利用RFP标记进行水稻籼粳杂种偏分离的遗传分析

利用RFP标记进行水稻籼粳杂种偏分离的遗传分析
刘中来;李军;瞿绍洪
【摘要】为了研究水稻籼粳杂种偏分离的遗传基础,用转化红色荧光蛋白(RFP)的7个粳稻株系与籼稻杂交,以整合在不同基因组位点的RFP为可视遗传标记,对F1花粉及F2植株进行遗传分析.根据‘7F5’转基因系的研究结果,在粳稻‘日本晴’和籼稻‘9311’杂交的遗传背景中,水稻基因组chr02:33465170位置附近存在一个花粉偏分离位点.‘9A2’转基因系组配的籼粳杂种产生1:1(RFP+:RFPˉ)比例的花粉,并且其F2植株群体发生偏分离,说明相应RFP位点(chr04:29587748)附近有一个控制F2植株偏分离的连锁位点,该位点的遗传机制与F1的花粉比例无关.RFP标记提高了籼粳杂种花粉及后代植株的研究效率,为探索偏分离遗传机理提供了新的研究手段.%To investigate the genetic basis of segregation distortion in indica-japonica hybrid of rice, seven RFP ( red fluorescent protein) transgenic lines of japonica rice were crossed with indica rice, and the inheritance of F, pollens and F2 plants was analyzed using RFP genes integrated at different genomic sites as visual genetic markers. Based on results of the 7F5 transgenic line, a locus near the rice genomic site chrO2: 33465170 was responsible for segregation distortion of F, pollens in the genetic background of the hybrid between japonica rice Nipponbare and indica rice 9311. Pollens from indica-japonica hybrid of the 9A2 transgenic line segregated in 1: 1 ( RFP+: RFP-) ratio while the Fj plants showed segregation distortion, suggesting that a locus linked to the RFP site (chi04: 29587748) controlled segregation distortion of F2 plants by a mechanism irrelevant to the segregation ratio of F, pollens. The RFP markers facilitated
analysis of pollens and progeny plants of indica-japonica hybrids and provide a new means for exploring genetic mechanisms involved in segregation distortion.
【期刊名称】《浙江农业学报》
【年(卷),期】2012(024)002
【总页数】4页(P189-192)
【关键词】红色荧光蛋白;转基因水稻;籼粳杂种;偏分离
【作者】刘中来;李军;瞿绍洪
【作者单位】浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321004;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州,310021;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州,310021;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州,310021
【正文语种】中文
【中图分类】S511.203
籼稻和粳稻是亚洲栽培水稻的两个亚种，其F1杂种蕴含巨大的生物学杂种优势。

可以利用籼粳亚种间产量性状的杂种优势，培育高产杂交水稻，或部分利用籼粳有利性状，进行水稻品种遗传改良［1］。

籼粳杂种通常表现部分不育或完全不育［2］，其杂交后代基因型分离比例在不同程度上偏离孟德尔比例，呈偏分离遗传［3］。

研究籼粳杂种偏分离的遗传机理，对于水稻籼粳杂交育种具有重要意义。

许多植物杂交群体的形态性状、同工酶标记和分子标记呈偏分离遗传［4，5］。

水稻籼粳杂种后代的许多DNA分子标记偏离3∶1的孟德尔比例［3，6－10］。

在粳稻品种间杂交的加倍单倍体(DH)和F2后代群体中，发生偏分离的RFLP或RAPD标记分别为7%和19%［11］。

偏分离与影响等位基因频率的多种遗传效应相关，例如雄配子或雌配子不育、选择性受精、杂种不育等［5，12］。

关于籼粳杂种花粉的遗传效应，主要利用回交和复交群体［5］，或者利用籼粳杂种花药培养的 DH植株［10］或花粉愈伤组织［13］，通过分子标记的分离比例进行研究。

本研究以红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)为可视遗传标记［14］，用转 RFP基因的粳稻株系和籼稻杂交，对F1花粉及F2植株的RFP基因进行遗传分析，进而解析偏分离的遗传效应，为提高籼粳杂种及其后代的研究效率、阐明偏分离遗传机理探索新的途径。

1 材料与方法
1.1 植物材料
未转化水稻包括粳稻品种‘日本晴’(Or yza sativa L.ssp.japonica
var.Nipponbare)和籼稻品种‘9311’(Oryza sativa L.ssp.indica var.9311)。

