三种禽用疫苗外源病原多重荧光PCR检测方法建立

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三种禽用疫苗外源病原多重荧光PCR检测方法建立
王艳*1张强1李健1张建峰2朱小清3
摘要根据G en B an k中收录的鸡毒支原体、禽白血病病毒和网状内皮细胞增生症病毒的基因序列，分别设计并合成了引物和相应的荧光探针，通过对反应条件和反应程序的优化，建立了一种可以同时检测3种禽用疫苗外源性病原污染因子的三重荧光P C R检测方法。

结果显示，建立的三重荧光P C R灵敏度高，最低可检测到lO c o p ie s/jjiL的质粒，并具有良好的特异性，可用于禽用疫苗外源性污染因子的快速检测，也可用于相关疫病的诊断
关键词鸡毒支原体；禽白血病病毒；网状内皮细胞增生症病毒；实时荧光PCR
Development of a Triplex Real-time PCR Assay for
Detection of MG, ALV, REV in Poultry Vaccines
WANG Yan1ZHANG Qiang1LI Jian1ZHANG Jian-Feng2ZHU Xiao-Qing3
Abstract Based on the sequences of mycoplasma gallisepticum (MS), Avian Leukosis virus (ALV) and reticuloendotheliosis virus(REV) genome from GenBank, three sets of primers and probes for the three pathogens were designed and synthesized. After the reaction conditions and processes were optimized, a triplex real-time PCR assay was established. The results showed that this assay had reasonable sensitivity, and the detection limits for plasmids was 10 copies/(j l L without cross reaction to other pathogens. This real­time PCR assay reported in the study can be used for the diagnosis of related diseases and rapid detection of exogenous contamination of poultry vaccines.
Keywords MG；A L V；R E V；real-tim e PCR
禽用疫苗的外源性污染问题一直受到相关监管部 门、产业部门的重视。

中国兽医药品监察所2010年 曾对全国部分禽用活疫苗进行外源污染检测，发现外 源病毒污染的阳性率为36.1%ni。

外源病毒污染不仅会影响疫苗的效果，而且会导致疫病的暴发，给畜牧 养殖业造成危害。

禽用疫苗主要以禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus, A L V)、网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis
第一作者：王艳（1981—），女，汉族，江苏南通人，博士，高级兽医师，主要从事动物检疫工作，E-mail: ****************
1.上海海关上海200135
2.广东省农业科学院动物卫生研究所广州510640
3.北京兰伯瑞生物技术有限公司北京101300
1. Shanghai Customs , Shanghai 200135
2. Institute of Animal Health, Guangdong Academy of Agricultural Science , Guangzhou 510640
3. Beijing Laboratory Biology Technology co.,Ltd , Beijing 101300
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virus,R E V)的污染较为常见。

A L V是引起禽白血病 (Avian Leukosis,A L)的一种抑制生长和诱发多种良 性肿瘤和恶性肿瘤的病原。

A L V主要通过种鸡垂直传 播，其次是水平传播。

另外，疫苗污染也会引起该疫 病的传播。

2006年，美国发现鸡马立克氏疫苗中存在 A L V-A污染％ 2009年，邱波®等对山东省的20个 种鸡场内常规使用的A L V疫苗进行外源污染检测，结果显示，在19个种鸡场使用的常规疫苗中检测出 A L V-p27抗原，阳性率达到28.18%。

2014年，胡晓 苗|4i等发现安徽省鸡群接种的疫苗中A L V阳性率达 28.57%。

由于R E V可以垂直传播，如果鸡群接种污 染了 R E V的疫苗，会造成R E V的流行。

A w a d A M等|5丨在禽痘疫苗中发现R E V污染。

近年来，接种污染了 R E V的禽弱毒化疫苗被认为是R E V流行的重要因素 之一 刘轶秋等M对141批次的生物制品进行了 支原体检测，发现疫苗合格率仅为80.1%。

宁宜宝岡 等通过对禽用活疫苗中支原体外源污染的调查发现，污染率达64.5%,情况相当严重。

目前，对疫苗中外源性污染的检测主要包括细胞 培养法、S P F鸡检查法、E L I S A法等。

细胞培养法和 S P F鸡检查法存在耗时费力、成本高等缺点；E L丨S A
法可能会出现假阳性的结果，特别是检测活疫苗样品，利用抗体E L I S A检测时，可能会漏检一些低剂量的 污染。

为了提高对禽用疫苗外源性污染的检测率，本 研究利用荧光定量P C R技术探索可同时检测禽用疫 苗中3种外源性病原的检测方法，以期提供一种可以 快速检测疫苗中外源性A L V、R E V、M G污染的方法，保障禽用疫苗的生物安全。

