4.1生物成分的分离与测定技术-课件(苏教版选修1)

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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
②离心沉降法：通过控制离心速率，使得分子 大小、密度不同的蛋白质发生沉降分层。 ③电泳法 a．含义：带电颗粒在电场作用下向着与其电性 相反的电极移动的现象； b．原理：不同物质在同一电场中的__泳__动__速__度__ 不同；
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
例2 在蒸馏过程中，要提高产品质量，应该 采取的措施是( ) A．提高蒸馏温度，延长蒸馏时间 B．提高蒸馏温度，缩短蒸馏时间 C．降低蒸馏温度，缩短蒸馏时间 D．严控蒸馏温度，延长蒸馏时间
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
【思路点拨】 解答本题可以从两个角度分 析： ①温度过高会破坏蒸馏提取物的有效成分。 ②时间过短会使有效成分得不到有效提取。
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
(6)染色后清蛋白中间色浅：染色时间不足，或清蛋 白含量过高，此时可减少检样用量或延长染色时 间。 (7)球蛋白向反方向移动：系电渗现象，可升高点样 端缓冲液液面高度，或适当加大电流量克服之。 (8)透明时若膜不干或透明液中醋酸含量不足，可造 成膜发白，不能完全透明；若透明液中醋酸含量过 高，或室温过高，可使膜溶解，此时可酌情减少醋 酸含量。
A．2.0
B．5.0
C．6.0
D．7.0
解析：选D。在缓冲液的pH为7.0的溶液中，pH 分别为4.5、5.2、6.6的蛋白质均带负电荷，在电 泳时移向正极。
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
比较水蒸气蒸馏、压榨法和 有机溶剂萃取的异同点
实验原理
方法步骤
适用范围
水蒸 气蒸 馏
利用水蒸气 将挥发性较 强的芳香油 携带出来
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
【解析】 用蒸馏法分离植物有效成分时， 温度会影响其性质，如果温度过高则破坏其 结构，温度过低则分离不出其有效成分。如 果在一定温度范围内延长蒸馏时间，就可以 得到较多的植物有效成分。 【答案】 D
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
互动探究 在水蒸气蒸馏装置中，为什么要让冷水由冷 凝管的下方流入，上方流出？ 【提示】 这样可以冷却得更充分。
【答案】 D
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
【探规寻律】 必须清楚泳动速度的差异主 要取决于电荷的多少。所带净电荷越多，则 在电场中泳动的速度越快，反之则越慢。
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
变式训练
1.有一混合蛋白质溶液，各种蛋白质的pH分别 为4.5、5.2、6.6、7.2，电泳时欲使其中三种泳 向正极，缓冲液的pH应该是( )
电泳法、影响电泳泳动速度 的因素、注意事项及容易产 生的几种现象
1.电泳法：带电颗粒在电场作用下向着与其电性相 反的电极移动的现象称为电泳。支持物电泳是目前 纯化蛋白质的一种较为普遍的方法。
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
支持物可以是滤纸、醋酸纤维薄膜、大分子 凝胶等。采用醋酸纤维薄膜作为支持物具有 方法简单、快速、分离清晰、灵敏度高、样 品用量少、没有吸附、点样后区带界限清晰 等优点，广泛应用于科学实验、临床化验和 生化产品的分析(血清蛋白、血红蛋白、糖蛋 白等的分离与鉴定)等方面。
液)抽提 脂溶性蛋白Biblioteka ：用__有__机__溶__剂___抽提
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
2.纯化 (1)原理：蛋白质之间以及蛋白质与其他物质之 间在分子大小、溶解度、__所__带__电__荷__的__多__少___、 吸附性质等方面存在差异。 (2)方法 ①透析法：利用蛋白质分子不能透过__半__透__膜___ 的特性使蛋白质与___其__他__小__分__子__化__合__物____分离 开来。
放有原料
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
(1)水蒸气蒸馏装置的安装顺序和方法
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