转RFP基因的‘日本晴’水稻株系(表1)为遗传稳定的T4代材料，由美国加利福尼亚大学戴维斯分校Venkatesan Sundaresan教授提供。

表1 转RFP基因的水稻株系Table 1 RFP transgenic rice lines转基因系 RFP 的水稻基因组整合位点7C4 unknown 7C6 chr02:22288933 7F5 chr02:33465170 7F9 chr02:22293953 9A2 chr04:29587748 9E1 chr02:22280105 9C6 unknown
1.2 F1杂种的配制及F1植株的种植
粳稻‘日本晴’的7个转RFP基因株系为母本，未转化籼稻‘9311’为父本，配制(转基因系/9311)F1杂种(以下简称‘籼粳杂种’)。

未转化‘日本晴’为母本，
转基因系为父本，配制与‘日本晴’遗传背景相同的(日本晴/转基因系)F1杂种(以下简称‘粳稻杂种’)。

杂交种子发芽后，用灯式荧光检测器(BLS型号，Biological Laboratory Equipment Maintenance and Service，Hungary)检测
水稻幼苗RFP红色荧光。

激发光源为FHS/LS-1G(515～588 nm)，观察 RFP的
滤光片为FHS/EF-4R2(590～660 nm)。

以未转化‘日本晴’为母本配制的粳稻杂种呈RFP阳性，据此筛除RFP阴性的假杂种。

籼粳杂种开花较迟，植株形态比较高大，据此筛除粳稻转基因系自交产生的假杂种。

每个杂交组合种植6个F1植株，随机取2株进行花粉取样和收获F2种子。

1.3 水稻种子无菌发芽
F1和F2种子在37℃干燥3～5 d，脱去颖壳，置于－20℃约24～48 h，进行种
子去休眠处理。

种子表面消毒程序为:70%酒精浸泡2 min，30%的NaClO浸泡
30 min，无菌水清洗6次(第5次浸泡30 min，其他每次均2 min)，种子置于无菌滤纸上吹干。

将灭菌种子转移到含60 mg·L－1头孢霉素的 MS培养基(MS powder 2.2 g·L－1;Phytagel 3 g·L－1;pH 5.6)，25℃培养 5～7 d。

1.4 F1花粉的激光扫描共聚焦显微观察
在F1植株开花期取颖花，常规压片，用激光扫描共聚焦显微镜(型号Leica TCS SP5)观察花粉红色荧光。

激发光波长561 nm，信号采集波长范围588～650 nm。

1.5 籼粳杂种F1植株结实率统计
选取5个籼粳杂交F1植株，统计结实和不结实小花的数目，按如下公式计算种子结实率:结实小花数/(结实小花数+不结实小花数)。

2 结果与分析
2.1 籼粳杂种F1花粉的遗传分离
粳稻‘日本晴’7个转RFP基因株系(表1)分别与籼稻‘9311’杂交，配制籼粳杂种。

同时用‘日本晴’转基因系与未转化‘日本晴’配制粳稻杂种，作为实验对照。

在激光扫描共聚焦显微镜下，粳稻杂种的成熟花粉大小一致，内含物饱满(结果未
列出)，但是籼粳杂种的花粉表现不同大小和不同内含物饱满程度(图1)。

从籼粳杂种的花粉群体选取1～2级大小和1～3级饱满程度的成熟花粉，观察是否具有红
色荧光，并进行分离比例的遗传统计分析。

结果表明，籼粳杂种F1(7F5/9311)的
花粉比例(RFP+∶RFP－)偏离1∶1期望值( χ2=12.65＞χ20.01=6.64)(表2，图2)，其他籼粳杂种及粳稻杂种对照的花粉比例符合1∶1。

根据‘7F5’亲本的
RFP基因整合位点(表1)，水稻基因组chr02:33465170位点附近存在一个花粉偏分离遗传位点。

图1 籼粳杂种的花粉大小及内含物饱满程度分类Fig.1 Classification of pollen sizes and content density of the indica-japonica hybrid of riceA:花粉大小分
为1，2，3级(顺序从左到右);B:内含物饱满程度(根据花粉颜色)分为1，2，3，4，5 级
表2 水稻籼粳杂种花粉的遗传分析Table 2 Genetic analysis of pollens from
the indica-japonica hybrids of rice＊＊极显著水平(χ20.01=6.64)籼粳杂种 F1
花粉(RFP+∶RFP－)( χ21∶1)粳稻杂种 F1花粉(RFP+∶RFP
－)( χ21∶1)7C4/9311 68∶72(0.11) NPB/7C4 99:122(2.39)7C6/9311
76∶93(1.71) NPB/7C6 119:120(0)7F5/9311 262∶350(12.65＊＊) NPB/7F5 110:103(0.23)7F9/9311 48∶44(0.17) NPB/7F9 118:133(0.9)9A2/9311
39∶40(0.01) NPB/9A2 154:131(1.86)9E1/9311 159∶142(0.96) NPB/9E1 118:115(0.04)9C6/9311 91∶103(0.74) NPB/9C6 55:49(0.35)
2.2 籼粳杂种F2植株的遗传分析
图2 籼粳杂种F1(7F5/9311)花粉的激光扫描共聚焦显微图像Fig.2 Laser-scanning confocal microscope images of pollens from the
F1hybrid(7F5/9311)左:自然光扫描图像;中:红色荧光扫描图像(RFP+花粉用箭头表
示);右:自然光和红色荧光图像叠加。