1材料和方法
1.1试剂和仪器
荧光定量P C R试剂购自宝生物工程（大连）有限 公司；焦碳酸二乙酯（D E P C)购自生工生物工程（上 海）股份有限公司；A B I7500 F a s t荧光P C R仪购自美 国应用生物系统公司（A B I)。

1.2方法
1.2.1引物及探针的设计与合成
依据G e n B a n k中登录的A L V、R E V和M G的基 因序列（登录号分别为N C_015116.1、N C_006934.1、N C J X M829.1 )，利用P r i m e r软件针对3种病原的基 因序列进行和比对分析，选择高度保守的区域，设计 引物和探针（见表1 )。

其中，探针5_端标记的荧光 报告基团分别为C Y5、R0X和F A M。

引物和探针均 由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1实时荧光PCR引物与探针
Table 1The primer pairs and probes in the real-tim e
qPCR
引物与探针序列（5'-3')
ALVF CGGGACCCACTGTCTTTACC
ALVR GCGCGTGCTTCCAGTTGT
ALVP CY5-ACGCCTCCTCAAGCACCCATAAG-BHQ3
REVF TCCCCGGCTAGCAGAGAAC
REVR CTACGGGTATACCAGTCCTATTGTC
REVP R0X-CTGGCTTTGCATGACTCTTGGAAC-BHQ2
MGF GGATTAGATACCCTAGTAGTCCACA
MGR CGTGTACCGTCGAATTAAGCA
MGP FAM-CATGCTCCACCACTTGTGCGGG-BHQ1
1.2.2三种基因序列的合成
利用P r i m e r软件比对后选取的高度保守的区域，送生工生物工程（上海）股份有限公司合成相应的标 准品质粒，分别命名为A L V、R E V和M G。

1.2.3多重荧光检测方法的建立
1.2.3.1反应体系的优化和标准曲线的建立
基于单个目标基因荧光P C R方法，通过对引物、探针浓度和反应条件的优化，确定三重荧光P C R的 反应条件。

采用已建立的三重荧光P C R反应条件，对标准品质粒进行10倍稀释，浓度分别为10 copies/ p L ~ lOScopies/p L,以各浓度作为模板进行P C R 的扩增。

以C T值为Y轴，以标准品稀释后浓度为X 轴制作标准曲线，建立扩增曲线及标准曲线。

1.2.3.2特异性试验
利用已建立的荧光P C R方法，对本实验室保存 的其他相关病原阳性质粒（马立克氏病、新城疫、禽
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流感）进行特异性检测。

1.2.3.3敏感性试验
将3种病原模板进行10倍的倍比稀释，使其浓 度分别为l〇f i copies/|j l L、105copies/|x L、104copies/ p L、103copies/(x L、102copies/|x L、101copies/(x L，并进行敏感性检测。

1.2.4样品的检测
利用建立的三重荧光P C R方法对市售的禽用疫 苗（鸡痘活疫苗2批次、鸡新城疫-鸡传染性支气管 活疫苗2批次、鸡新城疫L a S o t a株灭活疫苗2批次、鸡毒支原体灭活疫苗1批次、鸡传染性法氏囊病活疫 苗2批次、鸡马立克氏病活疫苗2批次）进行检测。

Standard Curve
y =-2.857i+ 37.769
R2= 0 99
A
Standard Curve
35.000
30.000
25.000
20.000
15.000
10.000
V = -2.6606k36.591
R2=0.98
0 2 4 6 8
2结果
B
2.1反应条件的优化及标准曲线的建立
各反应条件优化后，最终确定反应体系为T a q M a n Mixture (2x ) 12.5|x L，上下游弓|物（浓度为 l O p m o l/ m L)各 0.5 |jl L，探针（浓度为 10 p m o l/m L)各 0.4 |jl L，模板各2 ^L，用d d H2〇补足至总体系25 |x L。

扩增程 序为95°(：预变性1〇111丨11;95°(：变性2〇5,60°(：退火，延伸35 s, 40个扩增循环；在60°C阶段收集荧光信号。

整个检测过程仅需60 m i n即可完成。

标准品质粒在浓度10 copies/|jl L ~ 105copies/ |x L之间都能检测到荧光信号，其扩增曲线较圆滑 且平整，得到的标准曲线具良好线性关系。

以标准 品质粒的稀释浓度为X轴、C t值为Y轴，得到三重 荧光定量P C R对3种标准品的标准曲线，如图1所示。

方程如下：
A L V：-2.857x + 37.769, R z= 0.99；R E V：-
2.6606x + 36.591,R2 = 0.98；M G：-2.6525x + 36.403，R2= 0.9805。

