外显子捕获-高通量测序技术用于法洛四联症胎儿遗传学检测

外显子捕获-高通量测序技术用于法洛四联症胎儿遗传学检测刘翠云;王艳;孙瑞红;罗春玉;张菁菁;成建;梁栋;马定远;胡平
【摘要】目的用外显子捕获-高通量测序(exon-capture high-throughput sequencing,EC-HTS)技术寻找法洛四联症(tetralogy of fallot,TOF)胎儿可能存在的遗传学致病性证据,并探讨其在产前分子遗传学诊断中的价值.方法选择经超声心动图发现且G显带和微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)分析结果均正常的9例TOF胎儿作为研究对象,以63个人类已知的先天性心脏病致病基因作为检测靶点制作捕获芯片,用EC-HTS技术进行检测,数据经过Calling、数据库比对、软件分析得到最终病理性突变位点;并用Sanger测序对其进行验证.结果在9例胎儿中共检测到单核苷酸多态性(SNP)位点732个,结果经过生物信息学分析得到致病性突变位点3个:CITED2c.574_579 del AGCGGC(p.S192_G193de1纯合突变,CHD7c.2550_2554 del
GAGAA(p.K850Nfs*6)杂合突变,NOTCH2 c.4918T＞C(p.F1640L)杂合突
变.Sanger测序结果验证了这3个突变位点的真实存在,父母溯源检测发现这3个点突变均为新发突变.结论用靶向性EC-HTS技术发现了3例TOF胎儿存在病理性基因突变,可能为其致病的遗传学病因.
【期刊名称】《临床检验杂志》
【年(卷),期】2015(033)006
【总页数】4页(P405-408)
【关键词】高通量测序技术;外显子捕获;法洛四联症;基因突
变;CHD7;NOTCH2;CITED2
【作者】刘翠云;王艳;孙瑞红;罗春玉;张菁菁;成建;梁栋;马定远;胡平
【作者单位】南京医科大学附属南京妇幼保健院产前诊断中心,南京210004;南京医科大学附属南京妇幼保健院产前诊断中心,南京210004;南京医科大学第一临床医学院检验系,南京210004;南京医科大学附属南京妇幼保健院产前诊断中心,南京210004;南京医科大学附属南京妇幼保健院产前诊断中心,南京210004;南京医科大学附属南京妇幼保健院产前诊断中心,南京210004;南京医科大学附属南京妇幼保健院产前诊断中心,南京210004;南京医科大学附属南京妇幼保健院产前诊断中心,南京210004;南京医科大学附属南京妇幼保健院产前诊断中心,南京210004【正文语种】中文
【中图分类】R725.4
法洛四联症(tetralogy of fallot, TOF)是一种典型的复杂先天性心脏病类型，约占先天性心脏病的7%～10%。

TOF形成的主要原因是在胚胎时期心球与动脉干分割不均导致心脏流出道的狭窄，患儿如不及时手术治疗，90%患者会夭折，危害严重[1]。

临床现行的遗传疾病检测手段主要有G显带、多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)、荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)、微阵列比较基因组杂交技术(array-based comparative genomic hybridization, aCGH)等。

G显带技术虽然能够观察到染色体的形态，但其分辨率比较低；aCGH技术提高了检测分辨率，虽可检测出微小的病理性拷贝数变异，但无法检出单基因突变，故临床上急需一种适用于先天性心脏病的基因突变检测技术。

近年来，高通量测序技术的应用大大促进了遗传性疾病的诊断研究。

尤其是靶向性外显子捕获-高通量测序技术(exon-capture high-throughput sequencing, EC-
HTS)的应用发现了大量遗传病新的基因突变位点，被证明是一种具有良好应用前
景的高效遗传学检测技术[2]。

