长梗喉毛花中3种化合物抗烟草花叶病毒活性分析及其对4种防御酶活性的影响

南方农业学报　Journal of Southern Agriculture　2023，54（12）：3591-3598
ISSN 2095-1191； CODEN NNXAAB
DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.12.013
长梗喉毛花中3种化合物抗烟草花叶病毒活性
分析及其对4种防御酶活性的影响
程林1，2，李卫1，刘逸婷1，刘真1，陈永对2*，李干鹏1*
（1云南民族大学民族医药学院/民族药资源化学国家民委—教育部重点实验室，云南昆明650500；2云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所/云南省农业生物技术重点实验室/农业农村部西南农作物基因资源与种质创制重点实验室，云南昆明650205）
摘要：【目的】评价从长梗喉毛花［Comastoma pedunlulatum （Royle ex D. Don） Holub］中分离得到的3种化合物的抗烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）活性及其对烟草4种防御酶活性的影响，为研发有效防治TMV的植物源农药提供先导化合物和理论依据。

【方法】以心叶烟为试验材料，设化合物处理（当药黄素、高杯喉毛花内酯A和异荭草素）、空白对照（CK）和药剂对照（8%宁南霉素）处理，采用半叶枯斑法测定化合物对TMV侵染的预防保护和钝化作用；以普通烟草栽培品种K326为试验材料，设对照［空白对照（CK）和接种对照（CK+TMV）］、宁南霉素［药剂对照（PC）］、当药黄素、高杯喉毛花内酯A和异荭草素处理，利用防御酶检测试剂盒测定各处理烟草叶片中多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性。

【结果】先施用被试物后接种TMV，当药黄素、高杯喉毛花内酯A和异荭草素在100 μg/mL时均减少TMV在心叶烟上的枯斑数目，对TMV的抑制率分别为50.05%、57.55%和61.73%，对TMV侵染均具有一定的预防保护作用，对照药剂宁南霉素对TMV的抑制率为
47.75%；TMV与被试物溶液混合接种心叶烟时，当药黄素和高杯喉毛花内酯A对TMV的抑制率分别为51.65%和
45.66%，对TMV侵染有较好的钝化作用。

分别施用当药黄素、高杯喉毛花内酯A和异荭草素后，烟草叶片防御酶PPO
活性分别在处理后24、12和24 h达最大值；PAL活性均在处理后72 h达最大值；POD活性分别在处理后24、48和72 h 达最大值。

PPO、PAL和POD活性在最大值时与CK均呈显著差异（P<0.05），而SOD活性在最大值时与CK无显著差异（P>0.05）。

【结论】分离自长梗喉毛花的3种化合物当药黄素、高杯喉毛花内酯A和异荭草素使用浓度为100 μg/mL时对TMV均有较好的预防保护活性，具有作为抗TMV植物源农药或先导化合物的潜力。