2.2多重PCR检测特异性结果
结果表明，建立的方法具有良好的特异性，能特 异地扩增A L V、R E V和M G，能分别检测出各自的扩 增曲线；对马立克氏病、禽流感和新城疫等相关病原 核酸在C t值30以内均未出现扩增曲线，无扩增，结 果为阴性。

上述试验结果如图2所示。

Standard Curve
30.000
25.000 •■
20.000
15000 v= -2.6525X -*■ 36.403
10.000 R2= 0.9805
5.000
0.000
0 2 4 6 8
C
A: ALV; B: REV; C: MG
图1三重荧光定量PCR标准曲线A:ALV; B:REV; C:MG Fig.1 The standard curve of real-time qPCR for ALV,REV,MG
2.3多重PCR检测敏感性结果
对10倍梯度稀释的A L V、R E V和M G进行检测，结果表明，A L V质粒在100 copies/ixL可以检测到荧 光值，R E V和M G质粒均在10 copies/ijl L可以检测 到荧光信号值。

以上结果表明，A L V的灵敏度可达 100 copies/(x L,R E V和 M G的灵敏度可达 10 copies/ p L，如图3所示。

2.4多重PCR检测样品检测结果
检测结果表明，本研究采集的疫苗样品未检出 A L V、R E V和M G污染。

这表明我国禽用疫苗的质量 控制良好，与刘丹等％报道的结果一致。

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Amplification Plot
Cycle
■ Target 2 ■T a r g e t! ■ Target 3
图2三重荧光定量PCR特异性试验
Fig.2 The specificity results of real-tim e qPCR
3讨论
疫苗接种是目前我国畜牧养殖业预防和控制疫病 的有效手段之一。

由于疫苗生产所采用的原材料大多 来源于动物组织、血液等，存在外源性病原微生物污 染的风险外源性污染是指生物制品在生产过程中被 细菌、病毒、细胞基质或者生物制品所使用的原辅材 料及制品中的细菌、真菌、病毒和支原体污染例如，牛血清中的牛病毒性腹泻病毒是疫苗中最为常见的外 源性污染因子之一 m。

李海娟等_通过研究有外源 性污染的活疫苗对鸡群的致病性，发现免疫有外源性 A L V污染的疫苗是A L V在鸡群中流行的传播途径之 一，外源性污染是目前影响我国禽用活疫苗质量的重 要因素之一，国外也有多起疫苗中污染A L V或R E V 的报道20世纪80年代，使用普通鸡胚生产出 的禽用活疫苗其支原体阳性率很高1141:
目前，我国常用的禽用活疫苗的外源病毒检验 方法包括细胞检查法、S P F鸡胚检查法和S P F鸡检查 法，但是这些传统方法或多或少受到细胞传代、细胞密度、培养条件的影响，存在耗时耗力的缺点_培养 法是支原体检测的传统方法，不过培养时间长，因此，开发特异、敏感的分子生物学检测方法有助于快速检 测目标病原，有效降低外源病毒污染的风险孙淼等n si利用间接免疫荧光法（Indirect immunofluorescence assay,I F A)对污染了 R E V的鸡痘活疫苗进行检测，确定丨F A方法的最低检出M：为每500羽份疫苗中污染 20T C I D50的R E V胡晓苗等w利用P C R法检测禽活 疫苗中A L V,证实P C R法可作为活毒疫苗中检测A L V 污染的有效手段英聪等_建立了可以用于检测兽用 疫苗14种支原体的P C R方法实时荧光定量P C R技 术因其灵敏度高、特异性强的特点已经被广泛应用于 多个领域，本研究通过对3种3标病原的基因比对分 析，设计了引物及探针，为禽用疫苗外源性污染的检 测提供了一种新的技术方法研究结果表明，建立的 检测方法对A L V、R E V和M G均可以检出特异性，而对于其他病原无扩增，表现出较好的特异性；敏感性 试验表明，本研究最低能检测A L V 100 copies/(j l L, R E V和M G可达到10 copies/ijl L,该方法具有较高的
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图3三重荧光定量PCR检测的敏感性试验A.ALV; B.REV; C.MG Fig.3 The sensitivity results of real-tim e qPCR A.ALV; B.REV;
C.MG
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敏感性。

本研究在同一反应体系中，可以同时检测3 个目标病原，省时省力，实现了对禽用疫苗外源性因 子的快速检测，对禽用疫苗的安全把关具有重要意义。

4结论
综上所述，本研究建立的方法特异性较好、敏感性较高，能够对A L V、R E V和M G进行快速、准确的检测，可以满足生物制品生产中外源病毒A L V、R E V和M G污染的检测要求，也可用于相关疫病的诊断。

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(文章类别：C P S T-A)
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