敲低去泛素化酶USP13抑制K562细胞的增殖

中国生物工程杂志China Biotechnology,2021，41 (5) : 1-7
D01：10. 13523/j.cb.2101041
i研究报告t
s t
敲低去泛素化酶USP13抑制K562细胞的增殖+
陶守松1任广明2尹荣华2杨晓明马文兵葛志强
(1天津大学化工学院制药工程系天津300072 2中国人民解放军军事科学院军事医学研究院生命组学研究所北京100850) (3中国人民解放军军事科学院军事医学研究院卫生勤务与血液研究所北京100850)
摘要目的：研究去泛素化酶USP13对人慢性髓系白血病细胞系K562增殖和凋亡的影响，并进 行初步的机制探究。

方法：构建pLKO.l-shUSP13-GFP慢病毒干涉载体，慢病毒包装后感染并建立稳定敲低USP13的K562细胞株。

免疫印迹检测K562细胞中USP13蛋白的敲低效率。

流式细 胞术分析敲低USP13对K562细胞增殖和凋亡的影响。

免疫共沉淀和蛋白质泛素化实验探究USP13调控K562细胞的分子机制。

结果：成功构建pLKO.l-shUSP13-GFP慢病毒干涉载体，同时 利用慢病毒体系获得稳定敲低USP13的K562细胞株。

流式细胞术结果显示，敲低USP13促进K562细胞凋亡、抑制细胞增殖。

分子机制研究发现，敲低USP13通过增强c-Myc泛素化进而导致 其蛋白质水平降低u结论：初步揭示了 USP13调控K562细胞增殖和凋亡的分子机制，为治疗慢 性髓•系白血病提供了潜在的把点。

关键词人慢性髓系白血病K562细胞 USP13 增殖和凋亡 c-Myc
中图分类号Q814
慢性髓系白血病（chronic myelogenous leukemia, CML)是由于基因突变导致酪氨酸激酶B(_r-Abl持续磷 酸化产生的一种克隆性骨髓恶性增生性疾病。

临床特 点是产生大量不成熟的白细胞,进而抑制骨髓的正常 造血功能[1]。

酪氨酸激酶Bcr-Abl激活多种信号通路，
的发生发展。

现阶段治疗CML的药物以靶向Bcr-Abl 的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKI)为主。

TK1代表药物伊马替尼可显著提高CML患者的整 体生存率和预后质量，但长时间使用TK1会伴有耐药 性、反复和经济压力等问题，并且所有的TK1药物均对 Scr-/16/-；r W5/基因突变的CML无效。

因此,寻找治 疗CML新的靶点十分必要。

原癌基因〇M yc(cellular-myelocytomatosis viral oncogene,c-Myc)编码一种具有螺旋-环-螺旋结构的转
收稿H期:2021>0丨-27 修回日期:202丨>03-11
*国家自然科学基金青年科学基金(82001666)资助项目
**通讯作者，电子信箱：mawenbing〇03@ 丨;**************.cn 录因子蛋白，调控大量生长相关基因的表达:5]。

研究 表明,C-/WK在近70%的人类肿瘤中异常高表达，并且 与患者的不良预后息息相关。

此外,c-Myc是白血病进 程中最为重要的原癌基因之一，当CML患者对TKI抑 制剂产生耐药性时，c-Myc是从慢性期过渡到急变期所 必需的[6]。

因此，靶向c-Myc可能成为解决TKI耐药 性有效手段。

目前，大多数研究集中在降低c-Myc在 K562中表达或直接通过药物作用于c-Myc,但是通过 翻译后修饰进而调控c-Myc的蛋白稳定性的研究却鲜 有报道。

泛素特异性蛋白酶丨3 (ubiquitin-specific protease 13，USP13)是USP去泛素化酶家族的成员之一，属于 半胱氨酸蛋白酶超家族。

USP13可剪切底物链接的 K48位多聚泛素链，阻止底物泛素-蛋白酶体途径降 解。

研究表明，USP13在多种人癌症中异常表达。

一方面，USP13可稳定PTEN[M°]，抑制乳腺癌、膀胱癌、人口腔鱗状细胞癌等的发生；另一方面，USP13还可稳 定c-Myc、MCLl，促进肝癌、卵巢癌、肺癌的发生H 3
2中国生物工程杂志China Biotechnology Vol.41 No. 5 2021
然而，USP13对CML的作用并不明确。

