猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒同步检测和鉴别诊断方法的建立

中,兽医科学 2020,50(12): 1515-1521
Chinese Veterinary Science网络首发时间：2020-10-20 D O I：10.16656/j.issn.l673-4696.2020.0211中图分类号：S852.659.6 文献标志码：A文章编号：1673-4696(2020) 12-1515-07
猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒同步检测
和鉴别诊断方法的建立
史喜菊，刘全国，李炎鑫，赖平安，刘艳华，徐立伟，马贵平
(中国海关科学技术研究中心，北京100026)
摘要：为了准确鉴别猪流感病毒(S1V)和猪繁殖与呼吸综合征病毒（P R R S V)的感染，本研究建立了可同时检测和鉴别SIV、N A-P R R S V和E U-P R R S V的一步法多重荧光R T-P C R方法，并进行了临床应用。

研究结果表明，所建立的多重荧光R T-P C R最低检测限可达1〜10copies/n L，特异性为100%。

SIV、N A-P R R S V和 E U-P R R S V单荧光R T-P C R与多重荧光R T-P C R相比，相关性系数硭值大于0.999，所有扩增效率£值均 在9 0%〜10 0%之间，扩增性能良好，多重混合对特异性和敏感性未产生明显干扰。

对病毒核酸样品的验证100%符合，从89份N A-P R R S V阳性样品中检测出N A-P R R S V阳性88份（88/89)，从28份S1V阳性样品中检测出S I V阳性28份（28/28)，从这两类阳性样品中检测出S I V和N A-P R R S V双阳性4份（4/117);从82 份N A-P R R S V阴性样品中检测到E U-P R R S V和S I V阳性各1份；从105份未知感染状态的临床样品中筛查出2份S I V阳性和3份N A-P R R S V阳性。

本研究建立的多重荧光R T-P C R方法实现了 一次检测同时鉴别多种病毒的目的，适用于猜流感和诸繁殖与呼吸综合征混合感染的快速筛查。

关键词：多重荧光R T-P C R;猪流感病毒；猪繁殖与呼吸综合征病毒；混合感染
Establishment of multiplex real-time RT-PCR for simultaneous detection and differentiation of SIV and PRRSV
SHI Xi-ju,LIU Quan-guo,LI Yan-xin,LAI Ping-an,LIU Yan-hua,XU Li-wei,MA Gui-ping
(Science and Technology Research Center of China Customs , Beijing 100026,C/zm«)
Abstract：To distinguish accurately between infections with swine influenza virus (S I V)and porcine respiratory and reproductive syndrome virus (PRRSV),one multiplex real-time RT-PCR to detect and differentiate simultaneously the infection of SIV and genotypes of North American PRRSV (NA-PRRSV) and European PRRSV (EU-PRRSV)is established and validated in this study.The results showed that all the real-time RT-PCR has good amplifications with amplification efficiencies(E) of 90%—100% ,the correlation coefficients(/?) of over 0. 999 and specificity of 100% ,and the detection limit is 1—10 copies/ f J-L.No significant difference is observed between any single real-time RT-PCR and multiplex ones,which indicates multiplexing the three targets into one reaction did not cause any interruption on specificity,sensitivity and correlations.Method validation tests showed that the newly developed multiplex real-time RT-PCR produced the expected results,with 88 samples were test positive for NA-PRRSV from known 89 positive NA-PRRSV samples,28 samples were test positive for SIV from known 28 positive SIV samples,and 4 samples were test positive for both NA-PRRSV and SIV among them. 1 sample was test positive for EU-PRRSV and SIV,respectively,from known 82 negative NA-PRRSV samples.2 positive SIV and 3 positive NA-PRRSV were screened,respectively,from 105 unknown clinical samples.The method
收稿日期：2020-09-09;修回日期：2020-10-15
基金项目：“十三五”国家重点研发计划项目（2016YFD0500705)
作者简介：史喜菊（1975-)，女，山西乡宁人，研究员，博士，研究方向为动物疫病的检测诊断，E-mail:******************〇m。

