预冷乙醇，14000g离心l0min，弃上清
12) 超净台下干燥，加50uL TE重悬，冻于-80℃
方法C：
1) 取0.02g虾肠，液氮研磨，加入总量1mL PBS和20uL 20% PVPP匀浆
2) 200g离心6min，取上清，沉淀中加1mL PBS离心取上清，合并上清；300g离心6min，取上清
3) 1200g离心6min，收集菌体，并用PBS洗涤
4) 得到的菌体中加入300uL裂解液I，10%溶菌酶100uL，1% RNase 20uL，混匀后37℃保温30min
5) 加入300uL裂解液II，50uL 20% SDS，50uL 20% PVPP，混匀冰浴5min
6) 加等体积酚/氯仿，13000g离心8min，取上清，重复1次
7) 加入2倍体积异丙醇和1/10倍体积3M醋酸钠，-20℃沉淀2h
8) 4℃14000g离心15min，弃上清
9) 加入600uL 70%预冷乙醇，14000g离心10min，弃上清
10) 超净台下干燥，加50uL TE重悬，冻于-80℃
优化CTAB法：
1) 无菌条件下剖取对虾肠道，放入无水乙醇中，冻于-80℃
2) 取虾肠(0.02g左右)，液氮研磨，加入总量1mL PBS和20uL 20% PVPP，0.5% Tween-80，吹打洗脱3min
3) 200g离心6min，取上清，沉淀中加1mL PBS离心取上清，合并上清；取上清
4) 1200g离心6min，收集菌体，并用PBS洗涤
5) 得到的菌体中加130uL CTAB提取液和10uL溶菌酶，放入37℃摇床，
6) 加15uL 20%(W/C) SDS和10uL蛋白酶K，65℃水浴2h
7) 4℃3200g离心10min，取上清匀浆；加入250uL300g离心6min，振荡30min
8) 加100uL CTAB液和25uL 20% SDS，涡旋，65℃水浴l0min
9) 3200g离心，取上清
10) 加等体积酚/氯仿，14000g离心15min，取上清
11) 加0.7倍体积异丙醇，-20℃静置1h
12) 4℃14000g离心15min，弃上清
13) 加入600uL 70%预冷乙醇，14000g离心l0min，弃上清
14) 超净台下干燥，加50uL TE重悬，冻于-80℃备用
2. DNA浓度测定和电泳检测
所提DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

用紫外分光光度计于260nm，280nm波长下测定粗提DNA的吸光值及浓度，计算出A260/A280值。

用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

3. 肠道微生物DNA的PCR检测
PCR引物为接近全长的细菌通用引物:27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTC-3'；M=A或C)；13878 (5'-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3'；W=A或T)。

将提取到的基因组DNA稀释20倍后分别取1，2，4，8uL和原样1uL，2uL作为模板。

PCR 反应体系是：无菌双蒸水34.5ul，10XPCR缓冲液5ul，2.5 mmol/L dNTP 4ul，2.5 umol/L PCR 引物各2ul，Taq酶0.5ul。

反应条件:94℃预变性4 min；94℃1 min，55℃1 min，72℃2 min，30个循环；72℃10 min。

取5uL PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker选用DL2000，紫外检测扩增产物，凝胶成像。