SMN蛋白水平及其下游靶点的调控在脊髓性肌萎缩症治疗中的研究

SMN 蛋白水平及其下游靶点的调控在脊髓性肌萎缩症治疗中的研究
田　梅　刘亚玲　赵文艳　任博文　周　豪
中图分类号：R745.4 文献标识码：A 文章编号：1006-351X（2020）12-0789-04脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)是一种神经退行性疾病，是由脊髓前角运动神经元变性所致，以进行性、对称性肢体近端和躯干肌肉萎缩、无力为临床表现。

运动神经元存活（survival motor neuron,SMN）蛋白水平的降低是导致SMA 发病的最根本原因，而受SMN 蛋白水平影响的下游靶点的一系列改变也参与了SMA 的病理生理过程。

本文即围绕二者在SMA 治疗中的研究进展做一综述。

一、SMN 蛋白水平调控的治疗研究
SMA 的致病基因定位于5q13区域，称之为SMN 基因，在该区域内有两个几乎相同的拷贝，分别为SMN1和SMN2，约98.6%的SMA 患者的SMN1基因发生了缺失或截断[1]。

SMN1和SMN2有5个核苷酸的不同，但只有其中1个核苷酸决定了两者在功能上的差异，那就是外显子7第6位上C →T 的转变，这种转变影响了外显子剪接增强子（exonic splicing enhancer，ESE）的活性，使得SMN2 前体mRNA 在剪接的过程中发生了外显子7的跳过[2]，产生了截短的mRNA 并被翻译为一种极不稳定的蛋白质（SMN △7），与SMN1基因的翻译产物（全长SMN 蛋白）相比，这种蛋白易被迅速降解，不能发挥相应的作用。

虽然仍有大约20%的SMN2基因可以表达为全长SMN 蛋白[3]，但这仍不足以弥补SMN 蛋白减少所带来的一系列严重后果。

由于SMA 的各种病理过程最终归结于SMN 蛋白的产生不足，因此，如何提高SMN 蛋白的水平成为其治疗中最为重要的一部分。

显然，使用基因疗法外源性补充SMN1基因是一直接途径；由于SMA 患者至少存在1个SMN2基因拷贝，因此，调节SMN2前体mRNA 的剪接过程，使其能够翻译为全长SMN 蛋白，理论上适用于所有SMA 患者，上述这两种方法都围绕着如何让SMN 蛋白的合成增加；此外，SMN 蛋白还在降
基金项目：河北省卫生厅医学适用跟踪项目（G201715）作者单位：050000 石家庄，河北医科大学第二医院神经内科通信作者：刘亚玲，Email：*****************
·综　述·
解方面受到调控，这也将会是一个可行的治疗思路。

1.SMN1基因的外源性补充：
Onasemnogene abeparvovec 是一种基于腺相关病毒载体的基因疗法，旨在将SMN1基因传递给SMA 患者的运动神经元细胞，已于2019年5月在美国获得FDA 批准，用于治疗2岁以下的SMN1双等位基因突变的SMA 患者[4]。

多项临床试验表明静脉滴注Onasemnogene abeparvovec 可以改善SMA1型、SMA2型以及症状前SMA 患者的运动功能并延长其生存年龄[4-5]。

目前几项关于Onasemnogene abeparvovec 的临床试验仍在进行中，以评估其安全性及有效性（NCT03837184、NCT03505099、NCT04042025、NCT03461289）。

2.调节SMN2前体mRNA 的剪接过程
反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO），可以通过与前体mRNA 杂交来调节靶基因的表达。

内含子剪接沉默子（intronic splicing silencer,ISS）N1(ISS-N1)定位于SMN2基因内含子7中，包含2个核内不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein, hnRNP）Al ／A2(hnRNP AI ／A2)结合位点，是影响剪接功能的一个重要结构[6]。

针对该位点的ASO 可以阻止hnRNP AI ／A2与ISS—N1结合，从而使外显子7在剪接过程中得以保留，基于这一原理，2016年美国FDA 批准Nusinersen 作为治疗SMA 的药物。

已完成的几项临床试验表明，鞘内注射Nusinersen 对于SMA 各型患者均显示出安全性和耐受性，并且可以改善运动功能[7–12]。

鞘内注射Nusinersen 对于SMA 患者肺功能及呼吸肌力量的影响（NCT04050852）、长期使用的安全性及耐受性（NCT02594124）以及对于症状前SMA 患者的治疗（NCT02386553）相关临床试验目前还在进行当中。

最近Woo 等[13]发现，SMN1、SMN2基因中都表达一种长非编码RNA(long noncoding RNA ,LncRNA)，通过将多梳抑制复合体2（polycomb repressive complex 2, PRC2）招募到其位点来抑制基因的表达。

针对LncRNA 的PRC2结合区的化学修饰
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（收稿日期：2020-06-20）
ASO破坏了其与PRC2之间的相互作用，从而可以上调SMN2基因的表达。

