4.1.1 限制性内切酶

限制性内切酶
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E. coli K
E. coli C EOP=1
EOP=1
EOP=1EOP=10-4
E.coli K E.coli B E.coli C
λC
1
1
1
10-4
10-4
10-4
10-4
1
1
λK λB
1963年以来，Arber及其同事发现 ，经同位素标记证明，噬菌体在新品系中的损害伴随着其DNA的降解，但宿主自身的DNA不被降解。

Arber的解释：通过噬菌体感染进入细菌细胞的DNA分
子能被细菌识别而分解，细菌本身的DNA则由于已被自己所修饰而免于被分解。

1965 年，Arber预言有限制性内切酶的存在
发现
1968年Messelson首次从E.coli K中分离限制性内切酶 Eco K
①需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等
②有特定的识别位点 ，但没有特定的切割位点
③切割位点远离识别位点1000bp以上
1970年 美国约翰·霍布金斯大学 H.Smith 偶然发现 流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae） 细胞提取液能迅速降解外源的噬菌体DNA ，但不能降解自身DNA ，这就是Hin dII酶。

Nathans等人立即查明了限制内切酶的有效性，并将其用来分析 DNA 的结构。

1978 H.Smith， W Arber和D Nathans由于限制性内切酶发现和应用的研究得到诺贝尔奖。

命名
限制酶的命名最初由Smith和Nathans于1973年提出，1980年再由Roberts进行系统化和分类，人们今天使用的就是这个体系的一个简化版。

1、来源菌属名的首字母和其种名的头两个字母形成的三个字母缩写来表示。

2、用一个字母表示菌株或类型。

3、用罗马字母表示不同的限制与修饰体系。

如Eco RI（Escherichia coli ）
种类
根据限制酶识别切割特性，催化条件，及是否有修饰酶活性分三类(I, II ,III) 。

也有分四类，IIs类，即II 亚类。

type Ⅰ（数量少，约占1%）
特点：
（1）属复合酶类，兼具修饰和切割DNA两种特性。

（2）需要Mg2+ 、 ATP和S-腺苷酰甲硫氨酸（SAM）作为催化的辅助因子，在 DNA降解时伴随着ATP的水解。

（3）识别点和切割点不一致，没有固定的切割位点，一般在识别位点以外的1Kb 或几 Kb处切割DNA。

typeⅡ（数量多，约占93%）
特点：
（1）II型酶限制修饰系统分别由限制酶和修饰酶两种不同的酶组成。

（2）II型酶需Mg2+作为催化的辅助因子，相应的修饰酶需S-腺苷酰甲硫氨酸
（SAM）。

（3）识别序列主要为4-6bp，识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割。

回文序列：
GAATTC
CTTAAG
typeⅢ（数量少，约占小于1%）
特点：
（1）与I型限制酶特性类似，也具有甲基化功能，但没有ATP酶和DNA解旋酶活性。

（2）能在DNA链上的特异位点切割DNA，其切割位点在识别位点以外。

如Eco P1 Eco P15
识别 AGACC CAGCAG
切割 下游 24-26bp处
type IIs 占5%
特点：识别位点非对称, 非间断 4-7bp 切割位点可能在20bp范围内。

