纸层析法分离氨基酸

纸层析法分离氨基酸
一、前言
1、分离氨基酸的主要方法：
(1) 离子交换法，根据氨基酸是两性电解质这一特征,以及目的氨基酸与杂质氨基酸pK、pI值的差异,利用离子交换树脂对各种氨基酸吸附能力的不同对氨基酸进行分离纯化。

离子交换法的分离步骤主要包括树脂的处理、装柱、平衡、加样、洗脱等步骤. 离子交换法也有自身的局限性，由于离子交换法是利用氨基酸等电点的不同，所以当两个或者多个氨基酸的等电点相近时，便无法分离，另外，氨基酸在树脂当中扩散速度较快，就要求料液的流速也相对较慢，这样自然造成了分离的缓慢，离子交换本身的生产原理也决定了反应难以连续还进行，这给工厂自动化生产带来影响，难以大规模地推广。

(2) 沉淀法，沉淀法是历史最悠久的分离纯化方法，目前仍在工业上发挥着重大的作用。

氨基酸工业中常用沉淀法有等电点沉淀法，特殊试剂沉淀法和有机溶剂沉淀法。

沉淀法原理是根据某些氨基酸可以与某些有机或者无机化合物结合而形成沉淀，可以利用这种性质向溶液中加入特定的沉淀剂，使目标氨基酸沉淀，与其他氨基酸分离，在分离后再将氨基酸与沉淀剂分离即可。

现在较为成熟的分离方法有精氨酸与苯甲醛在低温条件下，缩合成溶解度小的苯亚甲基精氨酸，从而析出沉淀，析出的沉淀用盐酸处理即可分离得到目标氨基酸精氨酸的盐酸盐；亮氨酸与邻-二甲苯-4-磺酸反应，可生成亮氨酸的磺酸盐。

沉淀法的优点是方法简单，选择性强，但是缺点同样明显，沉淀剂回收困难，造成废液排放污染加剧。

(3) 萃取法，萃取法主要包括反应萃取法、溶剂萃取法、反向微胶团萃取、液膜萃取法等。

其中，反应萃取法是选择适当的萃取剂，使萃取剂解离出来的离子与氨基酸解离出来的离子发生反应，生成可以溶于有机相的物质，从而使氨基酸从
水相进入有机相，进而分离氨基酸。

溶剂萃取法，由于氨基酸是离子型化合物，氨基酸在物理萃取时难以高效提取的，因此常用化学发来萃取氨基酸。

(5) 电透析，由于氨基酸拥有不同的等电点，故可以通过控制溶液的PH值，使氨基酸带有正负电荷，即当PH大于等电点时，带有负电荷，将氨基酸放置在电场中，会带上负电，并且移向正极，相反，PH值小于等电点时，则带上正电荷，氨基酸向负极移动。

电透析主要有毛细电透析等方法，通过这种方法可以高效而精确地分离氨基酸。

2、纸层析法的优缺点：
（1）优点：操作简单，便于掌握；显色均匀，便于定量和半定量分析。

(2)缺点：显色剂印三酮要现配，且易被空气氧化，显色后很快就会褪色。

Rf 值得大小与物质的结构性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度有关。

二、实验目的
1、掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸上层析的操作技术（包括点样、平衡、展层、显色、鉴定）
2、学习未知样品的氨基酸成分（水解、层析及鉴定）分析的方法
三、实验原理
1、纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。

滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。

当有机相流经固定相时，物质在两想间不断分配而得到分离。

2、溶质在滤纸上的移动速度用比移Rf值表示
3、Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离
4、在一定条件下的某种物质的Rf值是常数。

Rf值得大小与物质的结构性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。

本实验利用纸上层析法分离氨基酸。

四、实验材料与试剂
1、实验试剂:
a.氨基酸标准溶液（1mg/ml）亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准溶液
b.80%甲酸
c.0.1%印三酮丙酮溶液
d.氨基酸混合液（每种氨基酸500mg/ml）
e.正丁醇
2、实验器材：
a.新华滤纸
b.培养皿
c.电热鼓风干燥箱
d.吹风机
e.毛细管
f.针线尺
g.钟罩
五、实验操作
A、滤纸：选用国产新华1号滤纸，6cm×7cm.在距滤纸2cm处划线，用铅笔在标四个点作为点样位置（留出缝线空间）。