关键词：长梗喉毛花；黄酮类；裂环环烯醚萜苷类；烟草花叶病毒；防御酶活性
中图分类号：S435.72 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2023）12-3591-08
Effects of three compounds from Comastoma pedunlulatum
（Royle ex D. Don） Holub on the resistance to tobacco mosaic virus and activities of four defense enzymes in tobacco
CHENG Lin1，2， LI Wei1， LIU Yi-ting1， LIU Zhen1， CHEN Yong-dui2*， LI Gan-peng1*（1School of Ethnic Medicine， Yunnan Minzu University/Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources，
State Ethnic Affairs Commission & Ministry of Education， Kunming， Yunnan 650500， China；2Biotechnology and
Germplasm Resources Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Provincial Key Laboratory of Agricul‐tural Biotechnology/Key Lab of Southwestern Crop Gene Resource and Germplasm Innovation， Ministry of Agriculture
and Rural Affairs， Kunming， Yunnan 650205， China）
Abstract:【Objective】To evaluate the anti-tobacco mosaic virus （TMV） activity of three compounds isolated from
收稿日期：2023-10-11
基金项目：国家自然科学基金项目（31860498，31860100）；云南省“兴滇英才支持计划”产业创新人才项目（XDYC-CYCX-2022-0065）
通讯作者：陈永对（1976-），https:///0000-0003-3657-6143，博士，研究员，主要从事抗病毒天然产物筛选及其作用机制研究工作，E-mail：*******************；李干鹏（1972-），https:///0000-0001-8902-9034，博士，教授，主要从事天然药物化学及现代有机分析技术研究工作，E-mail：*******************
第一作者：程林（1997-），https:///0000-0002-0557-2054，研究方向为天然药物化学及现代有机分析技术，E-mail：cl199777@
54卷
南方农业学报
Comastoma pedunlulatum（Royle ex D. Don） Holub and their effects on the activity of four tobacco defense enzymes，which could provide lead compounds and theoretical basis for the research and development of effective control of TMV plant pesticides. 【Method】Nicotiana glutinosa was used as the materials，there were three groups，which were com‐pounds treatment group （swertisin， comtraide A and isoorientin）， negative control （CK） and positive control （8% ning‐nanmycin）. The protective and inactivation effects of the compounds on TMV infection were determined by half-leaf method. Using tobacco cultivar K326 as the materials， control group［negative control （CK） and TMV-inoculated control （CK+TMV）］， ningnanmycin treatment group ［positive control（PC）］ and swertisin， comtraide A and isoorientin treat‐ment were set. The activities of polyphenol oxidase （PPO）， phenylalanine ammonlyase （PAL）， superoxide dismutase （SOD） and peroxidase （POD） in tobacco leaves were determined by defense enzyme detection kit. 【Result】Swertisin，comtraide A and isoorientin could reduce the lesion numbers of TMV on N. glutinosa plants when the tobacco leaves were first applied with compounds at 100 μg/mL and then inoculated with TMV， showing good protective effects against TMV infection， with the inhibition rates of 50.05%， 57.55% and 61.73%， respectively， whereas the inhibition rate of ningnan‐micin against TMV was only 47.75%. When the TMV were mixed with compounds and then inoculated the plant leaves，swertisin and comtraide A also had good inactivation effects against TMV，whose inhibition rates were 51.65% and 45.66%， respectively. After application of swertisin， comtraide A and isoorientin， the maximum activities of defense en‐zymes PPO were reached after 24， 12 and 24 h， respectively； the maximum activities of PAL were reached after 72 h；
the maximum activities of defense enzymes POD were reached after 24， 48 and 72 h， respectively. The activities of PPO，PAL and POD were significantly different from those of CK at the maximum value（P<0.05）， while the activities of SOD were not significantly different from those of CK group（P>0.05）. 【Conclusion】Swertisin， comtraide A and isoorientin extracted from C. pedunlulatum show good protective activity against TMV when the concentration is 100 μg/mL， and they have the potential as biological pesticides or lead compounds against TMV.
Key words: Comastoma pedunlulatum （Royle ex D. Don） Holub； flavonoids； secoiridoid glycoside； tobacco mo‐
saic virus； defense enzyme activity
Foundation items: National Natural Science Foundation of China （31860498，31860100）； Industrial Innovation Talent Project of “Yunnan Revitalization Talent Support Project”（XDYC-CYCX-2022-0065）
0　引言
【研究意义】烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）为单链RNA病毒，属于烟草花叶病毒属（Tobamovirus），其寄主广泛，能侵染十字花科、豆科、菊科和藜科等65科800多种植物，给农业生产带来严重威胁（Guo et al.，2020）。

然而，由于TMV的复制和增殖均对寄主有绝对寄生性，化学抗病毒药剂在对TMV杀灭的同时也会对寄主植物产生较大毒性，常规化学药剂很难完全控制TMV的发生和发展（Zhao et al.，2017a，2017b），当前尚无理想的药剂防控TMV。

目前，大多数化学农药防控TMV的效果不理想，且化学农药的过度施用会引起严重的生态与环境问题（郭文慧等，2020）。

同时，植物在长期进化过程中已产生大量的次生代谢物来抵抗病原菌和害虫的侵害（Othman et al.，2019）。

近年来，植物源天然产物因其无公害、无污染及无残留等优点而成为防控TMV农药研发的热点，具有广阔的应用前景（Zhang et al.，2017）。

因此，从植物中寻找抗TMV 活性物质具有重要的现实意义。

【前人研究进展】目前，植物源抗病毒剂的研发已取得一定进展，已发现30多种植物含有抑制植物病毒的物质（金林红等，2003），其中包括酚类、原花青苷、皂角苷、多聚糖、有机酸、蛋白、多肽以及精油等天然物质可能具有抗病毒活性（余武秀和申继忠，2021）。

已在市场应用的植物源抗病毒剂种类主要有多糖类（壳寡糖和香菇多糖水剂）、免疫激活蛋白类（超敏蛋白微颗粒剂）、酚类（丁香酚微胶囊制剂）、甾醇类（0.06%甾烯醇微乳剂）和生物碱类（Antofine乳剂）（吴剑和宋宝安，2016；王俊苹，2018）等。

在抗TMV天然产物筛选研究方面已开展了许多工作，发现了一些抗TMV的活性化合物，如双吡唑席夫碱、乌头生物碱和3-丙酮基-3-羟基羟吲哚（3-acetonyl-3-hydroxyoxindole，AHO）等（蹇军友等，2017；Lü et al.，2017；Shen and Hao，2020），也应用天然产物AHO和壳寡糖席夫碱纳米银溶液在大田防控烟草花叶病毒病和番茄斑萎病毒属（Tospovirus）病毒病（陈永对等，2013，2014；孙翠红等， 2016）。

在抗病毒机制研究方面，不同的天然产物发挥抗病毒活性的机制不同。

如，AHO通过激活特异的miRNAs和PR10基因表达诱导烟草的系统获得性抗性（Systemic acquired resistance，SAR）抵御番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）侵染（Chen et al.，2017）。

