基于正交试验的风湿宁胶囊提取纯化工艺研究

2019年
第20卷
第3期
［基金项目］国家科技重大专项重大新药创制项目（2010ZX09102-210）［作者简介］刘培，在读硕士，E-mail ：liupeisxzyydx@ ［通讯作者］段秀俊，副教授，硕士研究生导师，E-mail ：dxjzhyxy@
基于正交试验的风湿宁胶囊提取纯化工艺研究
刘
培，叶
花，董晨虹，王鹏飞，王科，段秀俊
（山西中医药大学，山西晋中030619）
摘要
目的：优选风湿宁胶囊的水提醇沉工艺条件。

方法：采用L 9（34
）
正交试验法，以青藤碱的转移率为考察指标，考察加水量、煎煮时间以及煎煮次数风湿宁胶囊提取效果的影响，优化其水提醇沉工艺参数。

结果：优化的水提醇沉条件为加10倍量水，煎煮时间为1h ，煎煮次数为2次；优化的醇沉条件为煎液浓缩至相对密度为1.1，醇沉时间12h ，含醇量60%。

结论：优选的工艺条件基本合理，可用于风湿宁胶囊的提取与纯化。

关键词青藤碱；风湿宁胶囊；水提醇沉；正交试验中图分类号：R285
文献标识码：Ａ
DOI ：10.19763/ki.1671-0258.2019.03.009
Study on the extraction and purification technology of Fengshining capsules based on orthogonal experiment
Liu Pei ，Ye Hua ，Dong Chenhong ，Wang Pengfei ，Wang Ke ，Duan Xiujun
（Shanxi University of Trditional Chinese Medicine ，Jinzhong Shanxi 030619）
Abstract Objective ：To study water extraction and alcohol precipitation technology of Fengshining capsules.Methods ：The
extraction and purification technological parameters of Fengshining capsules were studied by orthogonal test with the transfer rate of sinomenine as evaluation index.Results ：The conditions were as follows ：add 10times of water to decoct 1hour for 2times ，then concentrated to a relative density of 1.1and alcohol precipitating 12hour with 60%alcohol.Conclusion ：The optimum procedure was reasonable ，which can be used to extract and purify Fengshining capsules.Key words sinomenine ；Fengshining capsules ；water extraction and alcohol precipitation ；orthogonal test
风湿病是一组侵犯关节、骨骼、肌肉、血管及有关软组织或结缔组织为主的疾病，其中多数为自身免疫性疾病，临床上主要表现为慢性、进行性、对称性病理改变。

可能与环境、感染和遗传等因素有关，但其疾病机制尚未完全明确，其发病多较隐蔽而缓慢，病程较长，且大多具有遗传倾向，诊断及治疗均有一定难度。

中医药在治疗风湿病方面有很大优势，近年来，初步阐明了很多中药的有效成分和作用机制，不断涌现出新的治疗药物，在改善患者生活质量、缓解疼痛、减少致残率、减轻药物副作用方面有重要的临床价值和现实意义[1-2]。

风湿宁胶囊为山西省中西医结合医院院内制剂，由羌活、独活、青风藤、威灵仙、片姜黄、防风、川芎、麻黄、肉桂、三棱、血竭、延胡索、川牛膝、熟地黄、砂仁、生姜和甘草17味中药组成，主要用于治疗风寒湿邪痹阻经络所致类风湿性及风湿性关节炎等。

本课题属国家科技部重大专项重大新药创制项目，前期课题组已经对风湿宁胶囊对风寒湿痹型类风湿性关节炎[3-7]、胶原诱导关节炎[8-10]
的抗炎作用及机制做了大量研究，同时课题组对风湿宁胶囊的质量标准做了研究，建立了独活、青风藤、血竭及肉桂的薄层鉴别方法以及青风藤及血竭含量的测定方法[11]。

风湿宁胶囊中除血竭外的16味药水煎液均具有不同程度的抗炎、镇痛或免疫抑制等与治疗风湿性关节炎相应的药理活性[12-17]，故16味药的提取方法选择了水煎煮，含挥发性成分的药材先采用水蒸汽蒸馏法收集挥发油[18]，血竭粉碎入药。