1516中国兽医科學第50卷
developed here can be used to rapidly screen the mix-infection with SIV and PRRSV,this provides a good alternative to detect and differentiate simultaneously co—infections of multi-pathogens based on one single reaction.
Key words ：real-time R T-P C R；SIV ；N A^P R R S V；E U-P R R S V；Mix-infection
猪流感（swine influenza,SI)和猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, P R R S)分别是由猪流感病毒（swine influenza virus, S I V)和猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproduc- tive and respiratory syndrome virus，P R R S V)弓I起的 猪的高度接触、易感性传染病，被世界动物卫生组织(O I E)列为必须通报的动物疫病，也是我国动物和动物产品国际贸易中的重要检疫对象[Hi]。

P R R S V可 分为北美株（N A-P R R S V)和欧洲株（E U-P R R S V)两 个基因型，与S I V—样，感染后均引起猪只高热、咳 嗽、呼吸闲难等症状，临床上难以鉴別[3_8]。

目前的检 测标准都是针对单一病原，多病原检测需要多次进行，费时费力，不能满足批量动物和产品快速通关的需求，而且如果条款中没有要求检测某种疾病，但事 实上动物可能已经感染了，还会造成漏检，难以全面、真实地反应感染状态和发病死亡原因。

本研究是在前期建立的多病原同步检测技术基础上[M1],以 S I V、N A-P R R S V和E U-P R R S V为研究对象，建立了可同时检测和鉴别诊断这三种病原的多重荧光R T-P C R 方法。

1材料与方法
1.1试验材料
S I V、N A-P R R S V和E U-P R R S V阳性质控品均为笔者所在实验室制备的基因片段体外转录c R N A[9〜]。

测试所用的猪传染性胃肠炎病毒（T G E V)、口蹄疫 病毒（F M D V)、猪瘟病毒（C S F V)、猪圆环病毒2型 (P C V-2)、伪狂犬病毒（P R V)等均为笔者所在实验室保存的核酸质控品>11]和检测留样。

1.2主要试剂
p G E M-丁克隆载体和 Riboprobe R N A Produc­tion System_T7 体 外转录试剂为 Promega 公司产品。

Ex T a q P C R试剂为宝生物工程（大连）有限公司产品。

Path-ID Multiplex one-step R T-P C R kit 为 A B 公司产品。

T I A N a m p Virus D N A/R N A Kit为天根生化科技（北京）有限公司产品。

1.3引物和探针设计与合成
下载 G enBank 中现有 S I V、N A_P R R S V 和 E U- P R R S V所有分离株基因，使用C L C M a i n Workbench 7.0.3和BioEditor 1.6.1分析软件进行多重比较。

分别选取S I V的M基因、N A-P R R S V和E U-P R R S V的 N基因作为扩增靶基因，根据多重荧光R T-P C R特 点分別设计并筛选出能覆盖大部分分离株且适合多重检测并可以区分的引物和探针，序列见表1。

引物和探针由宝生物T.程（大连）有限公司合成，灭菌 水稀释成100m m〇l/L的储藏液，一20°C保存备用。

1.4阳性质控品的制备和浓度测定
按照常规方法制备阳性质控品〜1]，SIV阳性质 控品为M基因体外转录c R N A U l V-M-c R N A K N A- p R R S V和 E U-P R R S V 阳性质控品为 N 基因体外转录 c R N A(N A_P R R S V-N-c R N A和 E U-P R R S V-N-c R N A)。

制备好的阳性质控品经测序确认后测定其D2W和D2W 值，根据拷贝数（copies/V L)=(6.02X1〇23)X(n g/p L X10，/片段长度(bp)X660,计算拷贝数,并于一 20°C 保存备用。

1.5 多重荧光R T-P C R反应
将引物和探针储备液按照引物终浓度400 nmol/L 和探针终浓度200 nmol/L的要求分别进行10倍稀 释和混合，引物混合液包括7条S I V引物、6条N A- P R R S V引物和9条E U-P R R S V引物，探针混合液包括了 1 条 SIV 探针和 N A-P R R S V、E U-P R R S V 探针各2条（见表1)。

配制多重荧光R T-P C R反应体系，包括 2 X Multiplex R T-P C R缓冲液 10 p L、Multiplex 酶混合液1P L、引物混合物0.8 n L(终浓度400 nmol/L)、探针混合物0_4nmol/L (终浓度200 nmol/L)、R N A模板1m L或者病毒总核酸5 m L，D E P C处理水调至总体积20 p L。

