黄腐酚抑制炎症信号缓解大鼠关节炎痛的机制研究

黄腐酚抑制炎症信号缓解大鼠关节炎痛的
机制研究*
王
钦， 谢
敏， 王柏军△
（湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100）
［摘
要］ 目的：研究黄腐酚（Xn ）对大鼠关节炎疼痛的作用及机制。

方法：将30只雄性Sprague -Dawley 大
鼠随机分成3组（每组10只）：对照组、关节炎疼痛模型［左后膝关节内注射完全弗氏佐剂（CFA ）］组（CFA 组）和CFA+Xn （5 mg/kg 鞘内注射）组。

记录大鼠痛觉行为及运动能力的变化；分子对接分析Xn 与糖原合成酶激酶3β（GSK -3β）的作用关系；免疫荧光和Western blot 法分析大鼠脊髓组织中GSK -3β的表达及活性、星形胶质细胞激活状态、核因子κB （NF -κB ）信号及白细胞介素1β（IL -1β）表达水平；ELISA 法检测大鼠血清IL -1β和肿瘤坏死因子α（TNF -α）水平。

结果：与对照组相比，CFA 注射诱导大鼠自发缩足次数增加，机械痛阈值下降，运动能力受损（P <0.05）；脊髓组织中磷酸化GSK -3β、星形胶质细胞标志物胶质细胞原纤维酸性蛋白（GFAP ）、NF -κB 和IL -1β表达水平均显著升高（P <0.05）；血清中IL -1β和TNF -α水平上调。

与CFA 组相比，Xn 鞘内给药减少大鼠自发缩足次数，上调机械痛阈值，增加转棒停留时间和运动距离（P <0.05）；分子对接分析显示Xn 可抑制GSK -3β活性；Xn 给药显著降低脊髓组织磷酸化GSK -3β、GFAP 、NF -κB 和IL -1β蛋白水平（P <0.05），以及血清中IL -1β和TNF -α水平（P <0.05）。

结论：Xn 可能通过降低GSK -3β活性抑制炎症信号，从而缓解大鼠关节炎疼痛。

［关键词］ 关节炎痛；黄腐酚；炎症；糖原合成酶激酶3β；大鼠
［中图分类号］ R593.22； R363 ［文献标志码］ A doi ： 10.3969/j.issn.1000-4718.2023.06.014
Xanthohumol relieves arthritis pain in rats by inhibiting inflammatory
signals
WANG Qin ， XIE Min ， WANG Bojun △
（School of Pharmacy ， Hubei University of Science and Technology ， Xianning 437100， China. E -mail ： 172752661@ ）
［ABSTRACT ］ AIM ： To explore the effect of xanthohumol （Xn ） on arthritis pain in rats and its mechanism. METHODS ： Sprague -Dawley rats were randomly divided into three groups （10 rats per group ）： control group ， complete Freund´s adjuvant （CFA ） group ， and CFA+Xn group. A CFA mouse model was established through intra -articular injec‑tion with 10 μL CFA into the left hind knee joint ， and Xn （5 mg/kg ） was then intrathecally injected into the rats. Pain be‑havior and motor ability changes in the rats were recorded. Auto -dock was used for analyzing the binding between Xn and glycogen synthase kinase 3β （GSK -3β）， while immunofluorescence and Western blot analysis were used for detecting the expression and activity of GSK -3β， astrocyte status ， nuclear factor -κB （NF -κB ） level ， and interleukin -1β （IL -1β） ex‑pression in the spinal cord tissue of the rats. ELISA was used for measuring the serum levels of IL -1β and tumor necrosis factor -α （TNF -α）. RESULTS ： Compared with control group ， treatment with CFA increased the number of flinches ， de‑
creased the mechanical threshold ， and impaired motor ability （P <0.05）. The levels of phosphorylated GSK -3β， astrocyte marker glial fibrillary acidic protein （GFAP ）， NF -κB ， and IL -1β were increased in the spinal cords of the rats in CFA group （P <0.05）. The serum levels of IL -1β and TNF -α were up -regulated in CFA group （P <0.05）. Compared with CFA group ， intrathecal administration of Xn reduced the number of spontaneous foot contractions ， up -regulated mechanical pain threshold ， and increased stay time and motor distance of the rotating rod （P <0.05）. Molecular docking analysis found Xn to inhibit GSK -3β activity. Compared with CFA group ， Xn administration significantly attenuated serum inflam‑［文章编号］ 1000-4718（2023）06-1070-07
［收稿日期］ 2023-02-27 ［修回日期］ 2023-05-12
* ［基金项目］ 国家自然科学基金青年基金资助项目（No. 81901149）；湖北科技学院校级团队项目（No. 2020TD02）△通讯作者 Tel ：135****7940： E -mail ： 172752661@
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mation in the rats （P<0.05）， and significantly reduced GSK-3β activity and the expression levels of GFAP， NF-κB and IL-1β （P<0.05）.CONCLUSION：Xanthohumol inhibits NF-κB/IL-1β inflammatory signaling by blocking GSK-3β，thus alleviating arthritis pain in rats.
［KEY WORDS］arthritis pain； xanthohumol； inflammation； glycogen synthase kinase-3β； rats
骨关节炎是一种影响整个关节功能的退行性疾病，主要特征是关节中生物力学和生化变化导致的软骨损伤及修复失败，从而引发关节活动困难和疼痛［1］，常见于手、膝、髋和脊柱关节，其症状包括关节僵硬、肿胀和疼痛，影响全世界数百万人［2］。