本文利用慢病 毒构建稳定敲低USP13的K562细胞株，研究USP13对 人慢性髓系白血病细胞系K562增殖和凋亡的影响，并 进行初步的机制探究。

1材料与方法
1.1材料
1. 1.1 细胞及质粒 K562细胞、MCF-7细胞、SW872 细胞以及HEK293T细胞均购自中国协和细胞库;慢病 毒骨架质粒PSPAX2、PM D
2.G,以及慢病毒干涉质粒 pLKO. 1-GFP均购自Addgene;DH5a大肠杆菌感受态 细胞购自北京天根生化科技有限公司。

1.1.2试剂与仪器主要试剂：DMEM、RPM I 1640培 养基购自Gibco公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质 粒小提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；无内 毒素质粒大提试剂盒购自Qiagen公司；EcoRI-HF、y4geI-HF、T4 PNK和T4 DNA Ligase购自NEB公司；氨苄青 霉素钠、硫酸链霉素购自北京索来宝科技有限公司；Foundation胎牛血清购自GEMINI公司；jetPRIME购自
表1Polyplus Transfection公司；15 mL-100 K 超滤离心管购 自Millipore 公司；PEG-it Virus Precipitation Solution 购 自System Biosciences公司；Polybrene购自 Sigma公司；M ouse anti HA-Tag antibody N HRP Goat anti-Rabbit lgG antibody、HRP Goat anti-mouse lgG antibody、Rabbit anti-c-Myc antibody购自 Abclonal&3;M G-132、Rabbitanti-USP13 antibody、Goat anti-rabbit IgG antibody 购自 Cell Signaling Technology公司；Protein A/G PLUS-Agarose购 自Santa Cruz Biotechnology;ECL 显色 A B液购自 Thermo Scientific公司；APC Annexin V Apoptosis Detection Kit with7-AAD购自Biolegend公司；eBioscienceI M Cell Proliferation Dye eFluor1'1 670 购自 Thermo Fisher Scientific;其余试剂均为国产分析纯。

主要仪器：倒置荧光显微镜购自日本Olympus公 司；LSR Fortessa流式细胞仪购自美国BD公司；PCR 仪、电泳仪、湿式电转仪以及凝胶成像系统购自美国 Bio-Rad公司。

本文所用引物及其序列如表1所示。

北京华大基 因有限公司合成、测序所有引物。

引物名称和序列Table 1Primer name and sequence
Primer name pLKO. 1shUSP13-l F pLKO. 1shUSP13-l R pLKO. 1shUSP13-2 F pLKO. 1shUSP13-2 R USP13-RT-F
USP13-RT-R
Primer ( 5’-3’）CCGGGCCAGTATCTAAATATGCCAACTCGAGTTGGCATATTTAGATACTGGCTTTTTG AATTCAAAAAGCCAGTATCTAAATATGCCAACTCGAGTTGGCATAriTAGATACTGGC CCGGCGATTTAAATAGCGACGATTACTCGAGTAATCGTCGCTAnTAAATCGTTTTTG AATTCAAAAACGAriTAAATAGCGACGATTACTCGAGTAATCGTCGCTATTTAAATCG TCTCCTACGACTCTCCCAATTC
CAGACGCCCCTCTTACCTTCT
1.2方法
1.2.1 细胞培养 K562细胞和SW872细胞采用 RPMI 1640培养基+ 10%胎牛血清+ 1%青霉素/链霉 素培养；HEK293T细胞和MCF-7细胞采用DMEM培养 基+ 10%胎牛血清+ 1%青霉素/链霉素培养。

