‘香菇135’培养基质中菌丝相对生物量的确定

‘香菇135’培养基质中菌丝相对生物量的确定
余昌霞;曹晖;陈明杰;汪虹
【摘要】Based on the established correlation standard curve between the 'Strain 135' mycelium biomass and the DNA content extracted from the
'Strain 135',effects of the culture medium and its background DNA content on the DNA extraction of the 'Strain 135' mycelia were analyzed,and subsequently the 'Strain 135' culture in triangular flasks and relative mycelium biomass of culture bags in different fruiting states were measured respectively, with the error range of measurement being estimated. The results showed that the later-stage mycelia in the flasks were about 21% of the culture weight,and by dry weight the mycelia collected from the culture bags in good,medium and poor fruiting states in Lishui,Zhejiang,accounted for 39%,50% and 61% of culture
weight,respectively.%在已构建‘香菇135'菌丝生物量与提取DNA量关联标准曲线的基础上,分析了香菇培养基质的DNA本底量和基质对‘香菇135,菌丝DNA 提取的影响,以此为基础测定了‘香菇135’三角瓶培养物和不同出菇状态的菌棒中的菌丝相对生物量,估算了测定的误差范围.结果表明:三角瓶中后期菌丝占培养物重量的21％左右,从丽水采集的出菇状态为好、中和差的香菇菌棒中菌丝分别占培养物重量的39％、50％和61％(以相对菌丝干重占培养物干重的百分比计).
【期刊名称】《上海农业学报》
【年(卷),期】2012(028)001
【总页数】4页(P26-29)
【关键词】‘香菇135';培养基质;生物量;测定
【作者】余昌霞;曹晖;陈明杰;汪虹
【作者单位】上海海洋大学食品学院,上海201306;国家食用菌工程技术研究中心,农业部应用真菌资源与利用重点开放实验室,上海市农业遗传育种重点开放实验室,上海市农业科学院食用菌研究所,上海201403;上海海洋大学食品学院,上海201306;上海海洋大学食品学院,上海201306;上海海洋大学食品学院,上海201306
【正文语种】中文
【中图分类】S646.1
一直以来，微生物生物量的确定都是一个难题，常用的方法包括直接计数法（如浊度法、血球板计数法等［1］）、通过检测固定体系中微生物的代谢活动推断其生物量（如氧气和二氧化碳的代谢消长［2］）和通过测定微生物体中某些特殊物质的含量推断其生物量（如几丁质、麦角固醇、嘌呤、氮、DNA和蛋白质等［3，4］）等都存在一些局限，尤其对那些不能进行纯培养的种类和不易与生长基质分离的微生物种类（如利用农业生产废弃物培养的各种食用菌），更是难以估计其生物量。

食用菌菌丝在生长过程中不断分解培养基质中的养料，进行一系列的代谢活动（如合成并分泌各种酶、吸收氧气、呼出二氧化碳等），最终达到自身物质和能量积累的目的，这个过程应该和基质中菌丝生物量的积累密切相关。

在各种食用菌的生理研究中，菌丝生物量的确定可为进一步研究其在基质中代谢生长情况提供基础。

培养基质中食用菌菌丝生物量的确定比较困难，一方面由于菌丝与培养基质的混合特性，无法对菌丝和基质进行分离；另一方面，食用菌培养基质成分复杂，含有一
些与菌丝相似的物质，对菌丝生物量的确定形成干扰。

目前，尚未有对食用菌培养基质相关成分对菌丝生物量确定影响的报道。

笔者在之前的工作中［5］已经确定在标准培养条件下，纯培养的‘香菇135’菌丝生物量与从中提取的DNA含量表现稳定的线性关系，这个标准曲线可以作为衡量在培养基质中生长的食用菌菌丝生物量的相对标准。

在此基础上，本研究进一步分析了‘香菇135’培养基质的DNA本底含量和基质对菌丝DNA提取的干扰，并对不同的‘香菇135’培养物
进行了生物量确定，探讨了定量过程中可能的误差范围。

