丹参酮ⅡA通过介导PI3KAkt-eNOS信号通路改善野百合碱所致大鼠肺动脉高压

肺动脉高压是一种罕见但危害极大的心肺血管疾
病，被称作心血管里的癌症［1,2］。

其发病率低，但一旦发
生会增加特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病和慢性心
力衰竭的风险［3］。

流行病学资料显示特发性及遗传性PAH 患者在经过常规治疗后，5年生存率仅为20.8%。

目前，临床上用于治疗肺动脉高压的药物不多，而且药价昂贵，这使得肺动脉高压面临用药尴尬，也是造成治
疗困境的原因之一［4,5］。

丹参酮IIA 是中国传统中药丹参的成分，报道认为
Tanshinone IIA alleviates monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats through the PI3K/Akt-eNOS signaling pathway
ZHANG Ximin 1-4,LIU Sijia 1,2,SUN Yabin 5,LI Guofeng 1-31
Department of Pharmacy,2Rational Medication Evaluation and Drug Delivery Technology Lab,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;3Guangdong Provincial Key Laboratory of New Drug Screening,School of Pharmaceutical Sciences,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;4Guangzhou Civil Aviation College,Guangzhou 510403,China;5Hutchison Whampoa Guangzhou Baiyunshan Chinese Medicine Co.,Ltd,Guangzhou 510515,China
摘要：目的探究丹参酮IIA 治疗野百合碱所致大鼠肺动脉高压（PAH ）的作用机制。

方法选取100只SD 雄性大鼠，按随机数字
表法分为5组（20只/组）：模型组（MCT ）、丹参酮IIA 组（TIIA ）、丹参酮IIA+PI3K 抑制剂组（TP ）、PI3K 抑制剂组（PI ）、对照组。

除对照组颈背部注射等体积生理盐水外，剩余大鼠均颈背部注射野百合碱（MCT ）诱导肺动脉高压模型。

2周后，丹参酮IIA 组腹腔注射丹参酮IIA10mg/kg 进行治疗，丹参酮IIA+PI3K 抑制剂组注射丹参酮IIA10mg/kg+PI3K 抑制剂1mg/kg ，PI3K 抑制剂组注射PI3K 抑制剂1mg/kg ，对照组和模型组均腹腔注射等体积生理盐水。

治疗2周后，采用苏木精-伊红（HE ）染色实验和α-SMA 免疫荧光染色实验评估大鼠肺血管形态；Western blot 实验评估大鼠肺组织中磷脂酰肌醇3激酶（PI3K ）、蛋白激酶B （PKB/Akt ）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS ）的磷酸化水平；ELISA 法测定eNOS 、NO 水平。

结果HE 染色实验和α-SMA 免疫荧光染色证实丹参酮IIA 能有效抑制PAH 大鼠肺血管中膜厚度和血管肌化水平（P <0.01）；Western blot 实验结果显示丹参酮IIA 能够显著提高PAH 大鼠肺组织中PI3K 、Akt 和eNOS 蛋白的磷酸化水平；ELISA 实验结果显示模型组eNOS 、NO 水平降低（P <0.01）。

结论丹参酮IIA 能够通过介导PI3K/Akt-eNOS 信号通路改善野百合碱所致大鼠肺动脉高压。

关键词：肺动脉高压；PI3K/Akt-eNOS ；丹参酮IIA ；野百合碱；信号通路
Abstract:Objective To explore the therapeutic mechanism of tanshinone IIA in the treatment of pulmonary arterial hypertension (PAH)in rats.Methods A total of 100male SD rats were randomized into 5groups (n =20),and except for those in the control group with saline injection,all the rats were injected with monocrotaline (MCT)on the back of the neck to establish models of pulmonary hypertension.Two weeks after the injection,the rat models received intraperitoneal injections of tanshinone IIA (10mg/kg),phosphatidylinositol 3kinase (PI3K)inhibitor (1mg/kg),both tanshinone IIA and PI3K inhibitor,or saline (model group)on a daily basis.After 2weeks of treatment,HE staining and α-SMA immunofluorescence staining were used to evaluate the morphology of the pulmonary vessels of the rats.The phosphorylation levels of PI3K,protein kinase B (PKB/Akt)and endothelial nitric oxide synthase (eNOS)in the lung tissue were determined with Western blotting;the levels of eNOS and NO were measured using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Results The results of HE staining and α-SMA immunofluorescence staining showed that tanshinone IIA effectively inhibited MCT-induced pulmonary artery intima-media thickening and muscularization of the pulmonary arterioles (P <0.01).The results of Western blotting showed that treatment with tanshinone IIA significantly increased the phosphorylation levels of PI3K,Akt and eNOS proteins in the lung tissue of PAH rats;ELISA results showed that the levels of eNOS and NO were significantly decreased in the rat models after tanshinone IIA treatment (P <0.01).Conclusion Treatment with tanshinone IIA can improve MCT-induced pulmonary hypertension in rats through the PI3K/Akt-eNOS signaling pathway.
Keywords:pulmonary hypertension;PI3K/Akt-eNOS;tanshinone IIA;monocrotaline;signaling pathway
收稿日期：2022-03-23
基金项目：广州市科技计划项目珠江科技新星专项（201806010066）；广东省自然科学基金（2020A1515010396）
作者简介：张喜民，主管药师，在读硕士研究生，E-mail:fighter2022@
通信作者：李国锋，教授，硕士生导师，E-mail:********************
doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2022.05.13J South Med Univ,2022,42(5):718-723
·
·718
其对肺动脉高压的治疗起着重要的作用［6,7］。