迄今为止，国内外关于EC-HTS技术用于先天性心
脏病的临床遗传学诊断的研究报道仍然较少[3-4]。

本研究选择了63种常见的人类已知先天性心脏病基因作为检测靶点设计捕获芯片，结合二代测序技术，对9例TOF胎儿进行了临床遗传学检测研究。

1.1 研究对象收集2014年1～10月在本院产前诊断中心经心脏超声心动图及
临床诊断为TOF胎儿的孕妇,术前无胎动异常、阴道流血、流水、发热、腹痛等，血常规、乙肝5项、凝血功能、抗HIV抗体及梅毒检查结果正常。

选择侵入性产
前诊断，用B超确定胎儿大小、周数、胎儿位置及胎儿数目，避开胎儿头部和重
要脏器确定好穿刺点，对穿刺点进行消毒，用穿刺针刺入羊膜腔，抽取羊水20 mL，对收集的羊水细胞进行相关处理和检查。

选择其中羊水细胞G显带和aCGH 技术检测羊水细胞检测结果均正常的孕妇9例作为研究对象，平均孕周为20周。

本研究经医院医学伦理学委员会批准，患者知情同意。

1.2 基因组DNA提取按照Dneasy Blood&Tissue试剂盒(德国Qiagen公司)说明书对9例胎儿的羊水细胞进行基因组DNA提取，用Nanodrop 2000超微量分光光度计(美国Thermo公司)进行DNA浓度和纯度检测，取吸光度(A260/280 nm)值为1.8～
2.0的样本用于后续实验。

1.3 靶向基因的选择与芯片设计根据文献[5-6]报道和数据库(CHDWiki和HGMD)查询，选择已知的与人类先天性心脏病有关的基因共63个作为检测靶点，由Nimbgene公司设计制作成捕获芯片。

见表1。

1.4 外显子捕获测序用超声波降解法将1 μg 基因组DNA打断成100～300
bp的片段，在片段两端加接头，进行文库构建。

使用定制的NimbleGenSeqCap EZ探针(Roche NimbleGen公司)对带接头的片段进行杂交捕获。

捕获的片段包
含与先天性心脏畸形相关的基因外显子区域及紧邻的10 bp内含子序列。

用
HiSeq 2500高通量测序平台(美国Illumina公司)对捕获片段进行双末端测序。

1.5 生物信息学分析用自动化流程对测序数据进行分析，通过BWA软件(版本：0.6.2-r126)将质量过滤后的测序结果比对参考基因组序列(UCSC hg19 Feb.2009)，基因组分析工具包(GATK)(/gatk/)检测序列中的
变异，并根据cDNA参考序列对突变进行描述。

等位基因频率来源于
dbSNP(snp137)、国际千人基因组数据库(Ⅰ期)、NHLBI ESP(6503)数据库和华
大基因本地数据库(BGI-DB, HGVD)。

SIFT、PolyPhen2及PhyloP Vertebrates
软件预测基因变异对编码蛋白质产生的影响和突变所在位置的保守度，从而判断其致病性。

1.6 Sanger测序验证根据各基因突变点在GenBank数据库中前后各1 000
bp的碱基序列(登录号：NM_006079.4，NM_017780.3，NM_024408.3，
NM_001163817.1)在NCBI中用Primer-BLAST进行引物设计，引物由苏州金唯智公司合成。

引物序列见表2。

PCR反应体系为50 μL，包括20～30 ng/μL DNA模板 2 μL， AceTaq酶25 μL，10 μmol/L的上、下游引物各2 μL，
ddH2O 19 μL。

循环参数：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃ 10 min。

PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

同时将PCR产物送苏州金唯智公司进行Sanger双向测序，以验证高通量测序结果。

2.1 EC-HTS测序结果与GenBank所公布的序列进行比对，9例胎儿中共发现3例胎儿有基因突变，其余6例未发现可疑的致病突变。

3例阳性样本中胎儿1在CITED2基因的编码区的574～579位之间缺失AGCGGC碱基
(c.574_579delAGCGGC)，导致CITED2基因的第2外显子第192位和第193位密码子的缺失，引起脯氨酸和甘氨酸的缺失；胎儿2在CHD7基因编码区的2 550～2 554位之间缺失GAGAA 5个碱基(c.2550_2554delGAGAA)，导致
CHD7基因的第8外显子的第850位密码子由赖氨酸变为天冬酰胺，同时从赖氨
酸顺数到第6位变成终止密码子，该突变为框移突变；胎儿3在NOTCH2基因的编码区的第4 918位碱基T变成了碱基C(c.4918T>C)，导致NOTCH2基因的第27外显子的第1 640位氨基酸由苯丙氨酸变为亮氨酸。