放大倍数(16×10)
收获籼粳杂种的F2种子，7个籼粳杂种(表2)的结实率介于26.8%至42.4%之间，平均值为36.2%。

F2种子发芽后进行水稻幼苗红色荧光检测，各F2植株群体的RFP发生遗传分离 (图3，表3)。

其中籼粳杂种F2(9A2/9311)植株的分离比例(RFP+∶RFP－)不符合 3∶1的孟德尔比例，偏向籼稻亲本，其他6个籼粳杂种及
7个粳稻杂种对照的F2植株的分离比例表现正常。

根据F1(9A2/9311)花粉正常
分离(表2)和F2植株呈偏分离的研究结果，‘9A2’转基因系的RFP整合位置(chr04:29587748)附近存在一个偏分离遗传位点，该位点与从F1杂种产生F2植
株的其他遗传机制相关，但与F1杂种的花粉分离比例无关。

图3 F2(9C6/9311)植株的RFP荧光检测Fig.3 RFP fluorescence assay of the
F2plants(9C6/9311)A:发芽5 d的F2水稻植株(自然光照片);B:红色荧光照片(左
边幼苗呈RFP阴性，右边呈阳性)。

3 讨论
曾经利用水稻基因组DNA分子标记，在水稻种间、亚种间或品种间杂交的衍生群体中检测到偏分离遗传位点［7，11］。

但是 DNA标记的分析工作量比较大，杂种后代群体的研究规模受到一定限制。

本研究以整合于水稻基因组的RFP荧光蛋
白为遗传标记，利用效率较高的荧光检测方法替代DNA分析方法，对籼粳杂种的大量花粉群体和F2植株群体进行红色荧光检测和遗传统计分析，提高了F1花粉
及杂种后代植株的研究效率。

因此RFP可视遗传标记作为现有DNA分子标记的
补充，为提高偏分离遗传的研究效率提供了另一条有效途径。

表3 水稻籼粳杂种F2植株的遗传分析Table 3 Genetic analysis of F2plants from the indica-japonica hybrids of rice*显著水平(χ20.05=3.84)籼粳杂种 F2
植株(RFP+∶RFP－)( χ23∶1)粳稻杂种 F2植株(RFP+∶RFP
－)( χ23∶1)7C4/9311 57∶25(1.04) NPB/7C4 66∶30(1.68)7C6/9311
70∶19(0.45) NPB/7C6 66∶32(2.67)7F5/9311 66∶29(1.27) NPB/7F5
70∶34(2.88)7F9/9311 69∶22(0) NPB/7F9 62∶29(1.94)9A2/9311
55∶31(5.02*) NPB/9A2 66∶32(2.67)9E1/9311 50∶24(1.8) NPB/9E1
66∶32(2.67)9C6/9311 79∶32(0.68) NPB/9C6 68∶31(1.78)
植物杂种后代植株的偏分离遗传与杂种的雄配子或雌配子不育、选择性受精等多种遗传效应相关［4，5，11，12］。

籼粳杂种 F1(9A2/9311)的花粉比例
(RFP+∶RFP－)为1∶1，但是其 F2植株发生偏分离，所以F2植株的偏分离与雄
配子比例无关，可能与产生F2植株的上述其他遗传效应有关。

籼粳杂种
F1(7F5/9311)的花粉发生偏分离，其F2后代植株表现正常分离，说明影响F2植
株RFP分离的遗传效应不止一种，并且各遗传效应的作用方向可能不一致。

关于花粉偏分离的遗传效应，曾经利用回交和复交群体进行间接分析［5］，或者利用花药培养的加倍单倍体(DH)后代进行研究［7，10，13］。

但是花药培养及
花粉植株的再生受其他遗传因子的影响［7，11］，DH 群体的遗传比例不能简单地等同于花粉的遗传比例。

本研究利用共聚焦显微镜检测F1花粉的RFP红色荧光，根据RFP的分离比例直接研究花粉遗传位点，并且结合F2植株的相关数据，解析影响F2植株的各种遗传效应，因此RFP遗传标记为探索植物杂种偏分离的遗传机理提供了新的研究手段。

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