关节结构破坏和损伤诱发大量疼痛相关免疫因子产生、激活炎症反应并激活外周伤害性信号，这些信号被传递到脊髓背角，引发中枢敏化，导致病理性疼痛［3］。

中枢敏化的一个重要特征为神经炎症激活，包括胶质细胞活化和炎症介质产生增加［4］。

研究发现，小鼠关节炎病变进程中，脊髓白细胞介素1β（interleu‑
kin-1β， IL-1β）过度表达并伴有疼痛样行为［5］。

使用IL-1受体拮抗剂（interleukin-1 receptor antagonist， IL-1RA）可通过抗炎机制缓解关节炎模型动物的疼痛样行为［6］。

因此，抑制神经炎症可作为治疗关节炎疼痛的有效措施。

黄腐酚（xanthohumol， Xn）是一种异戊二烯基黄酮类物质，存在于啤酒花植物中，具有抗炎特性［7］。

研究表明Xn可通过降低肝细胞中促炎因子表达、下调核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）信号活性、从而在非酒精性脂肪肝炎模型大鼠中发挥保护作用［8］。

同时，Xn给药抑制巨噬细胞中促炎因子IL-1β和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）表达［9］。

此外，Xn抑制TNF-α和IL-6的表达并减缓模型动物关节炎进展［10-11］。

目前，Xn在关节炎疼痛中的作用靶点及机制尚不明确。

因此，在本研究中，构建了关节炎大鼠模型并进行Xn鞘内给药处理，进而检测大鼠行为学、脊髓和血清中炎症信号的变化，旨在探究Xn在关节炎疼痛中的作用及机制，并为Xn 作为关节炎疼痛的镇痛药物开发提供实验数据。

材料和方法
1　实验动物及分组
本实验使用的SPF级雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠共30只，体重180~200 g，6~8周龄，购于湖北省实验动物中心，动物合格证编号为42000600043734。

动物饲养在室温（22±2） ℃，12 h光照/12 h黑夜的昼夜节律交替的房间中，并提供适量的食物和水。

将大鼠随机分为3组：对照组、模型组和Xn给药组，每组10只。

本实验所有动物程序得到了湖北科技学
院实验动物伦理委员会批准（No. 2021-05-981）。

2　主要试剂及仪器
蛋白酶抑制剂、RIPA裂解液（BL504A）、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒（P0012AC）、完全弗氏佐剂（complete Freund´s adjuvant， CFA； P2036）和BCA 蛋白浓度测定试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司；Xn（B20557）购于上海源叶生物科技有限公司；特超敏ECL化学发光底物试剂盒（货号：BL520A）购于Biosharp；IL-1β与TNF-α ELISA试剂盒购于ABclonal。

本实验所用Ⅰ抗：购于Affinity的抗GSK-3β（BF8003）、抗NF-κB（BF8005）和抗IL-1β（AF5103）；购于ABclonal的抗phospho-GSK-3β-Y216（AP0261）和抗GFAP（A19058）。

本实验所用Ⅱ抗：购于ABclonal的HRP标记山羊抗兔IgG和HRP标记山羊抗鼠IgG；购于Abcam的山羊抗鼠IgG H&L （FITC）（ab6785）和山羊抗兔IgG H&L（FITC）（ab6717）荧光Ⅱ抗。