1.1 材料
‘香菇135’菌种由上海市农业科学院食用菌研究所上海遗传育种重点实验室提供；不同出菇状态的‘香菇135’菌棒由浙江丽水农业科学院提供；‘香菇135’培养料配方：85%木屑（0.2～0.3 cm×0.5 cm）、15%麸皮，含水量为60%。

1.2 方法
1.2.1 ‘香菇135’标准培养菌丝制备
采用参考文献［5］中的方法。

1.2.2 ‘香菇135’菌丝培养物的制备
按‘香菇135’培养料配方取一定量的木屑浸泡过夜，沥水后与相应量的麸皮混合，调整含水量至60%，取120～130 g装入250 m L的三角瓶中，高压灭菌（121℃，1.5 h），冷却后接入经活化的‘香菇135’菌丝，置于恒温培养箱中，25℃培养。

1.2.3 ‘香菇135’培养料DNA本底量测定
按1.2.2的方法制备培养料，灭菌、冷却后于低温冰箱冷冻过夜，再放入冷冻干燥机中充分干燥。

取适量培养料充分研磨后，精确称取10、20 mg样品，提取
DNA［5］，每处理5个重复，确定单位质量培养料中DNA本底含量及测定的误差范围。

1.2.4 基质对‘香菇135’菌丝DNA提取的影响
将1.2.2制备的冻干标准培养‘香菇135’菌丝与冻干的‘香菇135’培养料按两种比例（40 mg菌丝＋160 mg培养料和60 mg菌丝＋140 mg培养料）混合，充分混匀并研磨后，分别精确称取10、20 mg混合物，提取DNA［5］，每处理5个重复，确定‘香菇135’培养料对‘香菇135’菌丝DNA提取的影响及误差范围。

1.2.5 不同生长阶段‘香菇135’菌丝培养物中菌丝相对生物量的确定
1.2.2中制备的‘香菇135’培养物18 d菌丝发满培养料时取样，之后每18 d收取1次样品，每次取适量培养物，－20℃冰箱冷冻过夜，转入冷冻干燥机内充分干燥，取出充分研磨后，准确称取10、20 mg冻干物，提取DNA［5］，每处理5个重复。

将测定结果对照文献［5］中的标准曲线、香菇培养基质的DNA本底量、基质对其中‘香菇135’菌丝DNA提取的影响，确定不同生长阶段‘香菇135’菌丝培养物中的菌丝相对生物量和测定的误差范围。

1.2.6 不同出菇状态的‘香菇135’菌棒中菌丝相对生物量的确定
从浙江丽水采集出完菇的菌棒，于2009年8月制得菌棒，2010年4月底完成出菇；分别取出菇较好、出菇一般及出菇较差的菌棒各1个，称量各菌棒的鲜重。

各菌棒由上至下选6个部位，分别切取适量样品，混匀，其他测定步骤和重复设置同1.2.5。

2.1 ‘香菇135’木屑常规培养基质DNA本底含量
通过检测所有样品DNA浓度，确定了‘香菇135’木屑培养基的DNA本底含量为（0.689±0.080）μg/mg，单点测定误差范围为3.16%～18.72%，平均误差为6.22%。

2.2 基质对‘香菇135’菌丝DNA提取的影响
‘香菇135’标准培养菌丝与培养基质按两种不同比例混合（菌丝量20%和30%），混合称取（10 mg和20 mg）的4个处理中菌丝含量的理论值分别为2、3、4、6 mg，通过检测其DNA量，再与标准曲线、基质本底的DNA含量比对，得出培养基质对‘香菇135’菌丝DNA提取的影响（表1）。

‘香菇135’培养基质对‘香菇135’菌丝DNA提取的影响率为0.030±0.032，测定的单点误差范围为0.02%～7.37%，平均误差为2.57%。

2.3 三角瓶中‘香菇135’培养物菌丝相对生物量的确定
在三角瓶中培养‘香菇135’菌丝，由于在54 d时取样出现异常，故对其未做测定。

测定的单点误差范围为0.44%～15.14%，平均误差为0.27%～5.88%（表2）。

‘香菇135’菌丝在接入培养料直到菌丝发满（18 d）过程中，菌丝生物量仅为（0.003±0.004）mg/mg，待培养至36 d时，菌丝的相对生物量增加至
（0.214±0.039）mg/mg，之后基本稳定在这一水平。