从肿柄菊中提取的倍半萜类化合物Tagitinin C和1β-methoxydiversifolin-3-0-methyl ether则是通过抑制TMV的CP基因和RdRp 基因的复制阻止TMV侵染（Zhao et al.，2017a）。

长梗喉毛花［Comastoma pedunlulatum （Royle ex D. Don） Holub］为龙胆科喉毛花属植物，有研究发现其
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12期程林等：长梗喉毛花中3种化合物抗烟草花叶病毒活性分析及其对4种防御酶活性的影响
含有大量口山酮及苷类、黄酮类和环烯醚萜类成分（袁怡，2010；袁怡等，2010；Hu et al.，2015；Li et al.，2020），推测具有保肝活性，而其中有5个口山酮化合物具有一定的抗TMV活性（Hu et al.，2015； Li et al.，2020），但该属植物中其他抗TMV活性化合物的研究仍相对缺乏。

【本研究切入点】虽然植物源农药越来越受到关注，但相对于抗病毒天然产物的需求，这些植物源化合物的发现还远远不够。

本研究团队前期从长梗喉毛花中分离得到2种黄酮类和1种裂环环烯醚萜苷类化合物（刘真等，2021），但其是否具有抗TMV活性尚不得而知。

【拟解决的关键问题】采用半叶枯斑法对前期从长梗喉毛花中分离得到的3种化合物（2种黄酮类和1种裂环环烯醚萜苷类）进行抗TMV活性测定，并用植物防御酶活性检测试剂盒测定3种化合物对烟草防御酶活性的影响，通过化合物在预防试验和钝化试验中的抗TMV活性评价，为研发有效防治烟草病毒病害的植物源农药提供先导化合物和理论依据。

1　材料与方法
1.1　试验材料
普通烟草栽培品种K326和心叶烟种子由云南省烟草农业科学研究院提供，在云南省作物病毒研究与应用创新团队实验室（以下简称本实验室）育苗并在无虫网室中培养，待烟草生长至5~6叶期用于试验。

TMV（U1普通株系）由本实验室保存，将其接种于普通烟K326上，利用PEG沉淀法提纯病毒，测定病毒浓度并于-20 ℃下保存。

供试化合物（当药黄素、高杯喉毛花内酯A和异荭草素）由云南民族大学民族医药学院李干鹏教授提供，溶于二甲基亚砜（DMSO），浓度为10 mg/mL，使用时再用无菌水稀释至所需浓度。

8%宁南霉素购自德强生物股份有限公司，使用浓度为80 μg/mL。

1.2　试验方法
1.2.1　化合物对TMV侵染的预防保护作用　选取健康且生长良好的5~6叶期心叶烟，在暗室放置1夜。

每棵烟苗挑选水平位置相同的3~4张叶片，每处理10张叶片。

将每张叶片的右半部分均匀涂抹100 μg/mL的化合物100 μL（打孔做标记），左半部分涂抹100 μL含相同DMSO浓度的蒸馏水（阳性对照），涂抹量以叶面全部浸湿而不下滴为准。

4 h后将整张叶片均匀摩擦接种50 μg/mL的TMV 200 μL。

以8%宁南霉素水剂1000倍液为对照药剂处理。

接种病毒5 d后观察叶片的发病症状，并分别统计左右叶片的枯斑数，根据叶片上的枯斑数计算枯斑抑制
率。

试验重复3次。

化合物对TMV侵染的抑制率（%）=（阳性对照枯斑数-化合物处理枯斑数）/阳性对照枯斑数×100。

1.2.2　化合物对TMV侵染的钝化作用　选取健康且生长良好的心叶烟，在暗室放置1夜。

每棵烟苗挑选水平位置相同的3~4张叶片，每处理10张叶片。

将每张叶片左半部分摩擦接种50 μg/mL的TMV，右半部分摩擦接种含有100 μg/mL化合物和50 μg/mL TMV的混合液，以80 μg/mL 8%宁南霉素水剂和50 μg/mL TMV混合液为对照药剂处理。

15 min后用无菌水冲洗干净。

试验重复3次。

接种烟草的养护、叶片枯斑数统计及枯斑抑制率计算方法同1.2.1。

1.3　植物防御酶活性测定
1.3.1　化合物处理　选取健康且生长良好的5~6叶期K326烟苗，在暗室放置1夜，设对照［空白对照（CK）和接种对照（CK+TMV）］、8%宁南霉素［药剂对照（PC）］、当药黄素、高杯喉毛花内酯A和异荭草素6个处理。

挑选烟苗第3和4片叶涂抹100 μg/mL 化合物或接种50 μg/mL TMV，分别于接种后0、12、24、48、72和96 h用打孔器取相同部位叶片，每处理随机选取3株，3张叶片约0.1 g，3次重复，液氮速冻后于-80 ℃条件下保存。