研究证实，肺动脉平滑肌细胞增殖是肺动脉高压程度加重的原因之一［6,7］，磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B-内皮型一氧化氮合酶（PI3K/Akt-eNOS）信号通路在各种细胞生长、迁移及增殖的调节中起着重要作用，内皮型一氧化氮合酶（eNOS）受磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB/ Akt）的调控［9-11］。

目前尚未有实验证据表明丹参酮IIA 治疗野百合碱所致大鼠肺动脉高压与PI3K/Akt-eNOS 信号通路有关。

结合文献调查及前期预实验基础，我们推测丹参酮IIA可能通过调控PI3K/Akt-eNOS信号通路发挥改善肺动脉高压的作用，故本文进行了初步探索，现报道如下。

1材料和方法
1.1实验动物
雄性无特定病原体（SPF）级Sprague-Dawley（SD）大鼠100只，体质量169~225g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京) 2018-0044。

SD大鼠饲养于25℃恒温，相对湿度50%，常规饲料与自由饮水，以及12h光照/黑暗交替循环的屏障环境中。

所有动物处理和程序均经南方医科大学动物保护和使用委员会批准。

1.2试剂
野百合碱（MCT）（Sigma-aldrich）；PI3K抑制剂LY294002（Sigma）；细胞核染料4'，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI,Partec Flow Cytometry Technology）；RIPA裂解液（Cell Signaling Technology）；超敏型电化学发光显色（ECL）试剂盒（赛默飞世尔科技公司）。

1.3仪器
蛋白电泳仪、转膜仪及Quantity One1-D分析软件购自Bio-Rad公司；BL-420S生物机能实验系统购自成都泰盟科技有限公司；HistoCore Arcadia包埋机（EG1150H）与手动转轮石蜡切片机（RM2235）购自上海莱卡仪器有限公司。

1.4动物分组及处理
将购买的100只SD大鼠（动物质量合格证号：ZS-2020-0617）饲养1周后随机分为5组（20只/组）。

模型组（MCT）、丹参酮IIA组（TIIA）、丹参酮IIA+PI3K抑制剂组（TP）、PI3K抑制剂组（PI）均先颈背部皮下注射MCT60mg/kg进行造模，对照组（Control）注射等体积的生理盐水。

造模2周后，丹参酮IIA组腹腔注射丹参酮IIA10mg/kg、丹参酮IIA+PI3K抑制剂组腹腔注射丹参酮IIA10mg/kg+PI3K抑制剂1mg/kg，PI3K抑制剂组注射PI3K抑制剂1mg/kg，对照组和模型组腹腔注射等体积生理盐水，连续2周。

1.5大鼠右心室收缩压和右心室肥厚指数的测定
各组大鼠饲养4周后，终止实验，将大鼠腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg进行麻醉，经颈行正中切口，找到右颈外静脉并分离出，采用经颈静脉右心导管插管的方法检测右心室收缩压（RVSP），记录数值，立即处死大鼠取出心脏，剪去心房和心耳，分别称量右心室、左心室和室间隔的质量，采用滤纸吸干血液后称质量，右心室肥厚指数（RVHI）=右心室质量/（左心室质量+室间隔质量）。

1.6苏木精-伊红（HE）染色
取各组大鼠肺组织置于4%多聚甲醛中固定24h，然后进行脱水、石蜡包埋和切片，最后再经过苏木精染色、1%盐酸乙醇分化、返蓝、伊红染色、脱水、透明、中性树胶封片等步骤即可观察大鼠肺血管形态。

