核酸理化性质 四川理工学院

指变性DNA分子在适当的条件下，解开的互补双链可 重新恢复天然的双链螺旋结构。
热变性的DNA在缓慢冷却后复性的过程称为退火。
减色效应（hypochromic
effect ）:DNA复性时，其溶液OD260降低。
复性条件： （1）缓慢冷却 （2）片段小，易复性 （3）均质易复性 （4）浓度大易复性 （5）高度重复序列，易复性
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（3）融解温度（melting temperature,Tm）： DNA热变性过程中，紫外吸收达到最大值的一半 时溶液的温度称为融解温度（Tm） GC含量越高，Tm越大 DNA越长，Tm越大 溶液离子强度增高，Tm值增加 DNA越纯，相变范围越小
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（二）复性（Renaturation）
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4、核酸分子的解离（Dissociation）
核酸和多核苷酸链除了末端磷酸残基外，磷酸二酯键
中磷酸残基只有一个解离常数， pK1 =1.5
三、紫外吸收(260nm，定性和定量分析)
但分子量差异大，纯质不一，难以用NA重量浓度来表
示其消光系数，故常用摩尔磷消光系数.
ε(p)—每升溶液中含1mol 磷的核酸溶液（pH=7）的消
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2. 核苷（Ns）解离
糖的存在使N解离pK值降低，而糖上－OH的解离无
足轻重（pK 在12 以上）
3. 核苷酸（Nt）解离
Pi有两次解离，pK′＝0.7～1.6 IP pK′＝6.1～6.5 IIP
Nt含碱基和Pi，为两性电解质，当正、负解离速度
相等时，该pH即为pI，（U、T除外,不带电荷） pI = (pK′+ pK′) / 2，pK′为Pi第一解离，pK′为 N解离 IP α2 IP α2 eg. AMP pI = (0.9+3.8) / 2 = 2.35 了解Nt的解离及pI ，在制备及分析中极有帮助。
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（二）DNA的制备
①辛醇－氯仿法
Et-OH ↓ DNA（水相） DNA↓ 核蛋白溶液＋辛醇－氯仿 Pro （水与氯仿相之间）
② SDS法
SDS将Pro变性，与DNA分离 ③ 苯酚法 苯酚将Pro变性，抑制Nuclease活性。活性DNA在水 相
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（三）RNA的制备
① 粗提方法：苯酚法；稀碱或盐溶液（与pI联合使 用）。 提取不同RNA时，先用离心法分离细胞器，再提取相 应的RNA。
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核蛋白 + 1mol/L NaCI→ DNP溶解 + RNP ↓ 核蛋白 + 0.14 1mol/L NaCI → DNP ↓ + RNP溶解 (低盐DNP不溶，高盐RNP不溶) 核蛋白 在pH4.2（pH = pI）时，DNP ↓，RNP溶解 核蛋白 在pH2～2.5 （pH = pI）时， RNP ↓ ，DNP 溶解
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DNA的变性(denaturation)
方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰 胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。 DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 变性后其它理化性质变化：OD260增高；粘度下 降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲 线改变；生物活性改变
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增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。
Pu>Py （purine）（pyrimidine）；deoxy>oxy
② 碱解RNA（0.3～1M NaOH），得2', 3 '环式Nt， 进一步生成 2′或 3 ' Nt、Ns ( Nt 代表核苷酸， Ns代表
核苷的缩写）
DNA无2'-OH，不能生成2', 3' 环式Nt，相对抗碱。
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③ 酶解
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核酸分子杂交(hybridization)
由不同来源的核酸单链形成杂化双链的过程
分子杂交技术的应用：基因克隆筛选、酶切图 谱制作、特定基因序列的定量和定性、突变分 析、疾病诊断等
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4.5 Nt类物质的制备及应用
一、 核酸组分Nt、Ns和Base的制备
（一） 降解方法
① 酸解NA，直接得碱基（或无嘌呤酸），糖苷键断。
二、Prperation of NA（DNA and RNA）
（一）制备NA时注意的几个问题 ① 防止核酸酶的水解 加核酸酶抑制剂或去核酸酶激活剂。 ② 防止化学因素的降解 提取NA常用酸碱法，但要防止过酸过碱。 ③ 防止物理因素的降解 高温、机械等作用力破坏NA结构，应该在低 温和温和条件下进行。
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核 酸 的 杂 交