1.3.2 粗酶液提取烟草叶片样品放入预冷研钵中，液氮冷冻研磨成粉末。

按1∶9 （w/v）加入组织提取液［生理盐水或0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.2，含1%聚乙烯吡咯烷酮）］，充分振荡混匀后于4 ℃下10000 r/min离心10 min，取上清液分装待测。

1.3.3 防御酶活性测定采用苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）试剂盒（南京建成生物工程研究所）进行测定。

PAL活性定义：每克组织在每毫升反应体系中每分钟使290 nm处吸光度值变化0.1为1个酶活力单位（U/g）；PPO活性定义：每分钟每克组织在每毫升反应体系中使420 nm处吸光度值变化0.01为1个酶活力单位（U/g）；SOD活性定义：每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个SOD活力单位（U/mg）；POD 活性定义：在37 ℃条件下每毫克组织蛋白每分钟催化产生1 μg底物的酶量定义为1个酶活力单位（U/mg）。

1.4　统计分析
采用SPSS 20.0和Excel 2010进行数据统计分析与制图，统计学数据分析以3次重复的平均值±标准误差（SE）表示。

采用ANOV A对数据进行方差分析，LSD Duncan’s进行多重比较。

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54卷
南 方 农 业 学 报2　结果与分析
2.1　化合物对TMV 在心叶烟上症状形成的影响
TMV 侵染心叶烟可导致叶片出现枯斑。

当3种化合物分别处理心叶烟叶片后接种TMV ，5 d 后叶片上均表现典型的枯斑症状（图1），其中化合物处理枯斑数显著少于阳性对照处理（P <0.05，下同），结果表明3种化合物能延缓TMV 在心叶烟上症状的形成，且3种化合物对TMV 的抑制效果优于对照药剂8%宁南霉素（表1）。

2.2　化合物在心叶烟上的枯斑抑制活性
由表2可知，采用先涂抹化合物再接种TMV 方式时，当药黄素、高杯喉毛花内酯A 和异荭草素对TMV 的平均抑制率分别为50.05%、57.55%和61.73%，而对照药剂8%宁南霉素处理对TMV 的平均抑制率只有47.75%，3种化合物对TMV 的预防保护效果均高于8%宁南霉素。

采用将化合物与TMV 混合接种心叶烟方式时，当药黄素和高杯喉毛花内酯A 对TMV 的平均抑制率分别为51.65%和45.66%，而8%宁南霉素处理对TMV 的平均抑制率为42.31%，表明这2种化合物对TMV 的钝化效果均显著高于对照药剂8%宁南霉素。

异荭草素对TMV 的平均抑制率为12.85%，抑制效果显著低于8%宁南霉素。

可见，化合物的不同接种方式对TMV 有不同的抑制效果。

2.3　化合物对烟叶PPO 活性的影响
由图2可知，烟草叶片内PPO 活性在3种化合物处理后0~96 h 内均呈先升高后降低的变化趋势，其中当药黄素和异荭草素处理的PPO 活性在处理后24 h 最高，分别为0.91和1.00 U/g ，而高杯喉毛花内酯A 处理的PPO 活性在处理后12 h 最高，为0.90 U/g 。

PPO 活性在当药黄素、高杯喉毛花内酯A 和异荭草素化合物处理后达最高值时分别比CK 高35.82%、28.57%和49.25%，且差异显著。

对于只接种TMV （CK+TMV ）处理，烟草叶片内PPO 活性呈先升高后下降且基本平稳的趋势，其活性在接种TMV 后12 h 达峰值，但其在最高值时与CK 差异不显著（P >0.05，下同）。

2.4　化合物对PAL 活性的影响
由图3可知，3种化合物处理后烟草叶片内PAL
表 1　3种化合物对TMV 在心叶烟上形成枯斑数的影响Table 1　Effect of three compounds on lesion numbers of TMV on N. glutinosa
同列数据后不同小写字母表示差异显著（P <0.05）。

表2同
Different lowercase letters in the same column indicated significant dif ‐ference （P <0.05）. The same was applied in Table 2
处理
Treatment 当药黄素Swertisin
高杯喉毛花内酯A Comtraide A 异荭草素Isoorientin 8%宁南霉素8% ningnanmycin 处理 Treatment
阳性对照 Positive control
处理 Treatment 阳性对照 Positive control 处理 Treatment 阳性对照 Positive control 处理 Treatment
阳性对照 Positive control
平均枯斑数
Average lesion number
6.1±0.3c 12.2±0.2a
7.1±0.1b 15.5±0.7a 5.6±0.8c 15.1±0.2a 6.7±0.6bc 12.4±0.4a
图 1　3种化合物对TMV 在心叶烟上症状形成的影响
Fig.1　Effect of three compounds on TMV symptom forma ‐
tion on Nicotiana glutinosa
HMH-7：当药黄素； HMH-9：高杯喉毛花内酯A ； HMH-11：异荭草素。