WT%=（2×WT/ED）×100%。

（WT：管壁厚度；ED：血管外径）。

1.7α-SMA免疫荧光染色
取各组大鼠肺组织置于4%多聚甲醛中固定24h，然后进行脱水、石蜡包埋和切片，再经过α-SMA免疫荧光染色以观察大鼠肺血管形态。

1.8Western blot实验
（1）提取大鼠肺组织总蛋白并取10μL进行电泳，电泳条件：电压先设为80V，当溴酚蓝泳动至分离胶后调升至120V至溴酚蓝达分离胶底部；（2）转膜：100V 电压水浴2h，蛋白转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜；（3）封闭：PVDF膜浸泡于5%牛血清白蛋白（BSA），室温下封闭2h；（4）过夜：将磷酸化的信号通路抗体（PI3K、Akt、eNOS）用5%BSA稀释至工作浓度4℃孵育过夜；（5）洗膜：将辣根过氧化物酶结合的二抗用5%BSA稀释至工作浓度，与PVDF膜于室温下作用1h；再次洗膜，在PVDF 膜上滴加适量的ECL发光试剂，室温下作用1min，用GelDocTM+系统进行曝光。

用Quantity One1-D分析软件对条带进行灰度扫描，并对其进行定量分析。

1.9ELISA实验
试剂盒购自研域（上海）化学试剂有限公司，操作按照试剂盒说明严格进行。

1.10统计学处理
数据采用GraphPad Prism8软件进行处理，所有数据用均数±标准差表示，多组样本间差异使用单因素方差分析比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

所有的实验都是独立重复3次。

2结果
2.1丹参酮IIA对MCT诱导大鼠右心室收缩压和右心室肥厚指数的影响
对照组大鼠右心室收缩压和右心室肥厚指数正常，
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·719
分别为（13.1±0.55）和（0.21±0.02），而模型组大鼠右心室收缩压和右心室肥厚指数明显增加，分别为（28.9±1.35）和（0.53±0.03），差异具有统计学意义（P <0.001）。

丹参酮IIA 组右心室收缩压和右心室肥厚指数较模型组显著降低，分别为（17.9±0.75）和（0.35±0.02），差异具
有统计学意义（P <0.001）。

丹参酮IIA+PI3K 抑制剂组
为（27.3±0.76，P =0.18）和（0.5±0.02，P =0.25），PI3K 抑制剂组为（27.6±1.05，P =0.32）和（0.49±0.02，P =0.10），差异无统计学意义（P >0.05，图1）。

图1丹参酮IIA 对MCT 诱导大鼠右心室收缩压和右心室肥厚指数的影响
Fig.1Effect of tanshinone IIA on right ventricular systolic blood pressure (RVSP ,A )and right ventricular
hypertrophy index (RVHI,B )in MCT-treated rats.***P <0.001vs MCT group.
A B 35
3025
20151050
R V S P
Control
MCT
TIIA
TP
PI
***
***
***
***
Control
MCT
TIIA
TP
PI
R V H I
0.7
0.6
0.50.40.30.20.1
02.2丹参酮IIA 对MCT 诱导大鼠肺动脉中膜厚度影响
HE 染色结果见图2。

对照组大鼠肺组织血管厚度正常，肺小动脉（直径<100µm ）血管中层约占血管总横截面积（21.12±3.40）%，而模型组大鼠肺小动脉中膜厚度明显增加，约占血管总横截面积（46.37±2.29）%，差异具有统计学意义（P <0.001）。

与模型组比较，丹参酮IIA 组肺小动脉中膜厚度较模型组显著降低，约占血管总横截面积（35.28±3.46）%（P =0.006），差异具有统计学意义（P <0.01）。

丹参酮IIA+PI3K 抑制剂组为（43.17±3.56）%（P =0.59），PI3K 抑制剂组为（41.24±3.34）%（P =0.23），
差异无统计学意义（P >0.05）。

2.3丹参酮IIA 对MCT 诱导大鼠肺小动脉肌化影响
肺小动脉肌化程度如图3所示。

对照组完全肌化肺小血管比例为（12±2.46）%，而模型组大鼠完全肌化肺小血管比例高达（51.37±5.45）%，差异具有统计学意义（P <0.001）。

丹参酮IIA 组完全肌化肺小血管比例较模型组显著降低，约占（13.17±2.95）%，差异具有统计学意义（P <0.001）。

丹参酮IIA+PI3K 抑制剂组为（48.25±4.13）%（P =0.71），PI3K 抑制剂组为（47.39±3.14）%（P =0.53），差异无统计学意义（P >0.05）。