如上图所示，整套蒸馏装置可分为左、中、 右三部分，其中左边的部分通过加热进行蒸 馏，中部将蒸馏物冷凝，右边的部分用来接 收。安装仪器一般都按照自下而上、自左到 右的顺序，拆卸仪器的顺序与安装时相反。 具体安装顺序和方法如下： ①固定热源——酒精灯。
使芳香油溶 解在有机溶 剂中，蒸发 溶剂后就可 获得芳香油
①粉碎、干燥 ②萃取、过滤
③浓缩
适用范围广，要 求原料的颗粒要 尽可能细小，能 充分浸泡在有机
溶液中
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
特别提醒 在用萃取法提取芳香油时，由于要将有机溶 剂从萃取液中蒸发出去，故萃取剂的沸点要 比所要提取芳香油的沸点低。
c．泳动特点：带电颗粒直径越小，越接近于球 形，所带净电荷__越__多___，则在电场中的泳动速 度越快；反之，则越慢。
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
判一判
1．(1)常用吸水涨破的方法释放哺乳动物成 熟的红细胞中的蛋白质。(√) (2)通过透析可以去除样品中分子质量较大的 杂质。(×) (3)电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电 性相同的电极移动的现象。(×)
第四章 生物化学与分子生物学技术实践
第四章 生物化学与分子生物 学技术实践
第四章 生物化学与分子生物学技术实践
第一节 生物成分的分离与测定技术
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
学习导航 1.尝试蛋白质的提取和分离。(重点) 2．理解蛋白质分离与纯化的原理。(重难点) 3．研究从生物材料中提取某些特定成分。(重点) 4．尝试测定生物材料中某些化学物质的含量。(难点)
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
判一判
2．(1)水蒸气蒸馏法的基本原理是植物芳香油 易溶于水。(×) (2)蒸馏装置中进水口在上方，出水口在下方。 (×) (3)橘皮油可以通过机械加压、压榨出果皮中的 芳香油进行提取。(√)
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
要点突破•讲练互动
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
三、从生物材料中提取某些特定成分 芳香油特点：具有____挥__发__性__，能与水蒸气一 起蒸发，易溶于__有__机__溶__剂___，如石油醚、乙 醚或___酒__精___等。 橘皮芳香油的特点：橘皮芳香油存在于 __果__皮__的__油__细__胞___中，具有一定的__挥__发__性__， 其沸点___低__于___水的沸点。 植物芳香油提取方法：蒸馏、__萃__取____等。
(2)点样要适量，2次左右即可，盖玻片的边缘 应避免出现明显液滴，点样要尽量在一条直 线上。 (3)电泳时间不低于1 h。 (4)点样处不要搭在滤纸上，以免血清渗入滤 纸。 (5)醋酸纤维薄膜应绷直，避免电泳槽隔离板 的干扰。 (6)不可同时接触正负极，防止触电。
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
3.实验结果分析 呈现5条蛋白质色素带，从点样处一侧开始， 依次是：γ-球蛋白、____β_-球______蛋白、α2-球 蛋白、α1-球蛋白和_____清__蛋__白_。
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
想一想
人们常说的血清蛋白是一种蛋白质吗？说说你了 解的情况。 提示：不是一种蛋白质，而是包含多种蛋白质： 清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球 蛋白。
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
特别提醒 第一步中缓冲液要用容量瓶准确配制，试剂要 多配一些备用。第二步中要驱除气泡，贴紧贴 实，避免影响电泳速度和分离效果。第三、四 步中作有记号的醋酸纤维薄膜光泽面朝下。第 七步中染色时间要适中(5～10 min)，不宜过长 或过短。第八步中漂洗要彻底，防止遮盖蛋白 质色带颜色。
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
二、血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的操作 1.原理 血清蛋白包含一组蛋白质，其大小、形状、所 带净电荷各不相同，在电场作用下会发生 __电__泳______。 2.操作流程 配制试剂→_架__滤__纸__桥___→浸泡薄膜→细心点样 →_平__悬__薄__膜___→实施电泳→___染__色____→漂洗 →脱色。