图2~图5同HMH-7：Swertisin ； HMH-9：Comtraide A ； HMH-11：Isoorientin. The
same was applied in Fig.2-Fig.5
表 2　3种化合物对TMV 的侵染抑制率（n=3）
Table 2　Inhibition rate of three compounds on TMV infection （n=3）
处理
Treatment
当药黄素 Swertisin
高杯喉毛花内酯A Comtraide A 异荭草素 Isoorientin
8%宁南霉素 8% ningnanmycin
质量浓度（μg/mL ）Mass concentration
10010010080
平均抑制率（%） Average inhibition rate
预防保护作用 Protective effect 50.05±0.23c 57.55±0.46b 61.73±0.52a 47.75±0.28d 钝化作用 Inactivation effect
51.65±0.78a 45.66±0.55b 12.85±0.34d 42.31±0.31c
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12期程林等：长梗喉毛花中3种化合物抗烟草花叶病毒活性分析及其对4种防御酶活性的影响
活性在12~24 h 时均低于CK ，但在48~96 h 时均高于CK 。

PAL 活性均在当药黄素、高杯喉毛花内酯A 和异荭草素处理后72 h 最高，分别为11.15、15.27和10.31 U/g ，分别比CK 高43.32%、49.05%和32.52%，且差异显著。

对于只接种TMV 处理，烟草叶片内PAL 活性呈先平稳升高后下降的趋势，其活性在接种TMV 后72 h 达峰值，随后下降，PAL 活性在48~96 h 时与对照相比差异显著。

2.5　化合物对SOD 活性的影响
由图4可知，当药黄素处理后，烟草叶片内SOD 活性在12~48 h 时高于对照，在72~96 h 时低于对照，呈先降低后升高的变化趋势。

高杯喉毛花内酯A 处理后，烟草叶片内SOD 活性只在12和48 h 时高于对照，在其他时间点低于对照，且呈先降低后升高再降低的变化趋势。

异荭草素处理后，烟草叶片内SOD 活性只在72 h 时低于对照，在其他时间点均高于对照，且呈先降低再升高的变化趋势。

SOD 活性在当药黄素和高杯喉毛花内酯A 处理后12 h 最高，其最高抑制率分别为71.93%和70.10%；SOD 活性在异荭草素处理后96 h 最高，其最高抑制率为69.12%。

SOD 活性在当药黄素、高杯喉毛花内酯A 和异荭草素处理后达最大值时分别比CK 高7.52%、4.78%和7.70%，但差异均不显著。

对于只接种TMV 处理，烟草叶片内SOD 活性呈先升高后下降再升高的趋势，其活性在接种TMV 后0 h 达峰值，对叶片内氧自由基的抑制率为72.24%；烟草叶片内SOD 活性在接种TMV 后24 h 最低，对叶片内氧自由基的抑制率为41.98%；SOD 活性在接种TMV 后的最高值和最低值与对照相比差异均不显著。

2.6　化合物对POD 活性的影响
由图5可知，当药黄素处理后，烟草叶片内POD 活性在12~24 h 时高于对照，在48~96 h 时低于对照，且呈先升高后降低的变化趋势。

高杯喉毛花内酯A 处理后，烟草叶片内POD 活性只在12和72 h 时低于对照，在其他时间点高于对照，且呈先升高又降低再升高的变化趋势。

异荭草素处理后，烟草叶片内POD 活性只在24和72 h 时高于对照，在其他时间点均低于对照，且呈先升高后降低的变化趋势。

当药黄素处理的POD 活性在接种后24 h 最高，为98.00 U/mg ；高杯喉毛花内酯A 处理在接种后48 h 最高，为105.33 U/mg ；异荭草素处理在接种后72 h 最高，为94.00 U/mg ；POD 活性在当药黄素、高杯喉毛花内酯A 和异荭草素处理后达最大值时比CK 分别高76.04%、15.96%和31.78%，且差异显著。

对于只接种TMV 处理，烟草叶片内POD 活性呈先下降后升高再下降的变化趋势，其活性在接种后24 h 达峰值，此时与CK 相比差异不显著。

图 2　3种化合物处理后0~96 h 烟草叶片内PPO 活性变化
Fig.2　Changes in PPO activity in tobacco leaves during 0-96 h
after treatment with three compounds
折线上同一时间点不同小写字母表示差异显著（P <0.05）。

