浙江省象山、奉化和枸杞岛常见石莼属绿藻的形态学研究和分子鉴定

浙江省象山、奉化和枸杞岛常见石莼属绿藻的形态学研究和分
子鉴定
高嵩;马家海;蔡永超;雎敏;陈斌斌;曾宴平;何培民
【摘要】石莼属绿藻在全国沿海广泛分布,浙江省是石莼属绿藻开发利用的大省,产品不但供应国内市场,而且远销海外.文章对浙江省象山、奉化内湾海区及舟山外海岛屿枸杞岛地区的常见石莼属绿藻进行了初步研究,对不同时间采集的样品,通过结合形态学观察和分子生物学的方法进行了种类鉴定.结果显示,象山、奉化地区在1月至3月间的优势种为Ulva prolifera,并伴随生长着少量Ulva linza,Ulva flexuosa 等绿藻.在舟山枸杞岛地区,Ulva pertusa 和 Ulva fasciata 较为常见.%Green algae Ulva grow widely along the coastline of China. Zhejiang Province is a major province which makes use of Ulva. Its products not only supply the domestic but also the international market. Common Ulva samples were collected from different locations in different times in 2011, including inner bay of Xiangshan, Fenghua and open sea island Gouqi. Identification was conducted by combining morphological observation and molecular biological methods. The results showed that dominant species in Xiangshan and Fenghua from January to March was Uiva prolifera, cohabitating with Ulva linza and Ulva flexuosa. However, in Gouqi Island Ulva pertusa and Ulva fasciata were more common.
【期刊名称】《浙江农业学报》
【年(卷),期】2012(024)006
【总页数】6页(P1009-1014)
【关键词】象山;奉化;枸杞岛;石莼属;形态学;分子鉴定
【作者】高嵩;马家海;蔡永超;雎敏;陈斌斌;曾宴平;何培民
【作者单位】上海海洋大学水产与生命学院,上海 201306;上海海洋大学水产与生命学院,上海 201306;上海海洋大学水产与生命学院,上海 201306;上海海洋大学
水产与生命学院,上海 201306;上海海洋大学水产与生命学院,上海 201306;上海海洋大学水产与生命学院,上海 201306;上海海洋大学水产与生命学院,上海 201306【正文语种】中文
【中图分类】S572
石莼属绿藻属于绿藻门，石莼目，石莼科，在全世界分布广泛，常见于潮间带岩石上或石沼中。

石莼属的许多种类对不同的盐度、温度、光照和外界营养物质含量都有很强的适应性［1-4］，它们具有繁殖方式多样和生长迅速的特点［5-7］，在
海况适宜的条件下能够短时间内快速增殖，从而引起严重的灾害［8-10］。

当然，石莼属绿藻也具有利用价值，其中的一些种类具有营养丰富、质薄、味美等特点，具有良好的食用以及保健价值。

我国多地的沿海居民经常采集这些食用或用作饲料的海藻类，既可鲜食，也可晒干贮存，还可腌食。

江浙、上海等地居民常把浒苔拌入面粉中制成苔条饼，闽南一带也会以浒苔作为春饼的调味剂，既可增色又具独特的清香。

我国医籍和民间经验认为，大型绿藻不仅具有丰富的营养价值，而且具有清热解毒、抗菌消炎、降胆固醇、增强机体免疫力、软坚散结、消肿利尿及化疾的功效。

目前对石莼属绿藻的开发利用已越来越多，在象山、奉化等地已逐步形成了一些绿藻加工产业，产品不仅可以供当地居民使用，而且出口到国外以满足国际市
场的需求。

但是，目前对这些地区石莼属绿藻的组成情况及其变化过程，以及浙江省外海岛屿绿藻资源的研究和调查还相对较少。

本研究通过形态学观察，结合ITS+5.8S rDNA 序列，并首次采用5S rDNA 间隔
区序列对浙江象山、奉化以及舟山枸杞岛不同时间的样品进行研究和鉴定，希望能对这些地区绿藻的种类有更进一步的了解，并为今后这些野生资源的开发和利用提供参考。