上述细 胞均在37T、5%C02细胞恒温箱中培养。

1.2.2慢病毒干涉载体的构建与鉴定采用T4PNK 处理USP13干涉引物，退火后引物自然形成具有EcoRl和4g e l黏性末端的DNA片段。

接着将DNA片段与£；c〇R l和/酶切后的线性化pLKO.丨-GFP载体 进行连接。

转化后经氨苄抗性LB板筛选，挑取单克隆 摇菌。

最后阳性克隆交由华大基因公司测序鉴定。

1.2.3慢病毒包装以及滴度测定 HEK293T细胞种在10 cm细胞培养皿中，待细胞密度达到70% ~ 80% 时，采用jetPRIME转染试剂进行转染。

其中每个培养 皿转染pSPAX2 10 |xg、pM D2.G 5网以及慢病毒干涉 质粒15 (jig。

转染6 h后将培养基更换为新鲜的完全培 养基，随后在转染48 h、72 h收取含有病毒的培养基。

离心去除细胞碎片，100 K超滤管对病毒上清进行浓 缩。

用预冷5 x PEG醇沉浓缩至少16 h后，离心，再用 预冷PBS溶解沉淀，分装至200坫EP管中，-80丈保 存。

分别取0.5 pLJ p L的病毒感染HEK293T细胞，感染48 h后收取细胞，通过流式细胞仪测定G F P阳性 的比例，并计算滴度。

病毒滴度计算方法为:病毒滴度 (p f u/m L)=细胞G F P阳性率x接种细胞数/添加病 毒体积。

2021,41(5)陶守松等:敲低去泛素化酶USPI3抑制K562细胞的增殖3
1.2.4病毒感染K562细胞系的建立 K562细胞以 每孔3 x105/mL的密度种于24孔板，然后每孔加人20 感染复数（multiplicity of infection,MOI)慢病毒，同时加 人终浓度为4 |X g/mL的polybrene促进感染。

37丈培养 12 h后再次加人20 M0I慢病毒进行第二次感染。

最 后一次感染48 h后观察GFP阳性率，以确保感染成 功,满足后续实验要求。

1.2.5免疫印迹检测离心收取细胞后，加人适量
2 x SDS-PAGE Loading Buffer 裂解后，于沸水中煮 12 min，室温12 000 r/min离心1min,采用上清进行SDS-PAGE。

电泳结束后用80 mA恒流湿转法转膜，然后将 PVDF膜在5%脱脂奶粉的TBST中室温封闭1h，接着 将PVDF膜一抗4丈孵育过夜。

TBST洗4次，每次6 min,随后将膜在二抗中孵育1h。

接着经TBST洗4次 后，采用ECL显色系统在暗室中显影。

1.2.6细胞增殖检测离心收集细胞，然后用PBS清 洗两遍以去除血清，加人终浓度为5 (junol/L的Cell Proliferation Dye eFluor™670,吹打混勾后，在 371避光 培养10 min。

加人4 ~5倍体积的完全培养基终止反 应，并用完全培养基清洗三遍，继续培养并在〇d、l d、2 d、3 d、4 d,采用LSR Fortessa流式细胞仪检测增殖 情况。

1.2.7细胞凋亡检测将干涉组和对照组K562细胞 以无血清培养基重悬，以每孔1x l〇Vm L的密度种于 24孔板，饥饿培养24 h后，离心收集细胞，用凋亡结合 缓冲液冲洗细胞2次，然后100 +L结合缓冲液重悬细 胞，加人 5 j j l L Annexin V-APC 和 5 PL7-AAD,室温避光 标记15mm,在每管中加人400 结合缓冲液后，通过LSR Fortessa流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.8 免疫共沉淀 K562细胞采用800 pL IP lysis buffer (150 mmol/L NaCl,100 mmol/L Tris-HCl,5 mmol/L EDTA,0. 5%Triton X-100, 1%NP40, 2 mmol/L DTT,蛋白酶抑制剂）冰上裂解45 min。

