脂质体及其在化妆品体系中的表征

脂质体的水合粒径表征，应根据具体的样品体系选择合适的表示方法
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包封率
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方法
原理
特点与适用范围
缺点
HPLC法
参照磷脂含量测定
适用范围广，
/
可同时用于磷脂含量和包封率测定
透析法
利用半透膜分子大小差别，通过及时更换 简单，稳定性好，可处理大量样品，
外相达到分离的目的
适合小粒径，稳定性好的脂质体
Eric Betzig
Stefan W. Hell 2014诺贝尔化学奖
W. E. Moerner
STORM 技术的开创者庄小威
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低分辨荧光显微镜和超高分辨荧光显微镜图片的对比
优点：突破光学极限的分辨率： 1nm 左右， 具有专属性，可作为通用的方法
局限性：外部资源少
北大工学院席鹏课题组 上海交大李小卫课题组
耗时较长，所耗介质较多
微柱离心法
凝胶柱层析 法
利用游离药物与含药脂质体的重力差异进 行分离，计算包封率
利用脂质体与游离药物分子质量和粒径大 小的差异进行分离
常规SEM
1. 将含有脂质体的样品滴在干净的硅片上面 2. 晾干或者烘干 3. 对其进行喷金处理（增强样品的导电性）
缺点局限性 1.脂质体干燥过程中会发生结构变化。 2. 对小颗粒分辨率不高。100nm左右。
1.只能看表面结构，不能区分脂质体和其它纳米颗粒 2.脂质体不导电，需要喷金处理。
AFM
1.把样品稀释为浓度1Wt%左右 2. 样品滴在云母片上 3. 放置待溶剂挥发干后进行测试
二、对于一些特例。比如低倍的Cyro-TEM或者切片法观测不到脂质体,不确 定是否稳定存在于体系中，可以尝试使用荧光法。该方法对样品纯度没有 要求。如果在共聚焦显微镜不能看到完整的脂质体形状，说明脂质体极大 可能已经被破坏，那么这样的脂质体在体系中发挥不了增溶的作用，已经 没有太大的实用价值。
三、如果在共聚焦显微镜下可以看到完整的脂质体形状，可以进一步尝试 高分辨Cryo-TEM 或者超高分辨荧光显微镜进行观察。
结构和粒径
多室脂质体MLV 1~5μm 洋葱式、管状、球形、椭球形
多囊脂质体MVV 1~5μm 缓释效应和储库效应
洋葱式
管状
球形、椭球形
多囊
Akbarzadeh et al. Nanoscale Research Letters. 2013,8:102
脂质体材料
中性磷脂
磷脂酰乙醇胺（PE） 磷脂酰胆碱（PC）
单室脂质体
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多室脂质体
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脂质体与细胞的相互作用：吸附、脂交换、内吞、融合
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在护肤品领域，一般是指用卵磷脂类形成双分子层微囊，把需要被皮肤吸收利用的原料 包裹在其中；将对皮肤有养护作用的原料，用卵磷脂包裹后，有这样几个好处：
➢ 提高吸收效率 脂质体细胞膜的磷脂双分子层的结构非常接近，提高脂质体的经皮吸收效率。
保留样品原貌
分辨率较高
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+
可观测不同类型的 脂质体内部结构
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类冷冻切片制样法： 类似冷冻切片与细胞切片制备的方法，对化妆品样品进行固定包埋（石蜡包埋）， 然后进行切片，然后将其放在铜网或硅片上进行制样，对脂质体成像。
细胞切片法常常用来区分亚细胞结构
分辨率能达到纳米级别
样品制备简单，成本低，资源广
区分不同结构和类型的脂质体
SCIENCE 348 1147-1151 (2015) FEBS Journal 280 (2013) 28–45
. 国家蛋白质科学中心-上海
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荧光法
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胆固醇与脂质体异性结合，对胆固醇进行荧光修 饰，通过confocal 观测荧光脂质体结构
优点：专属性，排除其他物质干扰，外部资源多
➢ 对被包裹物质提供保护 脂质体可以将油性原料分散在亲油层中，也可以将水性原料包裹在脂质体球心。 而磷脂则可以将有效成分与空气隔离开，使有效成分更长久的保存，延长产品的保质期，也可以延长涂 抹在皮肤上后的有效时间。
➢ 降低配方难度 由于卵磷脂独特的亲油亲水性，脂质体可以随意分散在水中，不增加乳化工作。
结构生物学的突破性工具
诺贝尔奖热门
Yigong Shi al. Structure of a yeast spliceosome at 3.6-.angstrom resolution[J]. Science, 2015, 349(6253): 118320-1191.