B、点样：点样要合适，斑点易扩散或拉长，以致分离不清。

用毛细管吸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这样样品就会自动流出。

点样的扩散直径应控制在0.5cm之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再滴第二滴。

将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状，注意缝线处纸的两边不要接触。

避免由于毛细现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。

C、展层：将揉成筒状的滤纸放入培养皿中（注意滤纸不要皿壁），当溶剂层展至距离纸的上沿约1cm时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿位置
酸溶剂系统：正丁醇:80%甲酸：水=15:3:2（体积比），印三酮2ml，温度25℃，时间1h.
注意：使用的溶剂系统需新鲜配置，并要摇匀。

D、显色：待展层基本结束后，置于65℃烘箱中10-20min，鼓风保温，滤纸上即显出紫红色或黄色斑点。

E、Rf值的计算：用尺测量显色斑点的中心与原点的之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求出此值，记得氨基酸的Rf值。

六、注意事项
使用印三酮显色时，必须在整个过程中避免用手直接接触层析纸，因为手上常常含有少量的含氮物质。

显色时它也显现出紫色斑点。

污染了层析结果，因此在操作过程中应戴橡胶手套或指套。

同时也要防止空气中的氮。

7、数据处理
混合氨基酸中有三个显色斑点，颜色分别是紫红、黄色、紫红。

斑点中心距原点分别为2.0cm,3.7cm,6.5cm.
而亮氨酸、甘氨酸、脯氨酸与印三酮反应后显色正是紫红、黄色、紫红，再根据他们斑点中心到原点的距离，因此可以判断出混合氨基酸中含有亮氨酸、甘氨酸、脯氨酸。

八、思考与讨论
1、结果分析:滤纸斑点显色明显、清晰，无污点，实验结果理想，能准确、快速地计算出各种氨基酸的Rf值和判别出混合氨基酸的成分。

2、思考题:
a.为什么展层有时用两种溶剂系统，有时用一种溶剂系统?
答：有些化学成分在不同的极性下的溶解度不同，在层析中一样，只有不停变换极性，才能使不同的化学成分从混合物中分离出来。

b.酸性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离有何影响？
答：有利于氨基酸的碱式电离，不利于氨基酸的酸式电离。

c. 酸性溶剂系统对Rf值的影响？
答：极性方面，溶剂极性增加，物质的Rf变大。

增加酸碱，也就是增大了溶剂的极性。

从而提高物质的Rf。

PH值影响，氨基酸的解离度与PH 有关，解离度越大极性越强，极性强的物质在两相分配时，偏向极性的一项。

氨基酸解离度越大，Rf越小。

你往溶剂系统中对于加入碱，对于酸性氨基酸来说，羧基会更多的解离，自然Rf降低（这个效果会很明显）。

而对于碱性氨基酸的盐溶液来说，解离度降低，Rf增大。

你往溶剂加酸，对于酸性氨基酸来说，羧基变化不大，氨基接受质子更多解离，Rf降低。

对于碱性氨基酸，解离度增大，Rf也减小。

d.什么是分配系数？
答: 在平衡状态下，组分在固定液与流动相中的浓度之比。

九、参考与致谢
1、参考文献:生化实验教材、学长准备的ppt，百度文库，《氨基酸分离和提纯方法及运用》、《几种分离氨基酸方法的比较》
2、感谢:本次实验的成功除了本人课前认真的预习和做实验时准确无误的操作，还离不开老师的细致讲解和不断提醒，学长准备好的实验材料和仪器，还有郭月山同学在划线时的帮助，尚情情同学的缝线帮助。

再次，一并致谢！
实验名称：纸上层析分离氨基酸
班级：生物工程131 指导老师：吴兰
实验者：张文波学
号:5602211016
实验日期：2014.10.28
南昌大学。