2.4 ‘香菇135’菌棒中菌丝相对生物量的确定
由表3可知，不同出菇状态的菌棒重量、含水量和香菇菌丝生物量相差较多，出
菇较好、一般和较差的菌棒中菌丝相对生物量分别为（0.387±0.040）、
（0.503±0.068）mg/mg和（0.609±0.048）mg/mg，综合其他数据推测菌棒
中剩余菌丝干重分别为（124.14±12.83）、（193.10±26.13）g和
（250.55±19.73）g。

这些数据显示出菇菌棒中剩余的菌丝量与子实体的产量为
反比关系，即出菇量越多剩余菌丝越少，单位量的基质中菌丝生物量也越少。

测量的单点误差范围为0.02%～14.96%，平均误差为0.43%～2.59%。

Bajracharya等［2］研究表明，DNA用来表征生物量要比几丁质等稳定，DNA
含量与总生物量之间在培养前期呈正相关，但由于其测定的时间较短，仅为80 h，没有定量跟踪报道培养基质中生物量的变化及相关成分对菌丝生物量的影响，且未
研究生物量与DNA含量的线性关系，使得培养基质中食用菌菌丝生物量的测定仍未得到有效解决。

由于食用菌菌丝培养基质大多是农作物废弃物，本身含有不同水平的核酸成分，培养基质的来源和配比不同，其DNA本底值不同，笔者在测定基质中食用菌菌丝的相对生物量之前，先测定相应基质的DNA本底含量及其对菌丝DNA提取的影响，尽可能排除基质对测定的干扰。

实测过程中的平均误差为0.27%～6.22%，说明
现有测定结果可以基本表示基质中的相对菌丝生物量水平。

在对三角瓶的‘香菇135’培养物菌丝相对生物量测定中发现，菌丝从接种到完
全长满培养料过程中，虽然培养料的表观改变非常明显，但基质中菌丝的相对生物量并不高（0.003 mg/mg左右），当培养到第36天时，培养料表观变化不明显
但菌丝生物量提高很大（0.214 mg/mg左右）。

实验室的培养过程中，没有合适的出菇条件，因此在其后直至90 d的培养过程中，菌丝的相对生物量基本稳定，表明‘香菇135’菌丝在后期可能稳定在某种生理状态，如果菌丝能从营养生长
转向生殖生长则可能改变这种稳定状态。

这种推测得到丽水出菇‘香菇135’菌
棒测定结果的支持，以相对菌丝干重占培养物干重的百分比计，三角瓶中后期菌丝占培养物重量的21%左右，而丽水出菇状态好、中、差的香菇菌棒中菌丝分别占
培养物重量的39%、50%和61%，推测是由于生殖生长的过程启动了菌丝对培养料的进一步分解利用，而不同出菇量对菌棒的总重、含水量和菌棒中残留菌丝量等数据间有着密切关系。

本研究是首次以确切的质量单位来表示基质中食用菌菌丝相对生物量的尝试，只是在以DNA含量的基础上对基质中食用菌菌丝生物量进行评价的初步试验，尽可能全面地评价菌丝生物量及生物量变化与食用菌的生长代谢规律的探索还需要更加深入和广泛的研究，这对进一步探讨食用菌菌丝营养生长阶段的生命代谢活动有重要意义。

【相关文献】
［1］阎博，赵林，谭欣，等.浊度法快速测定培养液中的生物量［J］.天津化工，2003，17（1）：45－46.
［2］Bajracharya R，Mudgett RE.Ef fects of controlled gas environments in solid-substrate fermentations of rice［J］.Biotechnol Bioeng，1980，22：2219－2235.
［3］Matcham SE，Jordan BR，Wood DA.Estimation of fungal biomass in a solid substrate by three independent methods［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1985，21：108－112.
［4］魏培莲，岑沛霖，盛春琦.3种固态发酵生物量测定方法的比较［J］.食品与生物技术学报2006，25（1）：60－64，69.
［5］余昌霞，曹晖，陈明杰，等.‘香菇135’菌丝生物量及其DNA含量标准曲线的构建［J］.食用菌学报，2010，17（3）：1－7.。