将混合液充分混合后，最后加人模板，简短离心，按照下列程序进行荧光R T-P C R反应：48°C 10 m i n、95 °C 10 m i n;95 °C 15 s、60 °C 45 s，44 个循环。

所用设备为B i o R a d公司的C F X-96多重荧光定量P C R仪。

1.6标准曲线的绘制和最低检测限的确定
分别将已知浓度的SIV、N A-P R R S V和E U-P R R S V 阳性质控品从1CT1到1011进行10倍梯度稀释，进 行荧光R T-P C R反应，用模板浓度-荧光c t值做单荧光R T-P C R浓度标准曲线，最高稀释倍数能检测出的C t值所对应的浓度即为单荧光R T-P C R最低 检测限。

再将已知浓度的S I V、N A-P R R S V和E U-P R R S V
第12期史喜菊等：猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒同步检测和鉴别诊断方法的建立1517表1猪流感和猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重荧光R T-PC R检测的引物和探针
Table 1Primers and probes of one-step multiplex real-time RT-PCR for SIV .NA-PRRSV and EU-PRRSV
病毒靶基因引物/探针序列（5'—3')片段大小/bp覆盖序列数Virus Target gene Primers/probes Sequences Product size Covered sequences
FP1CCAGCCWGTCAATCAGCTGT
FP2CCAGCCGGTCAATCAGCT
北美型猪FP3CCAGCCAGTCAACCAGCT
繁殖与呼吸综合征病毒N基因RP1GGCTTCTCCGGGTTTTTCTTY
111989 Gene N RP2GGCTTCTCCGGGCTTTTCT
NA-PRRSV RP3GGGCTTCTCCGGGTTTTTATTC
Probel FAM-CGGTCCCTTGCCTCTGGAC-BHQ1
Probe2FAM-CCGGTCCCTTRCCTCTRGACT-BHQ
FP1CCAGCCAGTCAATCAACTGTG
FP2GCCAGTCAGTCAATCAACTGTG
欧洲型猪FP3CCAGCCAGTCAATCAGCTGT FP4GCCAGTCAGTCAATCAGCTGT
繁殖与呼吸N基因
RP1丁CATCTTCWGCAGCCAGGG
综合征病毒Gene N
RP2TCATCTTCAGCAGCCAAGGG133799 EU-PRRSV
RP3TCATCTTCAGCAGCTAGGGGA
RP4TCATCTTCAGCAGCTAAGGGAAA
RP5TCATCTTCAGCGGCCAGG
Probel HEX-TGATRAARTCCCAGCGCCAGC-BHQ1
Probe2HEX-ATGATAAGGTCCCAGCGCCAG-BHQ1
FP1CCTGTCACCTCTGACTAAGGG
FP2ATCCTGTCACCTCTGACTAAAGG
FP3ATCTTGTCACCTCTGACTAAGGG
猪流感病毒M基因FP4CCTGTCACCTCTGACCAAGG
831528 SIV Gene M RP1CGTCTACGCTGCAGTCCTC
RP2CGTCTACGCTGWAGTCCTCG
RP3CGTCTACGTTGCAGTCCTCG
Probe Cy5-ACGCTCACCGTGCCSAG-BHQ2
阳性质控品等量混合，10 1到10 11进行10倍梯度稀释，进行多重荧光R T-P C R反应，用模板浓度-荧光C,值做多重荧光R T-P C R浓度标准曲线，最高稀释倍数能检测出的C；值所对应的浓度即为多重荧光R T-P C R最低检测限。

1.7特异性测试
选择了实验室储备的猪传染性胃肠炎病毒(T G E V)、口蹄疫病毒（F M D V)、猪瘟病毒（C S F V)、猪圆环病毒2型（P C V-2)、伪狂犬病毒（P R V)、非洲 猪瘟病毒（A S F V)、水泡性口炎病毒（V S V)、猪细小病毒这8种病毒质控品，分别用SIV、N A-P R R S V和 E U-P R R S V的引物和探针进行了单荧光R T-P C R，验证引物和探针的特异性。