Control
MCT
TIIA
TP PI
A
B ***
**
Control
MCT
TIIA TP PI
W a l l t h i c k n e s s
60
50
403020100图2丹参酮IIA 对MCT 诱导大鼠肺动脉中膜厚度影响
Fig.2Effect of tanshinone IIA on MCT-induced pulmonary artery intima-media thickening in rats.A :HE staining (Original
magnification:×200).B :Wall thickness.**P <0.01vs MCT group;***P <0.001vs MCT group.
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·
·720
B ***
***
Control
MCT
TIIA
TP
PI
M u s c u l a r i z a t i o n (%)Control
MCT
TIIA
TP
PI
A
140
120100806040200图3丹参酮IIA 对MCT 诱导大鼠肺小动脉肌化影响
Fig.3Effect of tanshinone IIA on MCT-induced pulmonary arteriole muscularization in rats.A :α-SMA immunofluorescent staining (×200).B :Proportion of fully muscularized pulmonary small vessels.***P <0.01vs MCT group.
2.4丹参酮IIA 抑制PI3K/Akt-eNOS 信号通路
PI3K 、Akt 、eNOS 蛋白表达情况如图4所示。

与模型组比较，对照组大鼠肺组织PI3K 、Akt 、eNOS 蛋白磷酸化程度增加（P <0.001）；丹参酮IIA 组大鼠肺组织PI3K 、Akt 、eNOS 蛋白磷酸化程度增加（P <0.001）；
丹参酮IIA+PI3K 抑制剂组和PI3K 抑制剂组p-PI3K 和p-Akt 、p-eNOS 的表达与模型组相比无明显差异（P >0.05）。

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Control MCT TIIA TP PI
P-PI3K PI3K P-AKT AKT P-eNOS eNOS GAPDH
Control
MCT
TIIA
TP
PI
1.2
1.0
0.80.60.40.20P -P I 3K /P I 3K
***
***
Control
MCT
TIIA
TP
PI
1.2
1.0
0.80.60.40.20P -A K T /A K T
***
***
Control
MCT
TIIA
TP
PI
1.2
1.0
0.80.60.40.20P -e N O S /e N O S
***
***
A
B C D 图4PI3K/Akt-eNOS 信号通路蛋白表达情况
Fig.4The protein expression of PI3K/Akt-eNOS signaling pathway.A :The expressions of P-PI3K,PI3K,
P-AKT,AKT,P-eNOS,eNOS,GAPDH were analyzed by western blot.(B -D ):The phosphorylated protein bands were standardized to total protein expression bands.***P <0.001vs MCT group.
110000110000
600006000014000014000037000
M r ·
·721
2.5丹参酮IIA 降低MCT 诱导大鼠血清中eNOS 、NO 含量
对照组大鼠血清中eNOS 、NO 含量分别为（12.11±1.48）μmol/L 和（33.61±4.03）μmol/L ，模型组大鼠血清中eNOS 、NO 含量降低，分别为（3.69±0.36）μmol/L 和（7.37±1.05）μmol/L ，差异有统计学意义（P <0.001）；而丹参酮IIA 组大鼠血清中eNOS 、NO 含量增加，分别为（10.78±2.37）μmol/L 和（32.45±3.98）μmol/L ，差异有统
计学意义（P <0.001）；丹参酮IIA +PI3K 抑制剂组和
PI3K 抑制剂组与模型组比较，大鼠血清中eNOS 、NO 含量降低轻度增加，丹参酮IIA+PI3K 抑制剂组大鼠血清中eNOS 、NO 含量分别为（4.12±2.06）μmol/L （P =0.99）和（8.18±2.18）μmol/L （P =0.99），PI3K 抑制剂组大鼠血清中eNOS 、NO 含量分别为（4.08±1.13）μmol/L （P =0.99）和（7.98±1.12）μmol/L （P =0.99），差异无统计学意义（P >0.05，图5）。

图5丹参酮IIA 降低MCT 诱导大鼠血清中eNOS 、NO 含量
Fig.5Tanshinone IIA reduces serum levels of eNOS (A )and NO (B )in MCT-treated rats.***P <0.001vs MCT group.
A B 30
25
20151050
e N O S (μm o l /L )
Control
MCT
TIIA
TP
PI
***
***
***
***
Control MCT TIIA TP PI
N O (μm o l /L )
45
4035302520151050
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3讨论
PAH 被称作心血管里的癌症，是一种罕见的致命的高危心肺血管疾病［12］，会引起各种各样的并发症，如缺氧导致的呼吸困难，甚至是呼吸功能不全以及紫绀，右心房功能不全导致的肝硬化、房颤、水肿、发育不良、急性
心脏病等，在严重的时候还会导致意外的猝死［13-16］。