1 材料与方法
1.1 样品采集和处理
样品于2011年1月、3月、10月、11月分别采自象山、奉化及舟山枸杞岛地区的固着绿藻，所有野外采集的藻体就地清洗后冷藏保存，并于24 h 内带回实验室。

挑选实验用藻体分别于不同的500 mL 三角烧瓶中进行充气培养。

培养条件为:温
度15～20℃，海水盐度26.9，光照强度100～160 μmol·m-2·s-1)，光照周期12∶ 12(L∶D)，PES 营养液浓度为2%。

培养48 h 后进行形态学观察。

对藻体形态特征的观察参考曾呈奎［11］和Yoshida［12］，主要标准为:(1)藻体宏观形态，包括分枝情况;(2)细胞形状及排列;(3)藻体切面观;(4)细胞内色素体分布;(5)细胞中淀粉核数目。

1.2 DNA 制备及目标序列获取
DNA 制备方法参照Doyle 等［13］，并有所改动:称取0.1 g 藻体，液氮研磨成
粉末，转移到离心管中。

加入1 mL CTAB 提取缓冲液(3%CTAB，0.1 mol·L-1 Tris-HCl pH 8.0，0.05 mol·L-1 EDTA pH 8.0，1.4 mol·L-1 NaCl，0.2% β-巯
基乙醇)，65℃温浴1 h 后，加入1/3 体积5 mol-1·LKAc，充分混匀，然后加入
等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，摇匀后，12 000 r·min-1 离心15 min。

将上清液转移至新管，加入2/3 体积异丙醇，将DNA 沉降下来，用70%乙醇洗涤1～2 次后，在无菌风下吹干，溶于1 ×TE 溶液中。

两个目标序列的扩增参考Hayden 等［14］和Shimada 等［15］。

PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后，通过紫外光检测。

引物合成、扩增产物纯
化及测序由上海迈普生物技术有限公司完成。

表1 样品信息Table 1 Sampling information
1.3 数据分析
采用Bioedit［16］和ClustalX (Ver 1.83)［17］分别对样品ITS+5.8S rDNA 序列及5S rDNA 间隔区序列进行编辑和对齐。

同源性通过NCBI 进行BLAST 检测，获取序列均来自GenBank，系统发育树构建采用邻接法，采用Kimura 双参数模型，使用软件为MEGA 4.1，参考Tamura 等［18］的方法，自举检验值1 000
次检验节点置信度。

2 结果与分析
2.1 形态学观察结果
本研究观察了实验样品所具有的典型形态特征，见图1。

U.prolifera 在宏观形态
上具有一定差异性，主要为细长具分枝的丝状藻体。

研究中所采用的样品藻体在分枝频度上，分枝出现的位置上都不尽相同。

在显微形态上，基部细胞往往纵向排列，中部细胞主要为不规则的多边形，一般具有一个明显的淀粉核，色素体充满。

U.linza 藻体为片状，膜质，无分枝，横切面观为中间部位两层细胞、边缘部中空
的结构，细胞内含淀粉核1～2个。

Ulva sp.分枝频度不一，藻体各部位均可能出
现分枝。

细胞形态不规则且含有2～4个淀粉核，在基部为纵向排列，色素体呈环状排列沿细胞壁分布。

U.pertusa和U.fasciata 都具有双层的细胞结构，其中
U.pertusa 为宽广的叶片状，并有不规则的孔洞，细胞呈圆角纵长方形，淀粉核数量并无明确记录;而U.fasciata 为披针或线性叶片状，叶片分叉，细胞多为多角形，淀粉核1～2个，这些特征与以往的记录相似［11，12］。

这两种石莼形态有较
大差异，较易区别。

2.2 系统发育分析
2.2.1 ITS 系统发育分析
以ITS+5.8S rDNA 序列构建的N-J 系统发育树见图2。

23个样品一共被分到了5个进化枝，分别是LPP(Ulva linza-procera-prolifera)，U.flexuosa，U.fasciata，U.pertusa和Ulva sp.。