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变性
复性
不同来源的 DNA分子
DNA-DNA 杂交双链分子
核酸分子杂交的应用: 研究基因的位置 确定两种核酸序列的相似性 检测样品中的特异序列 基因芯片技术的基础
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核酸探针（nucleic acid probe）:能特异性的探测带某一 特定序列的DNA或RNA分子的标记核酸分子。
4.4 核酸和核苷酸的性质
(Section 4 Properties of Nucleic acid and Nucleotide)
一、溶解性（Solubility）
① RNA、Nt、Ns和Base纯品为白色粉末或结晶体。 ② DNA为纤维状固体。 ③ 核酸为极性物质，核苷酸和核苷可溶于水。 ④ 核酸大多与蛋白质结合成和蛋白。在不同的盐浓度 下，DNA蛋白（DNP）和RNA蛋白（RNP）溶解度不同。
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用途：
a. 作为判断变性，复性的指标
变性－hyperchromic effect（增色效应， ε(p) ）
复性－hypochromic effect（减色效应，ε(p) ）
b. 测NA浓度 （常用） ② 热变性及变性温度 热引起… 变性温度(Tm)—紫外吸收值达最高值的一半时溶液
所处的温度(突发过程，相当窄的温度)。 或双螺旋结构失
DNA+ H+ ＋二苯胺
蓝色产物（A600nm）
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（三）定磷法（RNA和DNA总量）
消化
定磷试剂
NA(DNA和RNA) + H+
有机磷转化为无机磷
蓝色产物（总磷， A650nm～660nm ）
核酸磷真实含量＝总磷－无机磷
纯核酸含磷量约9.5%，1g磷＝10.5g核酸（100/9.5）
（四）琼脂糖凝胶电泳法（尤其用于DNA测定和分析）
Nt含碱基和Pi，为两性电解质，当正、负解离速度
相等时，该pH即为pI，（U、T除外,不带电荷）
IP IIP
pI = (pK′+ pK′) / 2，pK′为Pi第一解离，pK′为 N解离 IP α2 IP α2 eg. AMP pI = (0.9+3.8) / 2 = 2.35 了解Nt的解离及pI ，在制备及分析中极有帮助。
纯NA，DNA(1µ g/ml) = 0.020A260nm
RNA(1µ g/ml) = 0.022～0.024A260nm 即一个A值＝50µ g/ml 双螺旋DNA 一个A值＝40µ g/ml RNA或单链DNA （二）定糖法
RNA＋H+ ＋3，5－二羟基甲苯（苔黑酚，地衣酚）
绿色产物（A670nm）
去一半时的温度（melting temperature，溶解温度，解链 温度）。DNA， Tm = 70～85oC 。DNA变性Tm与下列因 素有关：
11Leabharlann ● 样品均一性越均一，温度越窄。是均一性的检
验标准
●溶液离子强度增高，Tm值增加
● G－C含量
计算G-C百分含量：
pH 7.0，0.165M NaCl中DNA的Tm
光系数。
260nm: DNA=7,000～10,000 RNA=6,000～8,000
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在核酸分子中，由于嘌 呤碱和嘧啶碱具有共轭 双键体系，因而具有独 特的紫外线吸收光谱， 一般在260nm左右有最 大吸收峰，可以作为核 酸及其组分定性和定量 测定的依据。
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OD260的应用
1. DNA或RNA的定量
如rRNA从核糖体中提取，tRNA从细胞质中提取，
mRNA从多聚核糖体中提取。 ② 精制方法：分子筛层析，密度梯度离心，DEAESephadex，Poly dT 亲和柱(精制mRNA，与mRNA尾巴 Poly A特异结合)等。
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4.6 NA的分析测定和研究方法
一、NA及其组分含量的测定
（一）紫外吸收法（朗白－比尔定律）
OD260=1.0相当于
50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0
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四 、 核 酸 的 变 性 与 复 性 （ Denaturation and renaturation of NA）
（一） Denaturation of NA
① 定义: NA受热、酸碱、有机溶剂、辐射、及尿素
等变性剂作用，皆引起变性，所谓变性：氢键断裂，双螺
旋结构解开，从而引起紫外｛ε(p) ｝增加（hyperchromie
effect ，增色效应）、失去生物活性、粘度下降（双股－ 无规线团）（与pr反）、比旋下降 等性质改变的过程叫 变性。(与降解不同，无共键的断裂)
OD260（254） 100% 50%
②
① 80
Tm 变性温度范围
90
100 ℃
融解温度（melting temperature,Tm）：DNA热变性 过程中，紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度 13 称为融解温度（Tm）或解链温度、变性温度。
总结：
（1）变性后理化性质改变 DNA溶液的粘度降低 浮力密度增加 旋光偏振光改变 紫外吸收增加（高色效应） 高色效应（hyperochromic effect）：DNA变 性后，在260nm处的紫外吸收增高，称为高色效 应或增色效应。 （2）变性后的DNA一级结构没有改变。