分辨率达到原子水平 区分不同结构和类型的蛋白质 局限性：外部资源少
缺点：分辨率较低，可能无法达到几十纳米级别
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Sung T C et al. Scientific reports, 2016, 6. Shi X et al. Polymer Chemistry, 2013
超高分辨率荧光显微镜
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超高分辨率荧光显微镜 （分辨率达到分子级别1nm 左右，2014年诺贝尔化 学奖）
对于复杂样品体系，需要多种表征方法一起反复确认，以保证观测结果的
可靠性。
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激光粒度仪DLS
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原理：在不同的角度上测量散射光的强度，得到样品粒度分布
颗粒平均粒径表示方法 • 体积（D4,3） • 表面积（D3,2） • 数量 不同颗粒均值对颗粒分布的
不同特征敏感
. 体积分布与数量分布之间的转换关系 40
卵磷脂与胆固醇在脂质体中的排列形式
.
胆固醇与磷脂的排列示意图
5
脂质体形成示意图
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6
Liposomes
脂质体
组成
磷脂和胆固醇
结构
双分子层
中心区域
水相，可容纳亲水性药物
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Micelles
胶束 表面活性剂
单分子层 疏水区，可容纳疏水性药物
7
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8
单室脂质体
小单室SUV 20-100nm 大单室LUV 100-1000nm
X. Zhuang，Science 317 1749-1753 (2007)
Nature Methods 3793-795 (2006)
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Science319 810-813 (2008)
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Conclusion:
Seeing is Believing
结构 形貌 大小
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分辨率非常重要
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一、假设脂质体加入化妆品体系之后仍然稳定存在，则使用Cryo-TEM或者 切片法检测，这两种方法保留了脂质体的原貌，理论上可以分辨出脂质体 的双层结构。受配方体系中其他添加剂的影响不大，而且对体系纯度要求 不高。
独创的方法
脂质体的形貌大小的表征
ACS applie.d materials & interfaces, 2015, 7(14): 7526-753239.
2013年，冷冻电镜技术在照相技术和软件分析的图像处理技术方面取得突破性 进展成为施一公实验室诺奖级工作-剪切体的结构解析的关键性工具
优势
最高分辨率达2.2 Å 2014 年全球科技十大进展
①天然的PC
a. 从蛋黄、大豆、牛心脏和脊髓提取 b. 每一种PC具有不同长度、不同饱和度的脂肪链
植物性PC的脂肪链具有高度不饱和性 动物性PC的脂肪链大部分是饱和的
②合成的PC 二棕榈酰胆碱（DPPC)、 二硬脂酰胆碱(DSPC) 二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC)
(a)全饱和磷脂 （紧密排列）
(b)非饱和磷脂 （不能紧密列）
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1
背景介绍
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2
脂质体(liposomes)：将药物包封于类脂质双分子层内
而形成的微型泡囊。也称类脂小球或液晶微囊。
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3
脂质体
磷脂
亲水的头部
磷酸骨架 水溶性分子（胆碱、丝氨酸、季胺盐等）
疏水的尾部 两条脂肪酸链，（10-24个C原子，0-6个双键）
胆固醇
HO
磷脂结构示意图
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胆固醇的结构图
4
双分子结构：磷脂分子的亲水端呈弯曲的弧形，形似“手杖”，与胆固醇分子的亲水基团 相结合，形成“U”形结构。两个“U”形结构相对排列，则形成双分子结构
Liu XM, Yang B, etc. Chem Mater, 2005, .17(11), 2792-2795.