石蜡切片机（Leica，型号：RM2165）；微型垂直电泳仪（北京韦克斯科技有限公司，型号：EP300）；迷你手持均质仪（北京兰杰柯科技有限公司，型号：L-C119-0502）；荧光倒置显微镜（Olympus，型号：IX73P1F）；凝胶成像分析系统（GE，型号：29-0050-63）。

3　主要方法
3.1　模型建立及分组处理　实验正式开始时，将CFA在生理盐水中1∶1稀释。

采用戊巴比妥钠麻醉，先于左后肢进行剔除毛发后用75％的乙醇消毒左后肢，使用无菌微量注射器向大鼠左后肢膝关节内缓慢注入CFA混悬液（40 μL），结束后用碘伏消毒伤口［12］。

造模14 d后，对模型组大鼠予5 mg/kg Xn鞘内给药［12-13］，具体方法如下：大鼠背部剃毛后并用碘伏消毒，使用25 μL微量注射器在L5~L6脊椎棘突间垂直进针，当感受进针出现落空感，表明针头已达蛛网膜下腔，将注射器缓慢倾斜45°方向缓缓注入5 μL 药物，注射完成后缓慢拔出注射器，按压注射位点1 min［14］。

对照组大鼠左后肢膝关节内注射相同体积（40 μL）的生理盐水。

3.2　大鼠自发缩足反射次数（flinches）记录　将大鼠置于30 cm×30 cm×30 cm的透明玻璃盒内，实验过程中保持环境安静。

实验开始前，将大鼠放入玻璃
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盒中适应30 min，实验过程中观察并记录每5 min内大鼠自发性缩足（或舔爪）反射次数，记录3次，计算其缩足反射平均值［15］。

3.3　50%机械缩足阈值（paw withdrawal threshold，PWT）检测　将动物放置于30 cm×30 cm×30 cm的透明正方体玻璃盒内，实验过程中保持室内环境安静。

实验开始前，将SD大鼠放入玻璃盒中适应30 min，待大鼠适应30 min后，用von Frey纤维（0.4~26 g）垂直剌激大鼠左侧后肢足底正中，持续时间≤5 s，出现舔足或者抬足等行为视为阳性反应，反之则为阴性反应。

记录6次数据后结束检测。

根据公式PWT= 10Xf+Kδ/10 000计算各组大鼠的缩足阈值［16］。

3.4　转棒运动实验　正式实验开始前每天将大鼠放在转棒仪器上以匀速5 r/min的速度适应10 min，间隔休息30 min，重复3次。

正式实验时以10 r/min 运动10 s，匀加速10 s，以10 r/min运动30 s，匀加速10 s，以20 r/min运动9 min。

记录实验动物运动的距离（distance）和在转棒上停留的时间（latency）［17］。

3.5　分子对接　PDB数据库（https：//www.rcsb. org/）下载GSK-3β蛋白（ID为2o5k）结构；Pubchem数据库（https：///）下载Xn二维结构； ChemBio3D优化Xn；Autodock_vina将GSK-3β和Xn对接；OpenBabel （v2.3.1） 39分离文件，添加氢键并分配可旋转键和电荷；PDBQT进一步对接；PyMOL可视化对接结果。

3.6　Western blot法检测脊髓组织蛋白质表达　过量麻醉剂处死大鼠，分离腰段脊髓，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液进行组织匀浆，4 ℃、13 523×g 离心15 min后取上清，加入上样缓冲液，98 ℃沸水中加热10 min变性。

样品蛋白质浓度用BCA蛋白分析试剂盒进行检测。

SDS-PAGE分离蛋白质样品，将蛋白质电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭90 min。

加入Ⅰ抗（抗GSK-3β、抗NF-κB、抗IL-1β、抗p-GSK-3β和抗GFAP，均1∶1 000），4 ℃孵育过夜［18］。

之后洗膜3次，并用Ⅱ抗室温孵育1 h，然后用LAS500凝胶成像系统扫描观察，ImageJ软件分析条带灰度值。

3.7　免疫荧光　大鼠深度麻醉后经心脏灌流固定，解剖剥离脊髓组织，脱水与石蜡包埋。

石蜡切片厚度为4 μm。

组织切片脱蜡，抗原修复20 min，免疫染色封闭液封闭，Ⅰ抗（抗NF-κB、抗IL-1β、抗p-GSK-3β和抗GFAP，均1∶100）孵育过夜，免疫荧光Ⅱ抗室温孵育1 h，漂洗，封片，荧光显微镜下拍照。