识别序列（recognition sequences）
1、长度
大部分的Ⅱ型限制性内切酶识别一个4-8个碱基的回文序列4：Sau3AI GATC
5：Eco RII CCWGG W=A or T
Nci I CC SGG S=C or G
6：Eco RI GAATTC
Hin dIII AAGCTT
>6
Not I GCGGCCGC 8
Bbv CI CCTCAGC 7
Ppu MI RGGWCCY 7 R=A or G
R=A or G Y=C or T M=A or C K=G or T
S=C or G W=A or T
H=A or C or T B=C or G or T V=A or C or G D=A or G or T N=A or C or G or T
4Nt=44=256
6Nt=46=4096
2、结构
① 回文对称
Eco RI GAATTC CTTAAG Hin dIII AAGCTT TTCGAA
②多识别序列（兼并序列）Acc I GTMKAC
Hin dII GTYRAC
R=A or G K=G or T
M=A or C Y=C or T
③间断对称
Alw NI CAG NNN CTG Dde I CT N AG
3、切割位置
①内部（大多数）Eco RI GAATTC CTTAAG Hin dIII AAGCTT TTCGAA
② 两端
Eco RII CCWGG Sau3AI GATC Nla III CATG
③ 两侧
Bcg I
(10/12)CGA(N)6TGC(12/10) (N)CGA(N)6TGC(N)12
10
(N)GCT(N)6 ACG(N)10
12
限制性内切酶产生的末端
1、匹配粘端（粘性末端） Cohesive terminus (end)
① 在对称轴5’侧切割底物
DNA双链交错断开→5’protruding
Eco RI …NNGAATTCNN…
…NNCTTAAGNN…
…NNG AATTCNN…
…NNCTTAA GNN…
② 3’-侧→3’突出末端 5‘ recessed Kpn I GGTACC
CCATGG
2.平端 Blunt end
在对称轴上同时切割DNA的两条链 Hae III GG↓CC
Eco RV GAT↓ATC
Xmn I GAANN↓NNTTC
3.同裂酶(isoschizomer)
识别相同序列的限制酶称同裂酶 ① 同序同切
Hin dII Hin cII GTY/RAC Mob I Sau3AI /GATC
② 同序异切
Kpn I GGTAC/C
Acc65I G/GTACC
Aat II GACGT/C
Bsa HI GR/CGYC
③其它
Sal I G/TCGAC Acc I GT/MKAC Hin cII GTY/RAC
4、同尾酶Eco RI GAATTC
Mfe I CAATTG
Apo I RAATTY
Spe I Nhe I Xba I Sty I ACTAGT GCTAGC TCTAGA CCWWGG
Bam HI GGATCC Sau3AI GATC Bst BI TTCGAA Taq I TCGA
末端长度对切割的影响
1、寡核苷酸
2hr 20hr Hin dIII C AAGCTT G 0 0
CC AAGCTT GG 0 0
CCC AAGCTT GGG 10% 75% Eco RI G GAATTC C >90 >90
Pst I
G CTGCAG C 0 0 TGCA CTGCAG TGCA 10 10 AA CTGCAG(N) 14 >90 >90
CTGCAG(N) 20 0 0
2、DNA片段（线性载体）
...CTCGAG GAATTC CTGCAG......GAGCTC CTTAAG GACGTC... Xho I Eco RI Pst I
Eco RI initial cut L1TMUS29 cleavage efficiency Xho I 97% 1 base Pst I 37% 1 base
...CTCGAG G AATTC CTGCAG......GAGCTC CTTAA G GACGTC... Xho I Pst I
Eco RI initial cut L1TMUS29 cleavage efficiency Xho I 97% 1 base Pst I 37% 1 base
...CTCGAG G AATTC CTGCAG......GAGCTC CTTAA G GACGTC... Xho I Pst I
Eco RI initial cut L1TMUS29 cleavage efficiency Xho I 97% 1 base Pst I 37% 1 base
...CTCGAG G AATTC CTGCAG......GAGCTC CTTAA G GACGTC... Xho I Pst I
Eco RI initial cut L1TMUS29 cleavage efficiency Xho I 97% 1 base Pst I 37% 1 base
Eco RI initial cut L1TMUS29 cleavage efficiency Xho I 97% 1 base Pst I 37% 1 base
...C TCGAG GAATTC CTGCA G... ...GAGCT C CTTAAG G ACGTC...
Xho I Eco RI Pst I
Xho I : 1 Eco RI 100%
Pst I : 1 Eco RI 88%
在双酶切多克隆位点时，选酶切秩序
在设计引物引入酶切位点时, 应在位点之外引入所要求的碱
基数。

双酶切策略
a.选用都合适的Buffer or KGB
b. 不可替代：先低，加适量NaCl和第二 种酶
c. 先低后高（可纯化或不纯化）
注意事项
a. 取少量酶 (方法 or 稀释 )
b. 最后加酶、尽快操作
c. 减少反应体积
d. 反应时间的延长
e. 分装（对于多个反应）
大多数为37℃
一部分为50-65℃ 少数25-30℃
高温作用酶于37℃时活性多数10-50% Taq I (65℃) 10% , Apo I(50℃)50% Sma I (25℃) 37℃ half life 15min
1hr or more
许多酶延长其反应时间可减少酶的用量 16hr
Eco RI 0.13 (1/8)
Hin dIII (1/8)
Kpn I(1/4)
Bam HI(1/2)
1. EDTA 终10mM
2. 加热
37℃ 酶 65℃ 20min
otherwise 80℃ 20min
在80℃ 20min不失活的酶
37℃：Bg1II Hpa I Pvu II
65℃：Tth111I Tsp RI
50℃：Bc1I
星活性（ star activity ）
1、概念：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。

实际上星星活性是限制内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。

2、 酶的特异性变化方式
与酶的种类和所应用的条件有关
最普遍的活性变化 ：1个碱基的变化
识别位点外层碱基的随意性以及单链缺口
Eco RI的研究表明 :
pH的升高和离子强度的降低 可切割
N/AATTN
切割只有一个碱基不同的序列(但这个变化的碱基在中央序列 AATT中不是A到T 或T至A的变化)
3. 引起星星活性的因素
① 高浓度甘油（>5%）
② 酶过量（>100U/ g）
③ 低离子强度（<25mM）
④ 高pH (>pH8.0)
⑤ 有机溶剂
PMSD(二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）、sulphalane
⑥ 用其它二价阳离子代替Mg++
Mn++，Cu++，Co++, Zn++
不同的酶对上述条件的敏感性不一样Pst I比Eco RI对高pH更敏感
但后者对甘油浓度更敏感
4. 抑制星星活性的条件（措施）
① 减少酶的用量，避免过量酶切,减 少甘油浓度
② 保证反应体系中无有机溶剂或乙醇
③ 提高离子强度到100～150mM (如果不会抑制的话)
④ 降低反应pH至pH7.0
⑤ 使用Mg++作为二价阳离子。