12 000 r/min、4丈离心10 m in后，吸取80 |ji L上清做 Input,其余上清中加人2 pig c-Myc抗体或者Rabbit IgG 抗体，4丈旋转6 h。

接着加人50 (x L protein A/G4T：旋 转结合4 ~8 h。

最后IP lysis buffer洗三次，加人50 |j l L 2 x SDS-PAGE Loading Buffer,沸水煮 12 min 即可进行 免疫共沉淀检测。

1.2.9蛋白质泛素化实验收集K562细胞，然后采 用 200 |j l L泛素裂解液（150 mmol/L NaCl,100 mmol/L Tris-HCl, 5 mmol/L EDTA,0. 5%Triton X-100, 1%NP40, 10 mmol/L NEM,蛋白酶抑制剂，1%SDS)冰上 裂解10 min,接着100T沸水煮10 min完全破坏相互作 用的蛋白质。

随后加人800丨P lysis buffer4尤旋转裂解 45 min。

剩余步骤与免疫共沉淀实验相同，不再描述。

1.2. 10统计学分析本文采用Graph Pad Prism7软 件进行统计学分析。

所有数据以均值±标准差表示，其中单因素两水平采用*检验分析，双因素多水平采用 Two-way AN0VA分析。

P<0. 05认为在统计学上有显 著差异。

2结果
2.1 IJSP13在K562细胞中高水平表达
研究表明，USP13在多种癌症如肝癌、肺癌等异常 高表达，并在其进程中发挥重要作用[7_9>123。

然而，USP13在慢性髓系白血病的作用目前尚不明确。

实时 定量PCR和免疫印迹结果显示，USP13在慢性髓系白 血病K562细胞中高表达（图1),这提示USP13在慢性 髓系白血病发生发展过程中可能发挥着重要的作用。

(a)
USP13 -*1
g a p d h.35
(b)
图1USP13在K562细胞中高水平表达
Fig. 1High expression of USP13 in K562 cells Q-PCR (a)and Western blot (b)analysis the expression levels of USP13 in K562, MCF-7 and SW872 cells
2.2 USP13干涉载体的构建及慢病毒包装
取阳性克隆送公司测序，然后将测序成功的USP13干涉载体和Flag-USP13表达载体在HEK293T 细胞中共转，免疫印迹结果显示pLKO.l-shUSP13- GFP-1 干涉效果高于 pLKO.卜shUSP13-GFP-2 (图2a、b)。

随后在 HEK293T细胞中采用 pLKO.l-shUSP13- GFP-1进行慢病毒包装，滴度检测对照病毒和USP13 干涉病毒滴度分别为8. 3 x 108pfu/m L和8. 1x 108 pfu/mL (图 2c
)。

4
中国生物工程杂志China Biotechnology
Vol.41 No. 5 2021
1.5t
0.005 3
1.0
0.5-
USP13-100
0.01
GAPDH
-35
0>)
(c)
图3 USP13干涉的K562稳定株的构建
Fig. 3 Construction of stable USP13 knockdown K562 cell lines
(a) Flow cytonietr>, analysis of GFP rate in K562 cells ( b) Q-PCR and ( c) Western blot analysis the knockdown efficiency of USP13 in K562 cells
2.3敲低USP 13的K 562稳定株的构建
慢病毒第二次感染后48 h 流式结果显示，对照组 和干涉组GFP 阳性率均大于95% (图3a )，表明病毒 感染效果较好。