3.8　ELISA实验　将大鼠深度麻醉后，选择胸部左侧心脏博动最强处进针，缓慢回抽针筒可见血液流
入针管，将抽取的血液样品放入提前倒入带有肝素钠润滑EP管内，4 ℃、1 006×g离心10 min。

取上清置于另一根EP管中，−20 ℃冷冻保存。

ELISA操作参照说明书，基本如下：对倍稀释标准品液，将样本稀释，使得其浓度不超过试剂盒标准范围。

将样品稀释液100 μL加入空白孔中，将标准品液100 μL加入标准品孔中，将样本液100 μL加入待测孔中，轻混匀后37 ℃孵育90 min，然后加入酶结合工作液，孵育
30 min，洗板5次加入显色底物后37 ℃放置15 min后测得浓度。

4　统计学处理
GraphPad Prism 9.3.1进行统计学分析。

数据资料以均数±标准差（mean±SD）表示。

多组数据比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。

以P< 0.05为差异有统计学意义。

结果
1　Xn显著改善动物行为学
与对照组相比，模型组大鼠自发性缩足次数显著增加（P<0.05），PWT值显著降低（P<0.05），运动距离显著减少（P<0.05），停留时间显著下降（P< 0.05）；Xn给药显著减少大鼠自发缩足次数（P< 0.05），升高PWT值（P<0.05），增长运动距离（P< 0.05），增加转棒停留时间（P<0.05），见图1。

2　Xn降低关节炎大鼠脊髓GSK-3β磷酸化水平分子对接结果显示，Xn可与GSK-3β第67、141和200位的苯丙氨酸、精氨酸和天冬氨酸分别形成2个离子键和1个氢键，键长分别为1.9、2.0和2.6 Å，对接能量为−7.8 kcal/mol，见图2。

免疫荧光结果显示，模型组大鼠脊髓背角处磷酸化GSK-3β-Y216（p-GSK-3β）的荧光强度显著高于对照组（P<0.05）；Xn给药组大鼠脊髓背角p-GSK-3β荧光强度显著低于模型组（P<0.05），见图3A。

同时Western blot结果表明，模型组大鼠脊髓组织中p-GSK-3β蛋白水平显著高于对照组（P<0.05）；Xn给药组大鼠脊髓p-GSK-3β水平显著低于模型组（P< 0.05），见图3B。

3　Xn抑制关节炎大鼠脊髓星形胶质细胞激活免疫荧光结果显示，模型组大鼠脊髓背角中星形胶质细胞标志物GFAP荧光强度显著高于对照组（P<0.05）；Xn给药组大鼠脊髓背角处GFAP荧光强度显著低于模型组（P<0.05），见图4A。

Western blot 结果显示，模型组大鼠脊髓组织中GFAP表达量显著高于对照组（P<0.05）；Xn给药组大鼠脊髓GFAP表达量显著低于模型组（P<0.05），见图4B。

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Figure 1.　Effect of xanthohumol （Xn ） on pain behavior and motor ability of complete Freund´s adjuvant （CFA ）-treated rats. A and
B ： detection of spontaneous pain （flinches ） and mechanical pain threshold （PWT ） in rats after surgery ；
C and
D ： changes in the distance and latency of the rotating rod test. Mean±SD. n =10. *P <0.05 vs control group ； #P <0.05 vs CFA group.
图1
　黄腐酚对关节炎大鼠行为学的影响
Figure 2.　Diagram of the binding between xanthohumol （Xn ） and GSK -3β. Green color presents Xn ， blue color presents GSK -3β， red color presents the residues of GSK -3β binding with Xn.
图2　黄腐酚和GSK -3β
结合的示意图
Figure 3.　Effect of xanthohumol （Xn ） on spinal GSK -3β activation in complete Freund´s adjuvant （CFA ）-treated rats. A ： representa‑
tive fluorescence images and relative fluorescence intensity of p -GSK -3β in spinal dorsal horn （scale bar=20 μm ）； B ： rep‑
resentative Western blot bands and relative gray values of p -GSK -3β in spinal cord. Mean±SD. n =5. *P <0.05 vs control
group ； #P <0.05 vs CFA group.
图3　黄腐酚对关节炎大鼠脊髓GSK -3β活化的影响
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4　Xn 减弱关节炎大鼠脊髓NF -κB/IL -1β信号免疫荧光结果显示，模型组大鼠脊髓背角NF -
κB 和IL -1β荧光强度显著高于对照组（P <0.05）；Xn 给药组大鼠脊髓背角NF -κB 和IL -1β荧光强度显著低于模型组（P <0.05），见图5A 。