其中最大的进化枝包含了14个样品，Bootstrap 值为100，为LPP 分枝。

1月和3月采自象山和奉化的样品中，绝大多数都聚于此枝。

除一个样品(XS-2)略有差异外，其他样品序列相似性为100%。

3月于奉化采集的样品中，有一个样品(FH-6)被归为U.flexuosa 分枝，Bootstrap 值为100。

11月采集于象山的5 样品全都聚为一个分枝，为Ulva sp.分枝，Bootstrap 值为100。

在枸杞岛采集的样品中，分别各有4个样品被归入U.fasciata，3个样品归入
U.pertusa，Bootstrap 值分别为99和100。

图1 藻体形态图Fig.1 1 Morphology graphs of U.prolifera，U.linza，Ulva sp.，U.fasciata and U.pertusa①，U.prolifera 藻体分枝表面观;②，U.prolifera 横切
面观;③，U.prolifera 藻体表面观(示细胞形态，淀粉核);④，U.linza 藻体形态;⑤，U.linza 藻体横切面观;⑥，U.linza 藻体表面观(示细胞形态，淀粉核);⑦，Ulva sp.藻体形态;⑧，Ulva sp.藻体横切面观;⑨，Ulva sp.藻体表面观(示细胞形态，淀粉核);○10，U.fasciata 藻体形态;○1，U.fasciata 藻体横切面观;○12，U.fasciata 藻
体表面观(示细胞形态);○13，U.pertusa 藻体形态;○14，U.pertusa 藻体横切面观;○15，U.pertusa 藻体表面观(示细胞形态);(④，⑦，○10，○13图中标尺为1 cm;②，③，⑥，⑧，⑨，○12，○15图中标尺为10 μm;①，⑤，○1，○15图中
标尺为50 μm)
图2 基于ITS+5.8S rDNA 构建的N-J 系统发育树Fig.2 N-J phylogenetic tree based on ITS+5.8S rDNA sequence analysis
图3 LPP 类群基于5S rDNA 间隔区序列构建的N-J 系统发育树Fig.3 N-J
phylogenetic tree based on 5S rDNA spacer sequence analysis of LPP clade 2.2.2 5S 系统发育分析
通过对LPP类群样品的5S rDNA 间隔区序列分析构建系统发育树，见图3。

13个样品聚类为两个进化枝，分别是U.prolifera和U.linza。

不论是采自奉化还是象山的样品中，绝大部分都被鉴定为U.prolifera，仅有一个样品(FH-3)为U.linza，Bootstrap 值为99。

3 讨论
石莼属绿藻是一种在世界范围内广泛分布的海藻，在我国沿海地区也广泛分布。

浙江地区作为目前对这类海藻开发利用较多的地区，具有丰富的石莼属绿藻资源。

本研究中，象山和奉化内湾海区样品经ITS +5.8S rDNA 序列分析后显示，分别为LPP 类群、U.flexuosa 及Ulva sp.。

由于LPP 类群各个种类的亲缘性较近，从而使得对这一类群内种类的鉴定存在一定困难，本研究通过采用5S rDNA 间隔区这一变异性比ITS 序列高的分子标记［15］，将这一类群的种类进一步鉴定为
U.prolifera和U.linza，结合样品所占比例和藻体形态，这两地石莼属绿藻中，优势种是U.prolifera。

通过样品采集的时间可知，在11月绿藻刚开始出现的时候主要种类为Ulva sp.，这些绿藻虽然外部形态与U.prolifera 较为相似，但藻体细胞中普遍具有3个以上的淀粉核，这与本研究中其他的U.prolifera(大多只具有1个淀粉核)有较大差异。

对比样品采集时间与样品的鉴定结果可知，在1月至3月期间，U.prolifera 作为优势种类大量生长，其中还夹杂有少量U.linza和
U.flexuosa。

在靠近外海的枸杞岛附近，石莼类绿藻资源也十分丰富，经过研究后发现，10月下旬，在近岸地区尚未见到固着绿藻生长的时候，该岛上已经生长了许多绿藻，而且体现了完全不同的种类构成，其组成种类以U.pertusa和U.fasciata 为主，这也暗示了远离陆地的岛屿在绿藻种类上与近岸沿海地区具有较大的差异性。

希望在
基于更广泛而深入的调查研究后，可以对这些资源进行因时制宜、因地制宜地开发利用。

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