图3~图5同
Different lowercase letters on the polyline of the same time indicated significant difference （P <0.05）.The same was applied in Fig.3-Fig.5
图 3　3种化合物处理后0~96 h 烟草叶片内PAL 活性变化
Fig.3　Changes in PAL activity in tobacco leaves during 0-96 h
after treatment with three compounds
图 4　3种化合物处理后0~96 h 烟草叶片内SOD 活性变化
Fig.4　Changes in SOD activity in tobacco leaves during 0-96 h
after treatment with three compounds
P P O 活性（U /g ） P P O a c t i v i t y
1.20
0.80
0.40
0.00
0 12 24 48 72 96
接种后时间（h ） Post inoculation time
接种后时间（h ） Post inoculation time
接种后时间（h ） Post inoculation time
20.00
10.00
0.00
P A L 活性（U /g ） P A L a c t i v i t y
100.00
80.0060.0040.00
S O D 抑制率（%）S O D i n h i b i t i o n r a t
e
CK
HMH-7HMH-9
HMH-11PC
CK+TMV
0 12 24 48 72 96
CK
HMH-7HMH-9
HMH-11PC
CK+TMV
0 12 24 48 72 96
CK HMH-7HMH-9
HMH-11PC
CK+TMV
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54卷
南 方 农 业 学 报3　讨论
烟草花叶病毒由于其侵染寄主广泛、防治难、危害大而受到广泛关注，被列为分子植物病理学上最重要的10种植物病毒之首（Scholthof et al.，2011）。

目前可高效防治TMV 的植物源抗病毒剂较少，研发低毒、高效、广谱的植物源抗病毒制剂迫在眉睫。

植物是生物活性化合物的天然宝库，其产生的次生代谢产物超过40万种（杨欣蕊等，2022），其中大多数活性物质如萜烯类、生物碱、黄酮类、酚类和香豆素类等均能为植物源农药的创制提供前体化合物。

目前对于长梗喉毛花中化合物的抗TMV 活性研究相关报道很少，有必要对其开展系统研究，挖掘其潜在的生物活性。

本课题组对喉毛花属植物开展了大量的提取和分离工作，从该属植物中分离、鉴定了100多个单体化合物，包括口山酮类、黄酮苷类、环烯醚萜苷类和新萘甲醛类化合物等（袁怡，2010；袁怡等，2010；王小龙等，2018；马恩广等，2019）。

此外，文献报道了对该属植物中多个单体化合物如异戊二烯化氧杂蒽酮类和新萘甲醛类化合物的抗TMV 活性研究（高越和郗砚彬，2015；王小龙等，2018；Bhas ‐kar et al.，2022）。

目前尚未有喉毛花属植物中黄酮类和裂环环烯醚萜苷类化合物发挥抗病毒活性及其作用机制的研究报道。

本研究发现2种黄酮类化合物（当药黄素和异荭草素）和1种裂环环烯醚萜苷类化合物（高杯喉毛花内酯A ）对TMV 具有较好的抑制活性，它们对TMV 的预防保护效果（平均抑制率分别为50.05%、61.73%和57.55%）优于生产上常用的病毒病防控农药宁南霉素（抑制率为47.75%），当药黄素、高杯喉毛花内酯A 和异荭草素可作为农业生产中植物源农药研发的先导化合物，进一步拓宽了喉毛花属植物的使用功效和应用范围，具有重大
的学术和经济价值。

植物防御酶如POD 、CAT 、PAL 、PPO 和SOD 等在植物抗病中具有重要作用，这些防御酶活性的高低直接影响着植物抗病性的强弱（吴应海等， 2022）。

有文献报道，黄酮类化合物苯丙烯菌酮能诱导烟草抗TMV ，使植物体内POD 、PPO 、PAL 和SOD 等4种防御酶活性显著提高（刘澄瑾等，2022），在本研究中，2个黄酮类化合物当药黄素和异荭草素也可
分别提高烟草叶片POD 、PPO 和PAL 活性，与文献报道的结果一致。

獐牙菜属植物中环烯醚萜类化合物龙胆苦苷和獐牙菜苷具有显著抑制TMV 侵染的活性，可抑制TMV 在寄主体内的增殖（张仲凯等，2013a ，2013b ），但其作用机制不明。

本研究发现喉毛花属植物中环烯醚萜苷类化合物高杯喉毛花内酯A 也可通过提高POD 、PPO 和PAL 防御酶活性而发挥其对TMV 的预防保护作用，与张仲凯等（2013a ，2013b ）的研究结果一致，即环烯醚萜类化合物可提高植物防御酶的活性。

植物防御酶作用机制主要在于参与活性氧清除及酚类、木质素和植保素等抗病有关物质的合成（刘海涛等，2022）。

本研究结果表明，当药黄素、高杯喉毛花内酯A 和异荭草素3种化合物可能通过促进细胞内酚类物质合成限制病毒扩展、促进植保素类物质合成直接防止病毒侵染、促进细胞壁木质化间接阻止病毒侵染等不同方式发挥其对TMV 的预防保护作用。

虽然SOD 活性在植物抗病中也发挥着重要作用（吴应海等，2022），但在本研究中，3种化合物处理后寄主体内的SOD 活性与CK 相比无显著差异，反映了不同化合物抑制TMV 侵染的机制有所不同。