实时定量PCR 和免疫印迹结果显示，
1.0K-K 562细胞干涉组中USP 13 mRNA 水平和蛋白质水平
均明显下调（图3b 、c )。

以上结果表明敲低USP 13的
K 562稳定株构建成功。

T C C I C G G C I I A A I A T C F I G I G G A A G 0A C C A A A C A C C C G C C C A G I A 1C I A A A I A I G C C A A C
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FIag-USP13
+
+
+
Flag
100
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r A A G T A G G T G T T A A A A T T T T C l r C C C C C C T A A C C C C C C A T G T C A C G T C C C C T T T C T T A
(a )
(b )
sh-Ctrl
sh-USP13
(c)
图2 USP13干涉载体的构建及慢病毒包装
Fig. 2 Construction of pLKO. l-shUSP13-GFP vector and lentivirus packaged
(a ) Sequencing results of pLKO. 1-shUSP13-GFP vector
(b ) Western blot analysis knockdown efficiency of USP13 in HEK293T cells
((•) Fluorescence microscopy detects the lentivirus packaged in HEK293T cells
U 0y s s 3j d x <u f
一C L .§f J 3>P E I 3y
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3lo';F P (a )
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2021,41(5)
陶守松等:敲低去泛素化酶USP 13抑制K 562细胞的增殖
5
L Jsh —Ctrl ■sh -U S P 13
"I'n 11 nvvp1 m ' ! i ；r： ■ ： ■ ； | > ■ y fT f > 01 -''T ]0 50 100 150 200 250 〇 50 100 150 200 250 Channela(FL4-H -DY E670) Channels(FL4-H -DYE670)
图4敲低USI>13促进K562细胞凋亡、抑制细胞增殖
Fig. 4 Knockdown of USP13 promotes K562 cell apoptosis and inhibits cell proliferation
Flow cytometry analysis of cell proliferation (a ) or apoptosis (b)
2.5敲低USP 13通过增强c -M yc 泛素化进而导致其
蛋白质水平降低
原癌基因c -Myc 在白血病进程中发挥着重要的作 用，并且研究表明c-M yc 是去泛素化酶U SP13的底物， 这些提示U SP 13在K 562细胞中可能通过稳定c-Myc 进而促进慢性髓系白血病的发生[13]。

免疫印迹结果显 示K 562细胞中，敲低U SP13导致c-M yc 蛋白水平大大 降低（图5a )。

随后免疫共沉淀结果显示，在K 562细 胞中USP13与c-M yc 存在相互作用（图5b )。

同时蛋 白质泛素化实验表明，干涉U SP13后c-M yc 泛素化水 平大大增强（图5c )。

进一步实验表明，MG132可以阻 断c-M yc 通过泛素-蛋白酶体途径降解（图5d )。

以上 结果表明，敲低U SP13通过增强c-M yc 泛素化进而导 致其通过泛素-蛋白酶体途径降解，使c-M yc 蛋白水平 的降低进而促进细胞凋亡、抑制细胞增殖。

3讨论
Spautin-l 是一种去泛素化酶抑制剂，可特异性抑
制去泛素化酶U S P 10和U S P 13酶活。

研究表明,
Spautin-l 和TK1联合用药可增强CML 细胞的凋亡，但
是潜在的分子机制并不十分明确[14]。

本文利用慢病毒 干涉体系建立稳定敲低U SP 13的K 562细胞株，检测发 现敲低U SP13促进K 562细胞的凋亡、抑制细胞增殖。

进一步研究揭示，敲低U SP 13导致c-M yc 泛素化水平 增强和蛋白质水平降低，进而促进K 562细胞的凋亡。

本文的研究提示，Spautin-l 促进CML 细胞的凋亡可能 通过降低c-M yc 的蛋白质水平，但仍需进一步的研究去 确认。

近来研究发现，S 期激酶相关蛋白2 (S-phase
kinase-associated protein 2 , S K P 2)^^ Bcr-Abl K63 位
去泛素化并增强其活性，而U SP10介导SK P 2的去泛素 化并增强其稳定性，进而增强Bcr-A bl 下游信号的活
vjcnciauuu*-
™ Generation^
2 Generation^ H Generation^ H Generation ^ y Generation^ 厲| Generation] >—• Generation]
)50 100 150 200 250 ：hannels(FL4-H-DYE670)
2.4敲低USP 13促进K 562细胞凋亡、抑制细胞增殖
USP13在K 562细胞中高表达提示其发挥着重要
的作用。