适用于提取 ①水蒸气蒸馏 玫瑰油、薄 ②分离油层 荷油等挥发 ③除水过滤 性强的芳香
油
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
压榨 法
实验原理
方法步骤
适用范围
通过机械加 压，压榨出 果皮中的芳
香油
①石灰水浸泡、 漂洗
②压榨、过滤 静置
③再次过滤
适用于柑橘、柠 檬等易焦糊原料
的提取
有机 溶剂 萃取
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
②固定蒸馏瓶，使其离热源的距离如上图中 所示，并且保持蒸馏瓶轴心与铁架台的水平 面垂直。 ③安装蒸馏头，使蒸馏头的横截面与铁架台 平行。 ④连接冷凝管。保证上端出水口向上，通过 橡皮管与水池相连；下端进水口向下，通过 橡皮管与水龙头相连。 ⑤连接接液管(或称尾接管)。
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
醋酸纤维薄膜点样的操作流程： 配制试剂 → 架滤纸桥 → 浸泡薄膜 → 细心点样 → 平悬薄膜 → 实施电泳 → 染色 → 漂洗 → 脱色
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
几点说明： (1)膜的预处理：必须于电泳前将薄膜浸泡于 缓冲液中，浸透后，取出薄膜并用滤纸吸去 多余的缓冲液，不可吸得过干。 (2)加样：样品用量依样品浓度、本身性质、 染色方法及检测方法等因素决定。对血清蛋 白的常规电泳分析，每厘米加样线不超过2～ 3 μL，相当于60～80 μg的蛋白质。
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
新知初探•思维启动
一、蛋白质的分离与纯化 1.提取
提取步骤 分离生物组织
破碎细胞
提取方法
机械破碎 __研__磨__法____、超声波法、
酶解法等
抽提：根据蛋白质 的不同特性，选择 不同溶剂进行抽提， 使蛋白质呈溶解状
态释放出来
酸性蛋白质：用__稀__碱__性__溶__液____抽提 水溶性蛋白质：用__透__析__液___ (中性缓冲
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
(3)电泳：可在室温下进行。电压为25 V/cm， 电流为0.4～0.8 mA/cm。 (4)染色：一般蛋白质染色常使用氨基黑和丽春
Schiff试 剂，脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色。 (5)脱色与透明：对水溶性染料应用最普遍的脱 色剂是5%醋酸水溶液。为了长期保存或进行光 吸收扫描测定，可浸入冰醋酸∶无水乙醇＝ 3∶7的透明液中。
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
2.响电泳泳动速度的因素 影响电泳泳动速度的因素很多，其中主要因素 有带电颗粒的性质，即颗粒的大小、形状和所 带净电荷的多少；此外，还有电场强度、溶液 的pH等因素。 3.注意事项 (1)保持醋酸纤维薄膜的清洁，避免用手直接接 触薄膜。
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
例1 (2012·南京高二检测)仔细观察下图，所 带负电荷少的球蛋白是( )
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
A．α1-球蛋白 C．β-球蛋白
B．α2-球蛋白 D．γ-球蛋白
【解析】 对于几种球蛋白来说直径相差不
大，引起泳动速度的差异主要来自于所带电 荷多少，由图可知球蛋白由右向左泳动，因 右侧为负极，且γ-球蛋白距点样处最近，所以 γ-球蛋白所带负电荷最少。
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第四章 生物化学与分子生物学技术实践
从植物材料中提取某些特定 成分
1.蒸馏法：植物芳香油提取的常用方法
蒸馏法的 类型
水中蒸馏
水上蒸馏
水气蒸馏
特点
原料放在 蒸馏容器 的水中， 水要完全
浸没
容器中水 的上方有 筛板，水 量以沸腾 时不浸润 原料为宜
蒸馏容器下方有 一个通气孔，连 接外源蒸气，上 方有筛板，上面
4.容易产生的几种现象 (1)电泳图谱不齐：点样时血清滴加不匀。 (2)电泳图谱出现条痕：点样后薄膜过干，或由于 电泳槽密闭性不良，或电流过大，温度升高，薄 膜水分蒸发干燥造成的。 (3)分离不良：样品滴加过多。 (4)区带拖尾：缓冲液离子强度小于0.05。 (5)区带过于紧密：缓冲液离子强度大于0.075。