为减少服用量，工艺纯化选择了醇沉淀法。

采用正交试验法对风湿宁胶囊的水提醇沉工艺条件进行优选，现将研究结果报道如下。

1仪器与试药1.1实验仪器
Dionex 高效液相色谱仪，PDA-100Photodiode
Array Detector 检测器，ASI-100Automated Sample
Injector ，Chromeleon 6色谱工作站，DiamonsilC18（2）（150mm ×4.6mm ，5μm ）色谱柱；METTLER
TOLEDO AB135-S 型十万分之一天平，HANPING
中药制剂工程与技术
2019Vol.20No.3
FA2104型万分之一电子天平；SB-5200DTDN超声波清洗器（宁波新艺生物科技股份有限公司），容量瓶，锥形瓶。

1.2药材与试剂
青风藤为防己科植物青藤Sinomenium acutum （Thunb.）Rehd.et Wils.的干燥藤茎，羌活为伞形科植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang 的干燥根茎及根，独活为伞形科植物重齿毛当归Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan 的干燥根，川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，威灵仙为毛茛科植物威灵仙Clematis chinensis Osbeck的干燥根茎及根，防风为伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata Schischk.的干燥根等，以上药材均由山西中医药大学裴香萍副教授鉴定为正品。

青藤碱（批号0774-200206，供含量测定用）化学对照品购自中国药品生物制品检定所。

色谱测定用甲醇为色谱纯，水为纯净水，其他所用试剂均为分析纯。

2方法
2.1青藤碱的含量测定方法
2.1.1色谱条件色谱柱：DiamonsilC18（2）柱（150 mm×4.6mm，5μm），流动相：甲醇-0.1%三乙胺（35∶65）；检测波长262nm；柱温30℃[11]。

2.1.2对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的对照品青藤碱，加甲醇制成每1mL含0.05mg 的溶液，摇匀，0.45μm的滤膜滤过，即得。

2.1.3供试品溶液的制备取提取物干浸膏粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%的甲醇溶液20mL，超声处理20min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。

2.1.4测定法分别精密吸取上述两种溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定。

色谱图见图1。

2.2工艺条件考察[19-22]
2.2.1提取工艺条件考察选择青藤碱作为考察对象，以青藤碱转移率为考核指标，选择加水量、煎煮时间以及煎煮次数作为考察因素，每个因素选择了3个水平（因素水平设定见表1），采用L9（34）正交表安排实验。

适量，按上述最佳煎煮工艺条件，加水煎煮，合并煎液，平均分成9份，仍以青藤碱转移率作为考察指标，对影响醇沉效果的3个主要因素药液的浓缩程度、醇沉浓度以及醇沉时间进行考察，每因素设定3水平（因素水平设定见表2），仍采用L9（34）正交表安排实验。

3结果与分析
3.1提取工艺条件的优选结果与分析
按处方比例称取各药味适量，共9份，按照正交表设定的试验条件分别进行煎煮，将所得煎液浓缩至稠膏，烘干。

测定干膏中青藤碱的含量，计算转移率，结果见表3、表4。

从统计分析结果看，A为不显著因素，Ⅱ>Ⅰ>Ⅲ；B为不显著因素，Ⅱ>Ⅰ>Ⅲ；C为显著性因素，且Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ。

即A2B2C2为最佳方案，而从实际试验结果看A2B3C2应为最佳方案。

将两种方案各重复试验3次，从试验结果看两者差异无统计学意义
，表1提取工艺考察因素水平表
水平加水量A(倍)煎煮次数B(次)煎煮时间C(h) 1810.5 2102 1.0 3123 1.5
表2纯化工艺考察因素水平表
水平浓缩程度A醇沉浓度B(%)醇沉时间C(h) 11∶16012 21∶1.057024 31∶1.18036
图1风湿宁胶囊青藤碱测定液相色谱图
中药制剂工程与技术
2019年
第20卷
第3期
表5纯化正交试验结果
试验号因素
青藤碱转移率
(%)A B C 空列1111161.102122241.913133345.104212345.215223138.976231235.607311263.148323361.559332147.74
Ⅰ148.11169.45158.27147.81Ⅱ119.78142.45134.86140.65Ⅲ172.45128.44147.21151.88Ⅰ49.3756.4852.4149.27Ⅱ39.9347.1344.8546.88Ⅲ57.1342.8149.0750.28R 7.9413.677.46 3.40SS
445.52
292.95
83.63
18.22
注：α=0.01时，F 0.01(2,2)=99.00；α=0.05时，F 0.05(2,2)=19.00
变异来源离均差平方自由度均方F 值显著性
A 445.522222.7624.45
B 292.952146.4716.08
C 83.63241.82 4.59误差18.2229.11P <0.05
表6纯化方差分析结果
表3提取工艺考察正交试验结果
试验号因素
青藤碱转移率
(%)A B 空列C 1111124.892122259.403133347.114212362.175223155.926231265.227311250.278323359.299332112.89
Ⅰ131.40137.33149.4093.70Ⅱ183.31174.61134.46174.89Ⅲ122.45125.22153.30168.57Ⅰ43.7045.7849.8031.23Ⅱ61.1058.2044.8258.30Ⅲ40.8241.7451.1056.19R 20.2816.46 6.2827.07SS
719.85
441.74
65.931
359.70
注：α=0.01时，F 0.01(2,2)=99.00；α=0.05时，F 0.05(2,2)=19.00
方差来源离均差平方和自由度方差F 值显著性
A 719.852359.9310.92P <0.05
B 441.742220.87 6.70
C 1359.702679.8520.62误差65.93232.97表4提取工艺考察方差分析结果
故从省时节能的角度选择A 2B 2C 2为最佳方案。