慢病毒构建敲低U SP 13的K 562稳定株后，流 式细胞术检测发现敲低U SP 13导致K 562细胞增殖受
阻（图4a )。

进一步研究发现，U SP13干涉促进K562细 胞的凋亡（图4b )。

这表明敲低U SP13促进K 562细胞 凋亡、抑制细胞增殖。

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6中国生物工程杂志China Biotechnology Vol.41 No. 5 2021
c-Myc
USP13 GAPDH
(a)
IP
USP13
c-Myc
c-Myc
USP13
IP
Input
sh-Ctrl sh-USP13
IP
IP
sh-Ctrl sh-USP 13 MG132
IB：USP13
GAPDH
(d)
Input
(c)
图5敲低USP13通过增强c-Myc泛素化进而
导致其蛋白质水平降低
Fig. 5 Knockdown of USP13 decreases c-Myc
level by enhancing its ubiquitinations
(a) Western blot analysis of c-Myc levels in USP13 knockdown K562 cells ( b) Co-immunoprecipitation analysis the interaction between USP13 and c-Myc in K562 cells (c)Detection the ubiquitination of
c-Myc in USP13 knockdown K562 cells (d) c-Myc is degraded through the ubiquitin-proteasome pathway
化W]。

这提示Spautin-l和T K I的联合使用可大大增 强对Bcr-Abl活性的抑制。

通过本文的研究可以推测，Spautin-1可通过抑制USP13酶活性降低c-M yc,进而促 进CML细胞的凋亡。

而且靶向c-M yc为解决TK I耐药 性问题以及治疗基因突变的CML提供 了可能。

因此，Spautin-1可能是治疗Bcr-^46Z-：r a75i基 因突变型CML的潜在药物，并且Spautin-1与TK I联合 用药可能增强S c r-Z^-7^5/基因突变型CM L的治疗 效果。

在肝癌和胶质母细胞瘤中，USP13通过稳定c-Myc 促进肿瘤的发生;在黑色素瘤和肺癌中，USP13可稳定 MITF和MCL1等促进肿瘤的发生[n_13>17]。

本文的研 究发现，在CML细胞中USP13可通过c-M yc促进细胞的增殖。

然而,USP13是否通过MITF和MCL1等途径 促进K562细胞的增殖仍需进一步的研究。

总之，本文 的研究可能为治疗CML尤其是基因突
变的CML提供了新的思路和靶点。

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Knockdown of Deubiquitinase USP13 Inhibits the Proliferation of K562 Cells
TAO Shou-song'REN Guang-tning2YIN Rong-hua2YANG Xiao-ming1’2MA Wen-bing3GE Zhi-qiang'
(1 Department of Pharmaceutical Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China)
(2 Beijing Institute of Lifeomics, Academy of Military Medical Sciences, Academy of Military Sciences, Beijing 100850, China)
(3 Institute of Health Service and Blood Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China)
Abstract Objective：Study the effect of deubiquitinating enzyme USP13 on the proliferation and apoptosis of human chronic myeloid leukemia K562 cells,and explore the underlying mechanism.Methods：Construction of the pLKO. 1-shUSP13-GFP lentiviral interference vector and establishment of the USP13 knockdown K562 cell line using lentivirus.Western blot detected the USP13 knockdown efficiency in K562 cells.Flow cytometry analyzed the effect of USP13 knockdown on the proliferation and apoptosis of K562 cells.Co-immunoprecipitation and protein ubiquitination experiments explored the regulation mechanism of USP13 on K562 cells.Results：The pLKO. 1-shUSP13-GFP vector was successfully constructed,and K562 cell line with stable knockdown of USP13 was obtained using the lentiviral system.Flow cytometry results showed that knocking down USP13 promoted K562 cell apoptosis and inhibited cell proliferation.Molecular mechanism studies found that knockdown of USP13 decreases c-Myc level by enhancing its ubiquitination.Conclusions：Data preliminarily revealed the molecular mechanism of USP13 regulating the proliferation and apoptosis of K562 cells,providing a potential target for the treatment of chronic myeloid leukemia.
Keywords Chronic myelogenous leukemia K562 cells USP13 Proliferation and apoptosis c-Myc。