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包裹物质
脂溶性药物 定位于双分子层脂质膜间 水溶性药物 包裹在水相 两性化合物 定位于水相与膜内部交界磷脂上
不能包裹物质
在水相和有机溶剂中都不溶的物质 在两种介质中溶解性都非常好的物质
鞘磷脂（SM）
负电荷磷脂 （酸性磷脂）
磷脂酸（PA） 磷脂酰甘油（PG） 磷脂酰肌醇 (PI) 磷脂酰丝氨酸(PS)
正电荷脂质
硬脂酰胺（SA） 胆固醇衍生物
大豆甾醇及其葡萄糖苷 胆固醇（Ch)
大豆甾醇葡萄糖苷(SG） 大豆甾醇SS
不同材料，形成不同结构的脂质体
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⑴磷脂酰胆碱(phosphatidyl choline,PC)
磷脂脂肪链的饱和度对磷脂膜排列的影响
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⑵ 磷脂酰乙醇胺(phosphatid ethanolamine, PE)
+ NH3
O
特性：头部基团小；
非饱和的PE容易形成非双层结构型 --六角相（制备特殊脂质体）
O PO O
OO OO
六角相
RR
磷脂酰乙醇胺（PE）
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⑶ 鞘磷脂（sphingomyelin,SM）
.27Leabharlann 外部资源： • 中国科学院上海生命科学研究院 • 中国科学院上海巴斯德研究所 • 同济大学
优势
Sugikawa K et al. Angewandte Chemie International Edition, 2016. Jonas Gustafsson et al.Biochimica et Biophysica Acta 1995
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化妆品：脂质体的透皮吸收和缓释作用是重点，修复性，保护性，增效性
角质 脂质体
柔性 脂质体
脂质体 形式
醇质体
亮剑之旅
拓展训练课
程
脂质体
磷脂药物
前体
复合物
脂质体
变换形式
磷脂凝胶
膏霜类化妆品一般加多室或多囊脂质体
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20
相变温度(phase transition temperature, Tc)
相变温度与脂质体膜稳定性
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磷脂含量
Zeta电位 粒度 形貌 包封率
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电镜法
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Fig 1 脂质体的TEM
Fig 2 脂质体的SEM
Fig 3 脂质体的AFM
测试项目
样品制备
1. 样品一般需要使用磷钨酸染色（负染） 常规TEM 2. 将样品用稀释到合适的浓度，1Wt%左右 Fig 1 脂质体的TE3M. 用毛细管滴到铜网上，晾干或烘干
Aline F Xavier, Daiana K Deda2,, et al. IJABPT, 2016, 7(2), 303-313
低温扫描电镜样品制备及观测过程
样品独立制备与分析：镀膜仪真空镀膜后保持真空状态转移到SEM，在制备与分析之间无污染样品转移。
优势
保留样品原貌
分辨率较高
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缺点：只能 观测表面结构
特性：酰胺键和羟基基团之间形成氢键相互作 用，因此，比PC具有更高秩序的胶相。
CH3
CH3
+
N CH3
O
O PO
HO
O
NH O
R
SM
.
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负电荷磷脂（酸性磷脂）
H O O PO O
HO
HO O
OH HO
OH
O PO
O
OO OO
OO OO
+ NH3 H C COO
O O PO
O
OO OO
RR
磷脂酸 (phosphatidic acid,PA)
脂质体
升高温度
脂质双分子层中酰基侧链排列改变
有序排列变为无序排列
至一定温度
相变温度 Tc
膜的物理性质改变
膜的横切面增加、双分子层厚度减少、膜流动性增加
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Tc以下时，为“胶晶态”（脂肪链全反式，排列紧密，刚性和厚度增加） Tc以上时，为 “液晶态” （脂肪链伸缩、弯曲、外扭） 磷脂发生相变时， “胶晶态” “液晶态” “液态”共存， 出现相分离，使膜的流动性增加，易导致内容物泄漏。
RR
磷脂酰肌醇 (phosphatidyl inositol,PI)
RR
磷脂酰丝氨酸 (phosphatidyl serine, PS)
电荷增加脂质体透皮吸收
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磷脂酰胺 (Stear amide, SA)
胆固醇衍生物CDBA和CTBBA
Liu XM, Yang B, etc. Biochim Biophys Acta, 2005, 1720(1-2), 28-34.
只能看表面结构，X,Y轴不灵敏，分辨率低 探针难控制
常规电镜法缺点：1. 样品干燥后失去原貌 2. 分辨率不高，不能区分脂质体和其他纳米颗粒。
Ruan L P, Zhan.g H Y, Luo H L, et al. Science in China Series B: Chemis2t5ry, 2009
Cryo-TEM
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低温透射电镜样品制备及观测过程
测试方法：
1. 将蘸在铜网上的样品溶液或分散液的液膜 急速冷冻，即在铜网上形成玻璃态水膜， 无冰晶产生。
2. 在样品传输、进样、TEM观察的过程中始终 保持低温。
对于囊泡类样品的观察，通常使用这种方法。
高压冷冻仪可与超薄切片机及冷冻样品杆配合，进行低温透射电镜观测