本研究还发现，当药黄素和高杯喉毛花内酯A 对TMV 也有很好的钝化作用，可能原因是直接作用于TMV 粒子本身使其断裂成碎片而破坏TMV 的稳定性（晏英等，2021；Li et al.，2021），然而，另一黄酮类化合物异荭草素却没有钝化作用，表明同一类型的化合物当药黄素和异荭草素抑制TMV 的作用机制存在差异，也进一步表明3种不同类型的化合物可能通过不同的抗病毒机制抑制TMV 的侵染，但这些作用机制有待进一步探究。

4　结论
分离自长梗喉毛花的化合物当药黄素和高杯喉毛花内酯A 使用浓度为100 μg/mL 时对TMV 有较好的预防保护和钝化作用，异荭草素使用浓度为100 μg/mL 时对TMV 也有较好的预防保护作用。

当药黄素、高杯喉毛花内酯A 和异荭草素具有作为抗TMV 植物源农药或先导化合物的潜力。

图 5　3种化合物处理后0~96 h 烟草叶片内POD 活性变化
Fig.5　Changes in POD activity in tobacco leaves during 0-96 h
after treatment with three compounds
接种后时间（h ） Post inoculation time
100.00
50.00
0.00
P O D 活性（U /m g ）P O D a c t i v i t
y
CK HMH-7HMH-9
HMH-11PC
CK+TMV
0 12 24 48 72 96·
·3596
12期程林等：长梗喉毛花中3种化合物抗烟草花叶病毒活性分析及其对4种防御酶活性的影响
参考文献：
陈永对，刘春明，李宏光，董家红，郑雪，杨振兴，张仲凯.
2013. 植物源天然产物AHO对烟草花叶病毒的田间防效［J］. 中国植保导刊，33（4）：45-48. ［Chen Y D，Liu C M，Li H G，Dong J H，Zheng X，Yang Z X，Zhang Z K. 2013.
Field control effect of plant-derivednatural product AHO on tobacco mosaic virus［J］. China Plant Protection，33（4）：45-48.］doi：10.3969/j.issn.1672-6820.2013.04.013.
陈永对，张洁，吴阔，刘春明，肖俊华，李兴勇，张仲凯，董家红，李宏光. 2014. 植物源天然产物AHO对番茄斑萎病毒属病毒病的田间防效［J］. 南方农业学报，45（12）：2167-2171. ［Chen Y D，Zhang J，Wu K，Liu C M，Xian J H，Li X Y，Zhang Z K，Dong J H，Li H G. 2014. Field con‐trol effect of plant-derived natural product AHO on tospo‐virus diseases［J］. Journal of Southern Agriculture，45（12）：2167-2171.］doi：10.3969/j：issn.2095-1191.2014.12.2167.高越，郗砚彬. 2015. 从长梗喉毛花中分离得3种新的异戊二烯化氧杂蒽酮类化合物及其抗烟草花叶病毒活性的研究［J］. 国际中医中药杂志，（8）：702. ［Gao Y，Xi Y B.
2015. Isolation of three new isoprenylated oxaanthanone compounds from Comastoma pedunculatum and their anti TMV activities［J］. International Journal of Traditional Chi‐nese Medicine，（8）：702.］doi：10.3760/j.issn.1673-4246.
2015.08.012.
郭文慧，刘斌，闫合，冯俊涛. 2020. 114种植物提取物诱导烟草抗烟草花叶病毒活性鉴定［J］. 中国生物防治学报，36（4）：604-610. ［Guo W H，Liu B，Yan H，Feng J T. 2020.
Identification of induced resistance of 114 plants extracts against tobacco mosaic virus （TMV）［J］. Chinese Journal of Biological Control，36（4）：604-610.］doi：10.16409/j.
cnki.2095-039x.2020.04.022.
蹇军友，刘开兴，耿召良，葛永辉，郝小江. 2017. 黔产乌头中的生物碱成分及其抗烟草花叶病毒（TMV）活性［J］. 农药，56（10）：767-770. ［Jian J Y，Liu K X，Geng Z L，Ge Y H，Hao X J. 2017. Alkaloids of Acaonitun carmichaeli Deb and against TMV activity［J］. Agrochemicals，56（10）：767-770.］doi：10.16820/ki.1006-0413.2017.10.019.
金林红，宋宝安，杨松，胡德禹. 2003. 天然产物抗植物病毒剂国内外研究进展［J］. 农药，42（4）：10-12. ［Jin L H，Song
B A，Yang S，Hu D Y. 2003. The recent progress of natural
product as plant virucides［J］. Agrochemicals，42（4）：10-
12.］doi：10.16820/ki.1006-0413.2003.04.003.
刘澄瑾，张洪雨，孙礼雪，关丽杰. 2022.苯丙烯菌酮诱导烟草抗烟草花叶病毒（TMV）及对几种防御酶活性的影响［J］.农药，61（10）：767-770.［Liu C J，Zhang H Y，Sun L X，Guan L J. 2022. Effects of isobavachalcone on the resis‐tance to TMV and activity of defense enzymes of tobacco ［J］. Agrochemicals，61（10）：767-770.］ doi：10.16820/j.