用建立的多重荧光R T-P C R反应体系同时对上述8种病毒质控品进行检测，验证引物和探针混合后多重反应体系的特异性。

1.8 多重荧光R T-PC R和单荧光R T-PC R的比较
将S I V、N A-P R R S V和E U-P R R S V阳性质控品等量混合后进行10倍梯度稀释，分别进行多重荧光R T-P C R和单荧光R T-P C R,将相同浓度模板对应的荧光值进行比较，求解回归方程，比较多重荧光R T-P C R和各单荧光R T-P C R的符合性。

1.9方法验证和临床样品的检测
利用建立的多重荧光R T-P C R对本实验室保存的细胞培养病毒核酸进行了验证，包括SIV 5份、P P R S V-N A 10 份、E U-P R R S V 2 份。

对收集到的 89 份已知N A-P R R S V阳性样品、82份已知N A-P R R S V 阴性样品、28份已知S I V阳性样品及25份已知SIV 阴性样品进行了检测并与单荧光R T-P C R进行了比较。

这些已知感染状态的样品部分来自中国疾病预防控制中心保存的核酸样品，部分是本中心保存的核酸留样。

另外，用本研究建立的多重荧光R T -
1518
中国兽医科学
第50卷
模板起始量值 log starting quantity
|~〇
Sundard
X U nknow n
[---Cy5
E-96 4%
999 Stepe-^ 362 y-rt-M 659
__________模板起始M 值 log starting quantity
〇 Standard
X U oiuK m n
—
HEX
E- 95.7X R*2«0 996 SJooe-4.429 y-rt-06 640
..' H sL ............
B
.............
'；
................—
....丨二
模板起始量值 log starting quantity
〇 Stanoanl
X U n k n o w n
PAM
E»91 1% RA 2««.996 Stepe--3-»6y-««-39 011
P C R 对临床米集的未知感染状态的105份样品进行 了筛选，并与本研究中的单荧光R T -P C R 以及本中心使 用的国家标准和行业标准进行了符合性测试。

2
结果
2.1阳性质控品的定量检测
将制备好的阳性质控品，分别用紫外分光仪测 定260 n m 和280 n m 波长下的吸光度值并计算出浓 度和拷贝数，见表2。

2.2标准曲线和最低检测限的检测
分别用S I V 、N A -P R R S V 和E U -P R R S V 质控品 做单荧光R T -P C R 标准曲线，如图1。

从图1可以看 出，标准曲线P C R 扩增效率E 值、硭和曲线斜率均 在正常范围内，说明扩增效率良好。

将模板进行10 11 稀释仍能检测到荧光信号。

根据表2浓度，计算出 对应的最低检测限在2.41〜9.15(：(^63//^之间。

SIV、N A -P R R S V 和E U -P R R S V 混合质控品做多 重荧光R T -P C R 标准曲线如图2。

从图2可以看出， 多重荧光R T -P C R 扩增效率£值分别为92.7%、 99.6%和 100.3%，茫值分别为 0.996,0.999 和0.999, 曲线斜率均在正常范围内，说明扩增效率并没有受 到多重干扰。