因此，采用积极有效的治疗措施是预防和治疗PAH 的关键。

目前，PAH 治疗在用药方面存在一定的困难，一方面是无特效治疗药物，另一方面是目前绝大部分治疗药物未纳入医保，这给患者带来极大的经济负担。

丹参是一种中药制剂，在市场上比较受欢迎，并且在治疗肺动脉高压中有着较好的疗效［17,18］，而丹参酮IIA 是其主要有效成分之一，且野百合碱诱导的肺动脉高压模型简单、可靠且在经济上适用。

因而，本研究拟探究丹参酮IIA 治疗野百合碱诱导大鼠肺动脉高压的作用机制。

丹参酮ⅡA 是一种含量在丹参中最丰富，效果最佳
的水溶性衍生物，广泛用于心血管疾病的治疗［19,20］。

刘
礼姣等［21］
通过研究发现丹参酮IIA 可通过调控低氧肺动脉平滑肌细胞中PI3K/Akt 信号通路从而改善PAH 中肺血管重构，但尚没有研究证实丹参酮IIA 在野百合碱诱导大鼠肺动脉高压中的作用机制。

PI3K/Akt-eNOS 信号通路在调控炎症反应和氧化应激中起着重要的作用［22,23］，也参与野百合碱诱导的大鼠PAH 的发生和发展中，可阻止疾病的进程。

有研究报道，PI3K 和Akt 是涉及细胞生长、生存的关键蛋白，PI3K/Akt-eNOS 通路激活能够导致Akt 的473位丝氨酸及eNOS 的1179位丝氨酸磷酸化，可影响肺动脉平滑肌细胞增殖，从而抑制肺血管壁重构，舒张血管，促进NO 的合成与分泌，改善右心功能的作用，治疗肺动脉高压［24-26］。

李敏静等［27］通过研究发现血府逐瘀汤治疗PAH 可能是通过抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路活化从而减轻肺血管重构
有关。

王立鹤等［28］
通过研究发现N-乙酰半胱氨酸可通过激活PI3K-Akt-eNOS-NO 通路实现对慢性阻塞性肺疾病肺动脉高压大鼠的临床症状。

本研究通过测量不同组别大鼠的肺动脉压力，发现丹参酮IIA 能降低MCT 诱导的肺动脉高压。

通过对各组大鼠肺动脉中膜厚度进行研究，发现丹参酮IIA 组肺小动脉中膜厚度较模型组显著降低，而丹参酮IIA+PI3K 抑制剂组和PI3K 抑制剂组肺小动脉中膜厚度与模型组无显著差异，这提示丹参酮IIA 可能是通过调控PI3K 信号通路降低MCT 诱导大鼠肺动脉中膜厚度。

且通过同样的方法研究丹参酮IIA 对MCT 诱导大鼠肺小动脉肌化的影响，通过对比各组大鼠完全肌化肺小血管比例，发现丹参酮IIA 对MCT 诱导大鼠肺小动脉肌化的影响与丹参酮IIA 对MCT 诱导大鼠肺动脉中膜厚度影响一致，进一步证实丹参酮IIA 可能是通过调控PI3K 信号通路治疗肺动脉高压。

此外，通过对不同组别的肺动脉高压大鼠PI3K 、Akt 、eNOS 蛋白表达进行分析，发现与模型组大鼠相比，丹参酮IIA 组大鼠肺组织PI3K 、Akt 、eNOS 蛋白磷酸化程度显著增加，而丹参酮IIA+PI3K 抑制剂组和PI3K 抑制剂组与模型组比较无显著性差异，这提示丹参酮IIA
··722
可能是通过激活PI3K/Akt-eNOS信号通路发挥治疗PAH的作用，且这一作用可被PI3K抑制剂LY294002所阻断。

肺动脉内皮细胞能够调节肺血管收缩与舒张，其结构在缺氧、炎症等因素的作用下易受损，使NO、前列环素等合成和分泌失衡，从而导致血管中膜层增厚，非肌型小动脉肌化，最终导致肺血管重构［29,30］。

在肺细小血管的重建中，NO起着重要作用，而在内皮细胞中下调eNOS表达可减少NO的生成［31］。

从本研究结果对各组大鼠血清中eNOS、NO含量的比较中可以看出，丹参酮IIA可以上调eNOS、NO的表达，扩张血管，利于肺动脉高压的治疗。

综上所述，本研究首次证明丹参酮IIA对野百合碱诱导大鼠肺动脉高压起着良好治疗效果的原因主要在于通过介导PI3K/Akt-eNOS信号通路实现的，这为进一步研究肺动脉高压的发病机制和治疗方法提供了科学依据。

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（编辑：余诗诗）
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