nyzz.2022.1014.
刘海涛，安康，韩兴，孟庆芳，刘大群，李亚宁. 2022. 玫瑰黄链霉菌代谢产物诱导烟草抗病研究［J］. 中国植保导刊，42（9）：5-8. ［Liu H T，An K，Han X，Meng Q F，Liu D Q，Li Y N. 2022. Study on tobacco gray mold resistance induced by metabolite of Streptomyces roseoflavus［J］. China Plant Protection，42（9）：5-8.］ doi：10.3969/j.issn.1672-6820.2022.
09.001.刘真，祁艳艳，吴海燕，陈柯瑾，崔艺璇，魏敏，李干鹏. 2021.
藏药长梗喉毛花的活性成分研究［J］. 中药材，44（6）：1397-1404. ［Liu Z，Qi Y Y，Wu H Y，Chen K J，Cui Y X，Wei M，Li G P. 2021. Chemical constituents of Tibetan medicine comastoma pedunculatum whole herb［J］. Jour‐nal of Chinese Medicinal Materials，44（6）：1397-1404.］doi：10.13863/j.issn1001-4454.2021.06.019.
马恩广，吴海燕，胡丽娇，魏敏，陈柯瑾，牟林云，李干鹏.
2019. 高杯喉毛花中1个新的裂环环烯醚萜苷类化合物［J］. 中草药，50（9）：2023-2027. ［Ma E G，Wu H Y，Hu L J，Wei M，Chen K J，Mou L Y，Li G P. 2019. A new secoiri‐doid glycoside from Comastoma traillianum［J］. Chinese Traditional and Herbal Drugs，50（9）：2023-2027.］ doi：10.
7501/j.issn.0253-2670.2019.09.003.
孙翠红，徐翠莲，尤方芳，施守杰，王一丁，赵铭钦，孙双，刘芳，杜林洳. 2016. 壳寡糖席夫碱纳米银溶液对烟草花叶病防治及烟叶色素的影响［J］. 中国烟草科学，37（1）：61-
66. ［Sun C H，Xu C L，You F F，Shi S J，Wang Y D，Zhao
M Q，Sun S，Liu F，Du L R. 2016. The control efficiency of COS-Ag to TV in tobacco and its effect on tobacco pig‐ment［J］. Chinese Tobacco Science，37（1）：61-66.］doi：
10.13496/j.issn.1007-5119.2016.01.011.
王俊苹. 2018. 植物源农药的现状及发展趋势［J］.新农业，（3）：37-38. ［Wang J P. 2018. Current status and develop‐ment trend of plant-derived pesticides［J］.Modern Agri‐culture，（3）：37-38.］ doi：10.3969/j.issn.1002-4298.2018.
03.017.
王小龙，李萍，李晶，陈建华，杨光宇，胡秋芬，张承明，李干鹏. 2018. 藏药喉毛花中1个新萘甲醛类化合物及其抗TMV活性研究［J］. 中国中药杂志，43（19）：3884-3886.
［Wang X L，Li P，Li J，Chen J H，Yang G Y，Hu Q F，Zhang C M，Li G P. 2018. A new naphthaldehyde deriva‐tive from C omastoma pulmonarium and its anti-tobacco mosaic virus （anti-TMV） activity［J］. China Journal of Chi‐nese Materia Medica，43（19）：3884-3886.］ doi：10.19540/ ki.cjcmm. 20180807.009.
吴剑，宋宝安. 2016. 中国抗植物病毒药剂研究进展［J］. 中国科学：化学，46（11）：1165-1179. ［Wu J， Song B A. 2016.
Research progress of anti-virus agents for plants in China ［J］. Scientia Sinica （Chimica），46（11）：1165-1179.］ doi：
10.1360/N032016-00126.
吴应海，李安定，张丽敏，彭熙，蔡国俊，张孙健. 2022. 不同百香果品种对茎基腐病的抗性鉴定及防御酶活性研究［J］.
农业与技术，42（20）：1-6. ［Wu Y H，Li A D，Zhang L M，Peng X，Cai G J，Zhang S J. 2022. Identification of the resistance of different passion fruit cultivars against Stem rot and the activities of defense enzymes［J］. Agriculture and Technology，42（20）：1-6.］ doi：10.19754/j.nyyjs.202 21030001.
晏英，陈洁，唐攀，毛远湖，李毅，汤磊，郝小江. 2021. 复叶地黄连化学成分及其抗烟草花叶病毒活性研究［J］. 中草药，52（12）：3493-3500. ［Yan Y，Chen J，Tang P，Mao Y H，Li Y，Tang L，Hao X J. 2021. Chemical constituents from Munronia henryi and their anti-TMV activity［J］. Chi‐nese Traditional and Herbal Drugs，52（12）：3493-3500.］doi：10.7501/j.issn.0253-2670.2021.12.004.
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