相同稀释倍数对应的C ；值比单荧光 R T -P C R 略有升高，但不构成显著差异，最低检测限 仍然可达10 copies/p L 。

2.3特异性检测
单个病毒的引物和探针只能扩增出各自的病毒 核酸，其他病毒模板的扩增均为阴性，表明所设计的 引物和探针特异性良好。

利用建立的多重荧光R T - P C R 方法对 S I V 、N A -P R R S V 和 E U -P R R S V 及 1.7 中所列8种病毒进行检测，结果仅S I V 、N A -P R R S V 和E U -P R R S V 有扩增曲线，其他病毒均无特异性扩 增信号，表明所建立的方法特异性良好，多重并没有
表2阳性质控品纯度及含量测定
Table 2 cRNA purity and quantity measurement of positive controls
样品名称 Control names ^260^280D '2s 〇/ D j s o
浓度/(卩g 〇 Concentration
片段大小/bp Product size
拷贝数浓度/(copies* m L J
Copy concentration
SIV-M-cRNA 0. 450. 23 1.933. 60982 2. 41X 1011NA-PRRSV-N-cRNA 0. 280. 15 1.912. 243723. 72X 1011EU-PRRSV-N-cRNA
0. 72
0.37
1.95
5. 76
387
9. 15X 1011
5
5
3 3 2 2a 蜮 a
5
3 2 2J
B > _0 埏 a
5
3 2 2J B A a "埏 a
图 1 SIV (A )、NA_PRRSV (B )与 EU-PRRSV (C )的荧光 RT-PCR 标准曲线
Figure 1 Standard curve of SIV (A ), NA-PRRSV (B ) and EU-PRRSV (C ) real-time RT-PCR
第12期史喜菊等：猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒同步检测和鉴別诊断方法的建立1519
^=3.4204a ：+11.526 ^R^O.9991^
单一 EU-PRRSV
Single EU-PRRSV
^=3.527 lx+11.093
三重 Triplex 单一 SIV
Single SIV
R^O.9991
l 〇-3 10^ i 〇-5 10 竓 丨〇-7 10-8
模板稀释浓度
Template diluted concen 丨rions
针放在一个反应体系混合后并没有相互干扰，结果 如图3。

2.5临床检测和验证
用本研究建立的多重荧光R T -P C R 分别对5 份 S I V 、10 份 P P R S V -N A 和 2 份 E U -P R R S V 核酸进 行验证，100 %符合。

从收集到的45份N A -P R R S V 阳性组织样品中检测到45份N A -P R R S V 阳性，从 44份N A -P R R S V 阳性血液样品中检测到43份 N A -P R R S V 阳性，其中1份是N A -P R R S V 和S I V 双 阳性；从28份S I V 阳性组织样品中检测到S I V 阳性 28份，其中有3份是S I V 和N A -P R R S V 双阳性；从 82份P R R S V 阴性样品中检测到E U -P R R S V 和SIV 阳性各1份；对25份S I V 阴性样品的检测结果均为 阴性，均与单荧光R T -P C R 结果符合。

对105份不 明感染状态样品进行检测，筛查出2份S I V 阳性和 3份N A -P R R S V 阳性，与单荧光R T -P C R 及国家和 行业标准核酸检测结果符合，详见表3。

3
讨论
目前荧光P C R 技术已在动物病原核酸检测领 域广泛使用〃气针对单病原检测的不足，也建立了 各种各样的多重P C R 检测方法[11_15]，这些方法操作 简便性、敏感性和特异性各异，推广应用受限。

本研
0 --------1--------1--------1--------1--------11〇-3 10^ 10-5 10-6 丨〇-7 10^
模板稀释浓度
Template (丨iluted concentrions
353025
20
15
图 2 SIV 、NA-PRRSV 和 EU-PRRSV 多重焚光 RT-PCR
标准曲线
Figure 2 Standard curve of multiplex real-time RT-PCR
of SIV, NA-PRRSV and EU-PRRSV
对特异性产生干扰。