Western blot 结果显
示，模型组大鼠脊髓组织中NF -κB 和IL -1β表达量显著高于对照组（P <0.05）；Xn 给药组大鼠脊髓NF -κB 和IL -1β表达量显著低于模型组（P <0.05），见图5B。

Figure 4.　Effect of xanthohumol （Xn ） on spinal astrocytic activation in complete Freund´s adjuvant （CFA ）-treated rats. A ： represen‑
tative fluorescence images and relative fluorescence intensity of GFAP in spinal dorsal horn （scale bar=20 μm ）； B ： repre‑sentative Western blot bands and relative gray values of GFAP in spinal cord. Mean±SD. n =5. *P <0.05 vs control group ；
#
P <0.05 vs CFA group.
图4
　黄腐酚对关节炎大鼠脊髓星形胶质细胞活化的影响
Figure 5.　Effect of xanthohumol （Xn ） on NF -κB/IL -1β signaling in spinal cord of complete Freund´s adjuvant （CFA ）-treated rats.
A ： representative fluorescence images and relative fluorescence intensity of NF -κ
B and IL -1β in spinal dorsal horn （scale bar=20 μm ）； B ： representative Western blot bands and relative gray values of NF -κB and IL -1β in spinal cord. Mean±
SD. n =5. *P <0.05 vs control group ； #P <0.05 vs CFA group.
图5　黄腐酚对关节炎大鼠脊髓NF -κB/IL -1β信号的影响
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5　Xn降低关节炎大鼠血清炎症因子水平ELISA结果，模型组大鼠血清IL-1β和TNF-α水平显著高于对照组（P<0.05）；Xn给药组大鼠血清IL-1β和TNF-α水平显著低于模型组（P<0.05），见图6。

讨论
本研究显示，Xn降低GSK-3β磷酸化并缓解大鼠关节炎痛。

GSK-3β是一种糖原合成激酶，是潜在的病理性疼痛治疗靶点［19］。

Y216位点是GSK-3β活性位点，该位点磷酸化水平表征GSK-3β活性［20］。

研究表明，在多种病理性疼痛（包括炎症痛、坐骨神经慢性损伤痛、骨癌痛）模型动物中，脊髓GSK-3β激酶活性增强［21-23］；其抑制剂AR-A014418［21］或TDZD-8［23］给药降低动物机械痛敏。

同时，在正常大鼠中，GSK-3β激活可诱发大鼠产生伤害性超敏反应［24］。

据报道，Xn可抑制GSK-3β活性，从而抑制tau蛋白过度磷酸化，进而在阿尔茨海默病模型动物中发挥保护作用［25］。

上述研究表明，Xn可抑制GSK-3β活性从而在关节炎疼痛中发挥作用。

本研究表明，Xn可缓解炎症反应。

据报道，GSK-3β可通过多种信号通路在调节炎症反应中发挥关键作用。

GSK-3β在胶质细胞中表达，其激活可升高促炎因子水平。

反之，小分子抑制剂SB216763给药后抑制GSK-3β活性降低神经胶质细胞释放IL-1β和TNF-α［26］。

GSK-3β抑制剂或GSK-3β-siRNA处理可增强脂多糖诱导的抗炎细胞因子IL-1R生成［27］。

GSK-3β抑制剂SB216763抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体激活，减弱Bax信号，降低IL-1β水平，从而在心肌梗死模型动物中发挥作用［28］。

GSK-3β可调控NF-κB介导的炎症信号［29］。

一方面，GSK-3β可直接磷酸化NF-κB亚单位中Ser468位点，从而控制NF-κB的基础活性［30］。

另外，GSK-3β也可降低阻断IκB信号，使NF-κB滞留在细胞质，降低NF-κB与DNA结合和活性，从而降低炎症反应［31］。

因此，我们推测，Xn通过抑制GSK-3β活性发挥降低炎症的作用。

综上所述，Xn通过阻断GSK-3β激酶活性抑制炎症信号从而缓解大鼠关节炎痛。

本项工作的结果为Xn作为关节炎疼痛的镇痛药物开发研究提供数据支持。

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Figure 6.　Effect of xanthohumol （Xn） on serum TNF-α and IL-1β levels in complete Freund´s adjuvant （CFA）-treated
rats. Mean±SD.n=5.*P<0.05 vs control group；#P<
0.05 vs CFA group.
图6　黄腐酚对关节炎大鼠血清TNF-α和IL-1β的作用
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（责任编辑：宋延君，李淑媛）
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