悬浮培养与贴壁培养方式神经干细胞分化表型特点

悬浮培养与贴壁培养方式神经干细胞分化表型特点
刘友;刘希光;李爱民
【摘要】目的观察神经干细胞在悬浮培养与贴壁培养方式下的形态学特点及分化表型.方法新生6 h内的大鼠皮质应用无血清悬浮培养与贴壁培养神经干细胞(NSCs)技术培养,观察神经干细胞的形态学特点.体外胎牛血清(FBS)诱导NSCs分化,通过巢蛋白(Nestin)和GFAP免疫荧光染色鉴定分化表型.台盼蓝活细胞计数法比较细胞增殖能力.结果新生大鼠皮质应用无血清悬浮培养可获得稳定的NSCs细胞球,应用贴壁培养形成长梭状NSCs,NSCs巢蛋白免疫荧光染色结果呈阳性.体外FBS诱导分化后,神经球内开始出现放射状的神经纤维丝,免疫荧光染色可见GFAP 阳性细胞向外伸展以及Nestin阳性细胞边集.贴壁的NSCs分化成星形胶质细胞,免疫荧光染色可见Nestin和GFAP染色阳性细胞.在相同条件下,应用悬浮培养在第2~3d时增殖速度最大,而以贴壁培养方式培养出的神经干细胞在第4~5 d时增殖速度最大.结论应用无血清培养物B27与bFGF、EGF组合的NSCs完全培养基通过悬浮培养法与贴壁培养法,都可以成功在体外培养出NSCs;悬浮培养法培养NSCs在早期增殖速率上优于贴壁培养法.%Objective To observe the morphological characteristics and differentiation phenotype of neural stem cells in suspension culture and adherent culture .Methods The neural stem cells ( NSCs) of rat cortex was cultured by serum-free suspension culture and adherent culture . The morphological characteristics of neural stem cells were observed .In vitro fetal bovine serum (FBS) induced differentiation of NSCs,and differentiated phenotypes were identified by Nestin and GFAP immunofluorescence staining .Proven blue viable cell count method compared cell proliferation ability .Results The neonatal rat
cortex was cultured in serum-free suspension to obtain stable NSCs cell pellets .Adherent culture was used to form long fusiform NSCs .NSCs were positive for nestin immunofluorescence staining .In vitro, FBS induced differentiation , radial nerve fibers began to appear in the nerve ball , immunofluorescence staining showed GFAP positive cells outward and Nestin positive cells set .NSCs were stained into astrocytes , and Nestin and GFAP staining positive cells were observed by immunofluorescence staining .The proliferation rate of the neural stem cells cultured in the same way was the highest at the 4th ~3rd day,and the proliferation rate was the highest at the 4th ~5th day.Conclusions The neural stem cells can be successfully cultured in vitro by suspension culture and adherent culture using the serum -free culture medium B27 and bFGF,EGF combined neural stem cells .Cultivation of neural stem cells by suspension culture was superior to adherent culture in early proliferation rate .
【期刊名称】《临床神经外科杂志》
【年(卷),期】2017(014)005
【总页数】5页(P385-389)
【关键词】神经干细胞;悬浮培养;贴壁培养
【作者】刘友;刘希光;李爱民
【作者单位】222002 连云港,徐州医科大学附属连云港医院神经外科;222002 连云港,徐州医科大学附属连云港医院神经外科;222002 连云港,徐州医科大学附属连云港医院神经外科
【正文语种】中文
【中图分类】R741.05
成年哺乳动物大脑的急性或慢性损伤通常与持续功能性缺陷相关，其再生潜力和重建缺失神经结构的能力有限[1]。

然而，神经干细胞(neural stem cell，NSCs)在整个生命过程持续存在于大脑区域，诱导新的神经元以及胶质细胞的形成和激活[2-4]。

NSCs自我更新和定向分化的能力使其成为细胞治疗的起点和受欢迎的选择[5]。

本实验分别采用原代悬浮培养与贴壁培养两种方式培养新生大鼠NSCs，并进行胶质细胞的分化对比研究；以探讨切实可行的NSCs培养方法，为临床NSCs治疗
相关疾病提供细胞实验基础。

一部分以悬浮细胞培养方式培养的细胞，接种24h后细胞开始变大、变多，边缘
开始出现凹凸不平的增殖改变(图1A)。

接种 3 d后，出现部分细胞死亡，并且单
个细胞减少，大多数细胞发生聚集成一团，形成大小不一的细胞球。

随着时间进展，细胞球明显增大、增多，形成神经球(neurosphere)。

神经球呈球形，折光性强，当部分神经细胞球因不断增殖、体积过大出现球的中心颜色加深、透光性变差(图
1B)；当球的直径为 0.15mm或更大时，可以对大鼠NSCs进行传代。