3.小分子剪接剂：
口服小分子剪接剂不仅给药途径方便，而且有更为广泛的组织分布。

Branaplam是一种哒嗪类口服活性小分子剪接剂，它可以增强U1小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoproteins,snRNP）的结合亲和力，稳定U1snRNP复合物与SMN2前体mRNA之间的相互作用，从而达到纠正SMN2基因剪接缺陷的目的[14]。

在SMA小鼠模型中，Branaplam增加了中枢神经系统中全长SMN蛋白的水平并延长了小鼠的寿命[15]。

对于SMA1型患者的临床试验正在进行中，以评估其安全性、耐受性、药物代谢动力学、药物效应动力学和有效性（NCT02268552）。

Risplam也是一种口服小分子剪接剂，在药物代谢动力学方面进行了优化，对SMN2外显子7的剪接具有很强的特异性，可以广泛分布到中枢神经系统和外周组织[16]。

该化合物正在进行几项临床试验来评估在SMA1型、2型、3型以及无症状SMA患者中的安全性和有效性（NCT03032172、NCT03779334、NCT02913482、NCT02908685），这将会是一个很有潜力的治疗药物。

Baek等[17]最近在植物中提取出可以纠正SMN2剪接缺陷的有效成分，并在SMA患者成纤维细胞中得到证实，可以改善SMA小鼠的表型缺陷，特别是肌肉的功能，这为开发植物来源的SMA候选药物提供了一种可能性。

4.稳定SMN蛋白，抑制其降解：
对于SMA患者而言，携带的SMN2基因拷贝数越多，其病情的严重程度就越低[1]。

类似地，SMN△7cDNA基因拷贝数的增加会成比例地减轻SMA的严重程度,这表明即使SMN△7的水平升高也对SMA患者有利[3]。

SMN△7缺少正常的C’末端第16位氨基酸(由外显子7编码)，而是获得了由外显子8所编码的4个氨基酸序列EMLA[18]。

从SMN△7中删除C’末端EMLA可以使SMN△7的半衰期增加两倍，进一步删除YG盒(由外显子6编码)，也起到了同样的效果。

这表明EMLA和YG盒是SMN△7的降解信号（称之为SMN△7-DEG），影响了SMN△7的稳定性。

此外Cho等[3]还发现在EMLA的C’端添加5个氨基酸可以提高SMN△7的稳定性。

Heier等[19]发现，SMN蛋白的末端能够以一种独立于其特定序列的方式调节蛋白质的稳定性，通过翻译通读类的药物使SMN△7外显子8的第一个终止密码子不被识别，将截短的蛋白质额外延长5个氨基酸，这个长度已经在体外被证明可以赋予蛋白质更多的功能[20]。

氨基糖苷类化合物，可以抑制终止密码子的识别，影响蛋白质的翻译。

在SMA小鼠模型中，经腹腔注射或脑室注射氨基糖苷类化合物，都能够提高SMN 蛋白水平，改善小鼠的运动功能[19-20]。

因此，提高SMN△7的稳定性或赋予它足够的功能可能成为治疗SMA的潜在方法。

由于大约20%的SMN2基因可以表达为全长SMN蛋白，因此抑制这些残存的全长SMN蛋白的降解也不失为一种治疗SMA的办法。

SMN蛋白通过泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS）进行降解。

在这个系统中，E3连接酶的作用是将泛素部分添加到蛋白质相应的位点进行标记。

与蛋白酶体不同，E3连接酶与蛋白质的相互作用更具特异性，因此被认为是抑制蛋白质降解的靶点。

Mib1是一种E3连接酶，Mib1的抑制剂ML372可以抑制SMN蛋白泛素化，在不影响mRNA表达的情况下，提高SMN蛋白水平，挽救了小鼠的运动功能并延长了寿命[21]。

二、针对SMN蛋白影响的下游靶点的治疗研究
SMN蛋白是一种管家蛋白，存在于各种细胞的胞浆和胞核中，并与各种蛋白相互作用，执行不同的生理功能，SMN 蛋白的减少势必会引起下游一系列生化改变，针对这些下游靶点的相关研究虽然不能提高SMN蛋白的水平，但却可以改善SMA相关的病理生理改变，这也为SMA的治疗增添了新的力量。

1.线粒体功能障碍：
线粒体对维持神经元的存活必不可少，在ATP的产生、Ca2+的稳态、活性氧的产生和凋亡信号的调节中发挥着至关重要的作用[22]。

SMN蛋白的减少导致脊髓运动神经元轴突中线粒体的运输和其密度显著降低，线粒体活性氧的产生上调，氧化应激诱导的细胞凋亡增加，从而导致轴突变性、运动神经元死亡。

应用N-乙酰半胱氨酸可以部分改善体外培养的SMA脊髓运动神经元线粒体的轴突运输、线粒体的分布和形态的缺陷；依达拉奉可以清除氧自由基，对抗氧化应激诱导的细胞凋亡，对SMA-iPSCs来源的脊髓运动神经元的某些病理方面显示出可靠的疗效；同样左乙拉西坦在体外模型中也显示出保护线粒体，抗凋亡的作用[22-24]。