2.4 多重荧光R T -PC R 和单荧光R T-PCR 的比较
利用相同浓度的混合模板同时进行多重荧光 R T -P C R 和单荧光R T -P C R 的符合性测试，回归方 程计算结果表明，S I V 、N A -P R R S V 和E U -P R R S V 单 突光R T -P C R 与多重荧光R T -P C R 的相关性系数 分别为0.999 7、0刃99 1和0.999,说明多重荧光 R T -P C R 和各单荧光R T -P C R 的符合性良好，对于 相同浓度的模板，其Q 值基本一致，所有引物和探
图 3 S IV (A )、N A -PR R SV (B )、EIJ-PRRSV(C )单荧光 RT-PCR 与多重荧光 RT-PCR 的比较
Figure 3 Comparisons between SIV (A), NA-PRRSV (B) and EU-PRRSV (C) singular real-time RT-PCR and multiplex
1
5 0 5 0 13 2 2 1 1 5
J 0
a i s ^ a
J o
5
o 5
o
n
3 2 2 1
1
c
l > a
i s H a
real-time RT-PCR
1520中国兽医科学第50卷表3临床检测和验证
Table 3 Validation and testing results of clinical samples
检测结果 Test ing re s u lts
样品
Samples SIV(+)NA-PRRSV(+)EU-PRRSV(+)
SIV(+)
/NA-PRRSV(+)
SIV(+)
/EU-PRRSV(+)
NA-PRRSV(+)
/EU-PRRSV(+)
SIV(+)
/NA-PRRSV(+)
/EU-PRRSV(+)
A51020000
B04500000
C14301000
D2*******
E1010000
F0000000
G2300000
A:5份S丨V、丨0份NA-PPRSV和2份EU-PRKSV核酸样品；B:45份NA-PKKSV阳性组织样品；C:44份NA-PRRSV阳性血液样品；D:28份 S1V阳性组织样品；E:82份PKRSV阴性样品；F:25份SIV阴性样品；G:105份未知样品
A：5 SIV,2 EU-PHRSV and 10 NA-PRRSV nucleic acid samples；B：45 NA-PRRSV positive tissue samples；C：44 NA-PIiRSV positive blood samples；D：28 SIV positive tissue samples；E：82 F>KKSV negative samples；F：25 SIV negative samples；G： 105 unknown samples.
究针对S I V和P R R S V临床症状相似、难以鉴别的难题，建立了可以检测并区分SIV、N A-P R R S V和E U- P R R S V的一步法多重荧光R T-P C R方法。

多重荧光R T-P C R技术难点在于引物和探针的涵盖性和混合抗干扰性，本研究在传统多重荧光R T-P C R基础上[3,5.9'15],针对G e n B a n k中现有不同
S I V、N A-P R R S V和E U+R R S V分离株序列，分别设计了 8、8和11条引物和探针（表1)，另外还使用了多个简并碱基，基本包含了 G e n B a n k中现有S I V、N A-P R R S V和E U-P R R S V分离株序列。

经过测试和筛选，引物和探针扩增效率、特异性、敏感性及相关性均良好（图1和图2)。

特异性试验表明，不管是单病原模板，还是混合病原模板，本研究建立的多重荧光R T-P C R均只能扩增出各自的目标病原，其他相关病毒均未见非特异性扩增，特异性为100%。

敏感性试验表明，对于 相同浓度的模板，多重荧光R T-P C R扩增C t值略微高于各单荧光R T-P C R,但没有显著差异，计算所得最低检测限在2.41〜9.15 copies/M U图1和图2), 达到了目前荧光P C R技术的较好敏感性指标>1()]。

多 重荧光R T-P C R与单荧光R T-P C R相关性系数R2均在0.999以上（图3)。

这些都表明本多重反应体系中的27条引物和探针混合物兼容性良好，混合没有产生明显干扰，克服了多重P C R的不足[5^15]。

验证和临床测试结果表明，已知P R R S V和SIV 阳性的样品测试基本一致，只有1份阳性P R R A V-N A 测试结果为N A-P R R S V阴性，分析是核酸放置过久造成的。

比较有趣的是，从已知的44份N A-P R R S V 阳性血液样品中检测出1份是N A-P R R S V和S1V 双阳性，从已知28份S I V阳性组织样品中检测出3 份是S I V和N A-P R R S V双阳性。