3个突变点在千人基因组、ESP数据库中均未见报道。

生物信息学分析软件MutationTaster预测结果提示该突变致病的可能性为99.99%，SIFT软件预测c.4918T>C为有害突变。

父母溯源
发现3个突变点均为新发突变。

2.2 Sanger测序验证结果发现3例基因突变的样本中1例为纯合突变，2例
为杂合突变，验证结果与EC-HTS测序结果均符合，见图1。

本研究中检测出的3个基因突变点中NOTCH2 c.4918T>C (p.F1640L)国内外尚
未见报道，其余两个突变点为已知突变[8-9]。

Blue等[3]设计了包括TBX5、ZFPM2等57个与先天性心脏病相关的基因捕获芯片，对16个有先天性心脏病家族史的家庭采用捕获测序技术测序发现5个家庭中存在致病性突变，包括91个编码区突变，其中有17个突变为新发突变，其检出
率达到31%(5/16)。

Bonachea等[4]采用EC-HTS技术检测与二叶主动脉瓣有关
的95个基因，在78例患者中发现16例患者存在42个突变，数据经过分析过滤发现其中33个突变点是致病的，其检出率达到21%(16/78)。

国内尚未见EC-HTS技术检测TOF相关报道，本研究中选择G显带结果和基因芯片(CMA)结果正常的9例TOF胎儿进行靶向捕获测序，致病性突变检出率为33%(3/9)。

结果与Blue和Bonachea的研究[3-5]相比，该技术用于TOF遗传学检测显著提高了检
出率。

但由于本研究检测样本数目较少，这种较高检出率很可能受样本数量和先天性心脏病类型影响，后续仍需要大样本检测验证。

本研究发现的3个突变基因是CITED2、CHD7、NOTCH2。

CITED2基因突变可
引起TOF。

Liu等[8]在700例先天性心脏病患者中发现了1例室间隔缺损(ventricular septal defect, VSD)CITED2基因(p.S192_G193del)位点致病性杂合
突变。

本研究在胎儿1中发现了CITED2基因p.S192_G193del纯合突变，可能
是该胎儿的致病原因。

Legendre等[9]对40例CHARGE综合征患儿进行分析，
在1例患儿中检出了CHD7基因8号外显子上的杂合突变c.2550_2554del
(p.Lys850Asnfs*6)，本研究中CHD7基因c.2550_2554delGAGAA的杂合突变
导致p.K850Nfs*6移码突变可能是胎儿2的致病性突变。

NOTCH2基因为Alagille综合征(OMIM#610205)和Hajdu-Cheney综合征(OMIM#102500)相关基因，均可有心血管系统异常，c.4918T>C (p.F1640L)杂合突变目前尚无文献报道， MutationTaster软件预测结果提示该突变致病的可能性为99.99%，我们推测可能与胎儿先天性心脏病相关。

目前临床上对先天性心脏病的基因突变检测处于初始阶段，现有的先天性心脏病突变数据库容量仍然较小，在产前诊断时，对已报道的突变可以做出明确诊断，但是对于遇到未报道的或难以判断其致病性的突变位点，往往会陷入困境。

但随着EC-HTS技术用于先天性心脏病检测以及数据库的完善，该技术将会成为产前遗传学
诊断的主要手段之一[11]。

本研究结果表明EC-HTS技术用于TOF的遗传检测，
可一次性检测多个基因，相比于Sanger测序，具有通量高、速度快、经济的优点，亦可以提高突变检出率，为TOF的防治和遗传咨询、优生优育提供重要的依据，
具有较好的临床应用价值。

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