Olesoxime作用于线粒体膜，降低应激状态下膜的通透性，通过减少促凋亡因子的释放来防止细胞凋亡。

在一项多中心的2期临床试验中，虽然Olesoxime并没有显著改善运动功能。

但Olesoxime似乎维持了运动功能[25]。

因此，保护线粒体也是SMA的一个治疗靶点。

2.内吞作用及突触传递：
有研究表明神经肌肉接头（neuromuscular junction，NJM）的异常变化是SMA小鼠最早出现的病理改变，SMN蛋白的减少阻碍了NJM的成熟[26]，这可能是由于低水平的SMN蛋白会影响内吞作用和突触囊泡循环[18]。

NJM处突触囊泡的循环保证了突触终板上快速、重复的神经传递，而内吞在这一过程中发挥着关键作用[27]。

神经元钙感受器NCALD（neurocalcin delta，NCALD）和纤溶酶原3（plastin 3，PLS3）作为人类SMA保护性修饰物被发现，NCALD是内吞作用的负调节因子，而PLS3是其正调节因子，它们都依赖于Ca2+来发挥作用。

NCALD基因的敲除改善了斑马鱼的运动轴突的发育、小鼠的运动神经元回路和NMJ突触前功能[27-28]。

而PLS3的过表达则增加了SMA 小鼠模型NMJ的大小、本体感觉的传入，并改善了运动功能[29]。

这种保护性基因修饰物通过改善内吞作用可能会成为有价值的治疗方法。

3.泛素稳态：
泛素样修饰物激活酶1(ubiquitin-like modifier activating enzyme 1，UBA1)调节着泛素分子与靶蛋白结合的酶级联反应的第一阶段，因此，UBA1水平的降低将会影响泛素的整体稳态。

在SMA小鼠模型中，SMN蛋白的减少会导致UBA1 mRNA的剪接中断，进而使得UBA1水平降低；在SMA斑马
鱼模型中，抑制UBA1足以解释其神经肌肉的病理改变，表明UBA1直接参与了SMA的发病机制[30]。

UBA1水平的恢复显著改善了SMA斑马鱼模型的运动功能缺陷以及 SMA小鼠的神经肌肉病理[31]。

这些都表明以泛素通路作为靶点治疗SMA的可用性。

4.c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase,JNK)级联信号通路：
低水平的SMN蛋白可能会导致细胞内应激，激活JNK级联信号通路，从而介导了神经元的变性。

JNK3基因敲除在不影响SMN蛋白水平的情况下，可以防止脊髓运动神经元变性，使SMA小鼠的表型得到改善，促进生长并延长寿命。

这也证明了JNK3是SMA的一个潜在的治疗靶点[18,32]。

5.磷酸酶和张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）与轴突生长：
SMN蛋白对mRNA的运输必不可少。

SMN蛋白的减少使得生长锥中β肌动蛋白mRNA水平降低，进而导致β肌动蛋白减少，从而影响了轴突的生长[33]。

雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）是蛋白质合成和细胞生长的主要调节因子，PTEN的缺失激活了mTOR信号通路，上调了蛋白质的翻译活性，在没有增加β肌动蛋白mRNA水平的情况下，提高了生长锥中β肌动蛋白水平，进而促进了轴突生长[34]。

因此，PTEN /mTOR通路也可能代表着一种重要的治疗策略来改善SMA患者的神经肌肉病理。

小　结
综上所述，SMN1基因的突变导致了SMN蛋白的减少，而SMN蛋白的减少进一步触发了下游靶点的一系列病理生理改变，最终使患者表现为骨骼肌的萎缩和无力。

因此，不论是从根本上调控SMN蛋白的水平，还是作用于受SMN蛋白影响的下游靶点都能改善SMA患者的症状。

相关治疗研究可以围绕着这两部分进一步扩展和优化，不断加深对疾病发病机制的了解以识别可予以干预的靶点。

关于SMA的治疗仍存在以下问题值得研究者去进一步探索：一方面，动物实验和临床试验均提示SMA的治疗存在一个相对较窄的时间窗，越早开始治疗患者的获益就越大，确定最佳给药时间是一个关键问题。

另一方面，尽管下运动神经元是SMA的主要致病靶点，但动物模型研究显示其他非中枢神经系统组织也会受到不同程度的影响,因此，恢复SMN蛋白在其它组织中的表达是必要的，如何提高SMN蛋白在全身组织的有效分布也需要进一步加以思索。

参　考　文　献
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