无缝克隆同源重组克隆

1.1.1Gibson assembly
简介INTRODUCTION
原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法;它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA;
装配原理基于DNA片段间的重叠区域,过程依赖于三种酶：DNA 外切酶T5 exonuclease, 高保真
DNA聚合酶;Phusion polymerase和耐热DNA连接酶Taq DNA ligase的共同作用;首先,T5 核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分,由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补,所以DNA片段退火,互补的序列重新配对连接;然后,在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA单链为模板,沿3' 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上,填补缺口;最后,连接酶将两条DNA 单链黏合起来,密封裂缝;这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了;下面是组装的示意图;
材料MATERIALS
❒试剂REAGENTS
NAD,H2O ,1 M MgCl2,1 M DTT,10 mM dNTP mix,1 M Tris-HCl pH ,50% PEG-8000, mg/ mL Tag ligase, μg/ mL T5_ExO,Phusion1×、LB培养基、抗生素据载体而定、LB平板相应抗性
❒实验前准备SETUP
于冰水浴中配制如下反应体系;如果不慎将液体粘在管壁,可通过短暂离心使其沉入管底;
4x isothermal assembly buffer
NAD 20 mg
H2O 300 μL
1 M MgCl2300 μL
1 M DTT 300 μL
10 mM dNTP mix 600 μL
1 M Tris-HCl pH 3 mL
50% PEG-8000 3 mL
加水到mL,每管分500 μL存于-20°C 或-80°C冰箱,够3000个反应
2× assembly mix: best combination:
100 reaction 1 mL
mg/ mL Tag ligase 10 μL
μg/ mL T5_ExO 100 μL
Phusion1×25 μL
4× . buffer 500 μL
加水365 μL,存于-20°C冰箱,有效期1年;
实验步骤PROCEDURE
1.设计引物通过PCR的方法在DNA片段的两端加上同源片段,NEB推荐同源片段的长度为
15-40 bp,同时要求这部分对应的退火温度高于4°C;
2.进行DNA纯化：PCR产物进行琼脂糖电泳,胶回收;或者PCR产物回收试剂盒回收;
3.进行重组反应,以20 μL反应体系为例：
组分加入量
Isothermal assembly Master Mix 10 μL
线性化载体10-100 ng 1-2 μL
插入片段8-9 μL 3-5×载体
Sterilized ddH2O 补足至20 μL
50°C反应15-60 min
4.反应产物转化、涂板及克隆鉴定同传统分子克隆方法;
针对性建议
1.在选择克隆位点时,应避免选择克隆位点上下游50 bp内有重复序列的区域;当克隆位点上下
游20 bp区域内GC含量均在40%～60%范围之内时,重组效率将达到最大;如这部分区域GC 含量高于70%或者低于30%,重组效率会受到较大影响;
2.Gibson组装克隆法缺点之一是适用与长度超过200 bp的片段的组装；缺点之二是如果黏性
末端形成稳定的二级结构,如发夹结构或者茎环结构,那么成功率会大受影响;。