3.2纯化工艺条件的优选结果与分析将所得药液回收乙醇，浓缩至稠膏，烘干。

测
定各干膏中青藤碱的含量，计算转移率，结果见表
5、表6。

从统计分析结果看，A 为显著因素，Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ；B
为不显著因素，Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ；C 为不显著因素，Ⅰ>Ⅲ>Ⅱ，即A 3B 1C 1为最佳组合。

实际试验结果也是A 3B 1C 1
为最佳组合。

故选择A 3B 1C 1为最佳方案。

4讨
论
研究结果表明，水煎煮最佳工艺条件为加水量
10倍，煎煮时间为1h ，煎煮次数为2次，青藤碱转
移率约65%；醇沉淀最佳工艺条件为浓缩至1∶1.1，醇沉浓度为60%，时间为12h ，青藤碱转移率约63%，中试验结果表明，优选的工艺条件基本合理。

曾考虑采用多指标手段对工艺条件进行筛选，初步考虑以羌活与防风中所含紫花前胡苷、威灵仙中所含常春藤皂苷元及青风藤中所含青藤碱的综合转移率优选最佳工艺条件，这样可以兼顾各类成分的提取率。

但由于本处方药味多，实验中除青藤碱外，紫花前胡苷与常春藤皂苷元均难以排除干扰，故选择青藤碱作为工艺考察指标。

水提醇沉淀的工艺路线是通过药效试验结果确定的，其抗炎止痛效果较优。

本实验结果为风湿宁胶囊的制剂开发应用提供了实验依据。

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2019年
第20卷
第3期
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（编辑：梁葆朱）
（上接第187页）
凉的秋冬季节，主要病机为外感风寒之邪，机体素虚或失治误治，未能及时散寒祛邪，而外邪留滞，久则内生寒痰，上客于肺，致使肺失宣肃，故久咳不愈，其证属虚实夹杂，传统祛邪化痰止咳之法效果不佳，需用和解之法治疗。

根据临床经验采用柴金饮治疗PIC ，本方以小柴胡汤合金水六君煎化裁而成，以“和法治疗痰饮”为理论依据，治疗感染后咳嗽既能和解表里之外邪，又能温化寒饮以止咳平喘，宣散与敛降同用，攻邪而不伤正，达到理气化痰而咳喘自止的目的。

上述二方均是中医“和法”的著名代表方剂，现代药理学发现小柴胡汤具有改善细胞免疫的作用[6]；《景岳全书·新方八阵·和阵》原文记载金水六君煎用于“治肺肾虚寒，水泛为痰，或年高阴虚，气血不
足，外感风寒，咳嗽呕恶，多痰喘急等证，神效”[7]，
张景岳解释“病有在虚实气血之间，补之不可，攻之又不可，欲得其平，须从缓治”，此意与张仲景所诫之“病痰饮者当以温药和之”相合，而且与PIC 的“虚实夹杂”之“不可攻，又不可补”的病机甚合；现代药理学研究认为金水六君煎可改善慢
性呼吸道炎症患者体内氧化与抗氧化平衡紊乱状态，清除自由基对机体的损伤，维持自由基产生和清除的平衡状态[8]。

本研究采用柴金饮联合常规西药与单纯西药组对照治疗PIC ，通过治疗前后LCQ 生理、心理、社会各部分积分及总积分相比较可知，在改善患者各项积分方面，治疗组明显优于对照组；同时在治疗前后两组患者LCQ 积分差值比较可知，治疗后治疗组积分升高幅度明显高于对照组。

结果表明，柴金饮能有效缓解PIC 患者临床症状，从而改善患者生活质量。

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（编辑：翟春涛）
临床研究与经验。