另一部分以贴壁细胞培养方式培养的细胞，NSCs接种 24h后，细胞开始贴壁，
形态开始改变，呈椭圆形变化(图1C)。

随后贴壁细胞迅速增多，形成长梭状NSCs，直到接种3 d后细胞完全贴壁(图1D)。

当细胞布满约80%面积时，开始对大鼠NSCs准备传代。

取鉴定过的NSCs，撤去NSCs完全培养基，改用为诱导分化培养基，可分化为星形胶质细胞。

同时以NSCs完全培养基培养的NSCs作为对照组。

在NSCs细胞
球诱导分化为星形胶质细胞培养中，观察到开始时NSCs细胞球发生出芽变化，
然后突起逐渐变多，最后神经球内细胞形成大量放射状的神经丝(图1E)。

而在贴
壁细胞诱导分化中，观察到NSCs分化为具有多个长突起并呈梭样排列的神经胶
质样细胞并随着培养时间的延长逐渐变多、变长，与相邻近细胞突起相互交联成网状结构(图1F)。

在1992年，Reynoldsde等[6]研究出无血清NSCs悬浮培养法。

即NSCs通过保持稳定悬浮状态，从而保持其未分化的生物学特性。

这正是NSCs进行体外培养、移植等实验研究的前提。

但是随着细胞聚集，不断增殖、变大、变多，神经球的体积也随之增长，使神经球内层的细胞与培养基接触表面积变小，营养物质交换变少，进而出现凋亡、自噬等变化[7，8]。

随后Gage等[9]应用无血清单层细胞贴壁培
养法来培养NSCs。

其优点在于细胞单层贴壁，在其周围增殖贴于培养瓶底，减少了早期接触抑制，并且与培养基接触完全，便于营养物质的交换。

但研究表明，应用单层细胞贴壁方式培养NSCs中可能会发生NSCs分化现象[10-12]。

本实验中
运用B27补充剂来代替血清等生长因子，采用了两种NSCs培养方式来培养NSCs。

用悬浮培养方式来扩增神经球。

第1 d，细胞开始增殖逐渐变大，而后聚
集在一起、相互连接成团。

随着时间推移，小的细胞球开始不断分裂增殖变大，同时吸引周围单个细胞聚集，最后形成大的NSCs细胞球。

而贴壁培养法，细胞第3 d就完全贴壁，第7 d细胞布满80%。

通过大鼠NSCs细胞计数法比较两种培养方式下细胞的增殖能力，其中悬浮培养
方式培养出的NSCs早期增殖能力强。

在第6 d前，活细胞占培养器具面积小于70%，细胞增殖能力、细胞活性未降低，此时可以进行体外诱导、移植等实验研究。

由于NSCs活性高、特异性强，且无干细胞分化现象的缺点。

神经球分化第1 d，聚集的细胞团开始边集，从神经球内展开小突起(根据NSCs分化类型，展开不同的形状)。

神经球周围形成小分支，后逐渐分离，最后形成贴壁细胞法一样的细
胞排列。

维持NSCs的长期存活生长和状态稳定不仅需要无血清补充剂，而且必
须有EGF和bFGF等细胞生长因子。

其中EGF和bFGF可以调节与维持细胞状态、
稳定细胞微环境及抑制NSCs分化等作用[13]。

本实验在NSCs培养基中未用抗生素，由于抗生素会抑制NSCs的增殖和活力[14]。

当NSCs分化为神经元以及胶质细胞时，Nestin(细胞骨架蛋白，在多潜能的神经外胚层细胞中表达)便会在细胞中停止表达[15]。

而星形胶质细胞活化时GFAP作为其标志物表达也会上调[16]。

综上所述，本实验采用无血清培养物B27与bFGF、EGF组合的NSCs完全培养基，用悬浮培养法与贴壁培养法培养大鼠NSCs，优化细胞培养技术及增殖分化等方法，观察两种培养方式下NSCs及其诱导分化产物的形态学特点。

结果显示，两种培养方法都可以成功在体外培养出NSCs，悬浮培养法培养NSCs在早期增殖速率上优于贴壁培养法。

本研究结果为NSCs相关研究提供了一定的细胞实验基础，然而本研究仍有一定的局限性和不足之处，还需要更多的相关实验来进一步验证和完善。

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