分析认为这是由于这些已知样品原来只检测了单一病原，经过本多重荧光R T-P C R筛查后，发现了实际存在S I V和N A- P R R S V混合感染。

而且，从82份P R R S V阴性样品中筛查到E U-P R R S V和S I V阳性各1份，单一病原检测存在混合感染漏检的情况。

105份临床病料的检测只筛查出2份S1V阳性和3份N A-P R R S V阳性，没有检测到混合感染。

本研究为临床上可能存在的S1V和P R R S V混合感染提供了一种快速筛查和鉴别的新途径，经过大量临床样本验证后有望在实际工作中得以应用。

参考文献（R eferen ces)
[1] WERNIKE K，HOFFMANN B,BEER M. Single-tube multi-
plexed molecular detection of endemic porcine viruses in combination with background screening for transboundary diseases [J]. Journal of Clini­
cal Microbiology,2013(3)：938-944.
[2] LI H,MCCORMAC M A,ESTES RW,et al.Simultaneous de­
tection and high-throughput identification of a panel of RNA viruses causing respiratory tract in­
fections [J].Journal of Clinical Microbiology,
2007,45(7)：2105-2109.
[3] WERNIKE K,HOFFMANN B,DAUBER M,et al.Detection and
typing of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus by multiplex re­
al-time RT-PCR[J]. PLoS One,2012,7(6)：e38251.
[4] YANG K L,TIAN Y X,ZH0U D N,et ai. A multiplex RT-PCR
assay to detect and discriminate porcine repro­
ductive and respiratory syndrome viruses in cl in-
第12期 史喜菊等：猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒同步检测和鉴别诊断方法的建立1521
ical specimens [J]. Viruses,2017,9(8) ：205.
[5] CHEN N H,YE M X,XIAO Y Z,et al.Development of uni­
versal and quadruplex real-time RT-PCR assays for
simultaneous detection and differentiation of
porcine reproductive and respiratory syndrome
viruses [J]. Transboundary Emerging Disease ,2019,
66(6)：2271-2278.
[6] NAGARAJAN M M,SIMARD G,LONGTIN D,et al. Single-
step multiplex conventional and real-time reverse
transcription polymerase chain reaction assays
for simultaneous detection and subtype differen­
tiation of influenza A virus in s^ine []]. Journal
of Veterinary Diagnostic Investigation,2010,22
(3)：402-408.
[7] CHIAPPONI C,MORENO A,BARB IER I,e t ai.Mu 11 i p 1ex RT-
PCR assay for differentiating European swine in­
fluenza virus subtypes H1N1 ,H1N2 and H3N2[J]. Jou~
rnal of Virology Methods ,2012,184(1-2) ：117-120.
[8] CRISCI E,FRAILE L,MONTOYA M.Cellular innate immu­
nity against PRRSV and swine influenza viruses
[J]. Veterinary Sciencet20\9,6(1) ：26.
[9] SHI X J,LIU X M,WANG Q,etai. A multiplex real-time
PCR panel assay for simultaneous detection and
differentiation of 12 common swine viruses [J].
Journal of Virology Methods,2016,236 ：2b8~265.
[10]史喜菊，刘艳华，李炎鑫，等.多重荧光R T-P C R同步检
测和鉴别诊断口蹄疫和水泡性口炎[J].中国兽医科
学，2020,50(10):1236-1242.
SHI Xi_ju，LIU Yan_hua，LI Yan_xin,et aJ.A multi­
Chinese Veterinary Science,2020,50 (10)：1236-1242.
(in Chinese)
[11]史喜菊，马贵平，乔彩霞，等.多重连接探针扩增(MLPA)
技术同时检测五种病毒的研究[J].农业生物技术学
报，2013,21(6):745-752.
SHI Xi~ju,MA Gui~ping,QIAO Cai~xia,et al.Simul­
taneous detection of five bovine viruses by mu-
lyiplex ligation-dependent probe amplification
[J]. Journal of Agricultural Biotechnology ,2013,
21 (6) ：745-752. (in Chinese)
[12] XU X G,CHEN G D,HUANG Y,et al.Development of mul­
tiplex PCR for simultaneous detection of six
swine DNA and RNA viruses [J]. Journal of Virology
Methods,2012,183(1)：69-74.
[13] ZHAO Y,LIU F F,LI Q M, et aJ. A multiplex RT-PCR as­
say for rapid and simultaneous detection of four
RNA viruses in swine [J]. Journal of Virology Met­
hods, 2019,269：38-42.
[14] HE Y P,ZHANG Q,FU M Z,et al.Development of multi­
plex PCR for simultaneous detection and differ­
entiation of six DNA and RNA viruses from clini-
cal samples of sheep and goats [J]. Journal of Vi­
rol ogy Methods,2017,243 ：44-49.
[15] RAO P B,WU H G J I A N G Y H,et al.Development of an
EvaGreen-based multiplex real-time PCR assay
with melting curve analysis for simultaneous de­
tection and differentiation of six viral patho­
gens of porcine reproductive and respiratory
disorder [J]. Journal of Virology Methods,2014 ,
208：56-62.
(责任编辑何知宇）
plex real-time RT—PCR method for simultaneous detection and differentiation of FMDV and VSV [J].。