游离细胞法与固定化细胞法生产L_丙氨酸的比较
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Ser. C, 1983; 4: 70 [ 19] Ca100: 137311, D oposited D oc. , v initi, 1983;
P 215 [ 20] 颜子颖, 关 国雄等. 微 生物 学报, 1995; 35( 1) :
50- 57 [ 21] 关 国 雄, 颜 子 颖 等. 生 物 化 学 杂 志, 1994; 10
al, Stabilizatio n of L -A spar dta te- -decarbo xy -
lase activity of P seudomonas dacunhae immo bi-
lized with carr ag eenan. J. Fer ment T echnol 1981, 59( 6) : 489- 493.
关键词: L-丙氨酸, 游离细胞法, 固定化细胞法, 比较
L -丙氨酸( L -Al anine, 以下简称 L -Ala)
作为一种带有特殊甜味的氨基酸, 在医药、食
品工业上的应用相当广泛。目前, L -丙氨酸
生产最有效的方法是酶法转化, 即利用培养
假单胞菌产生的 L -天冬氨酸- -脱羧酸从 L -
( 5) : 521- 525 [ 22] M ahendr a K . et al. Infect. I mmu. , 1985; 50:
534- 540
[ 23] T sai Y ch: et al. Bio chem. Bio phy l. A ct a, 1986; 883: 439
[ 24] M o hinder K . et al. Can J. M icr obial. , 1988; 34: 855
采用游离细胞法生产 L -Ala 不会面临上 述问题, 我们将含高酶活 L -Asp- -脱羧酶的 假单胞菌 30 °C, 24 h 培养后, 将培养液作为 酶源直接加固体 L -Asp 转化, 转化 7 天, 每 升酶液可转化 L -Asp 2 kg, 最高达 2. 5 kg 。 若菌体浓度按 3% 计算, 则每克菌 体可转化 L -A sp 67 g ～83 g[ 9, 10] 。可能是培养基中玉米 浆等成分中已含有足够的 P L P, 反应时勿需 另加 P L P 作辅酶。
为了保证主反应进行, L -Asp- -脱羧酶 反应中, 需在 基质 中流 加 低浓 度( 0. 1 mM
第一作者简介: 徐 虹, 女, 1964 年生, 博士, 副教授。
1998 年 第 28 卷 第 1 期
工 业 微 生 物
— 39 —
PL P ) 辅酶, 以保持酶活性。 PL P 价格 昂贵, 为 150 元/ g , 按上述 浓
4 结论
从上述生产工艺, 每克菌体对底物的转 化率, 提取收率和生产成本等方面比较来看, L -Ala 生产采用游离细胞法较固定化细胞法 更为有利。从所收集资料来看, 日本等国对 L -Ala 生产早期研究集中在固定化方法上, 而近几年来, 用游离细胞法生产 L -Ala 的研 究越来越多。
参 考文 献
在生产实践中发现, 每升转化液生成 L Ala 量达 1. 2 kg ～1. 7 kg , 大量 L -Ala 结晶 析出, 分离后即为 L -Al a 粗品, 经过简单脱色 重结晶, 产品即符合美国药典ⅩⅩⅡ版标准。 L -Ala 提取收率达 90% 以上。
3 生产成本
游离细 胞法每克菌体 对底物转化 率更 高, 且较固定化细胞法, 省去了固定化材料、 辅酶 PL P , 故原材 料消耗更少, 提取收 率也 较固定化方法高。毫无疑问, 游离细胞法 L Ala 生产成本较固定化细胞法低得多。
就决定了目的产物含量不会高。相反, 游离细 胞法生产 L -Ala 时, 随着 L -Asp 不断消 耗, L -Ala 不断生成, L -Ala 从反应液中结晶, 消 除了产物的抑制, 故大大提高目的产物含量。 根据 James Baily 的研究[ 11] , 分离起始 浓度 与产品价格几乎成线性关系, 分离起始浓度 提 10 倍, 生产成本可能降低至近 1/ 10。
[ 11] 俞俊 棠、唐孝宣. 生 物工 艺学 ( 上册) , 上海: 华 东化工学院出版社, 1991, 12: 244
64 5
[ 2] 三菱油 化株式 公社, L -
! ( 丙氨 酸) 的制
造法. 日本公开 特许, 平 2- 79989, 1990- 03-
20 .
[ 3] 三菱油 化株式 公社, L -
! ( 丙氨 酸) 的制
造法. 日本公开特许, 平 2- 242690; 1990- 09-
27 .
( 下转第 44 页)
[ 25] Ying - Chieh T . et al. A pplied and Envir nm ent al M icr obio lo gy , 1988; 54 ( 12 ) : 3156 31 61
[ 26 ] Hiro shi T . Y ing-Chieh T . et al. Bio sci, Biotech. Biochem. , 1995; 59 ( 8) : 1591 15 92
— 44 —
工 业 微 生 物
1998 年 第 28 卷 第 1 期
[ 15] CA 77: 46739, Br it, 1972; 1274425 [ 16] CA 92: 53987, Bio khimya , 1979; 44: 1972 [ 17] CA 83: 92954, Bio or g , khim. , 1975; 1: 554 [ 18 ] CA 100: 152864, L iet , T SR M okslu, A cad.
[ 9] 徐 虹、王雪 根、刘 济瑞等, 利用 假单胞 菌 L -天 冬氨酸- -脱酸酶高效 生产 L -丙 氨酸. 南京化工 学院学报. 1995; 17( 1) : 1- 6.
[ 10] 徐 虹、王雪根、朱建良等. L -丙氨酸 酶法工业 生产的研究, 1997; 27( 2) : 17- 20
— 38 —
工 业 微 生 物
1998 年 第 28 卷 第 1 期
游离细胞法与固定化细胞法生产 L -丙氨酸的比较
徐 虹 王雪根 范伟平 欧阳平凯
( 南京化工大学生物工程与科学系, 南京 210009)
摘 要
利用假单胞菌的 L -天冬氨酸- -脱羧酶从 L -天冬氨酸生产 L -丙氨酸, 具体方法 有两种, 一种为游离细胞法, 另一种为固定化细胞法。本文比较这二种方法的生产工 艺、转化率、提取收率和生产成本后得出结论: 采用游离细胞法生产 L -Ala 优于固定 化细胞法。
70 年代以来, 固定化技术的优越性不断 被人们认识, 也越来越多地应用于生产, 它的 最大的优势在于连续化生产。但对一种特定 的酶促反应而言, 究竟应选用游离酶法还是 固定化细胞法, 则应根据酶的成本、酶的稳定 性以及转化过程的特性等因素而定。
对于 L -Ala 生产, 若采用固定化法, 则需 解决下面二个问题。 1. 1 反应器的加压问题
[ 1] Chibata I , K akimo to . T , and K ato . Enzy matic
pr oduction of L -A lanine by Pseud omonas da-
cunhae, J. A ppl M icr obio . , 1965; 13( 5) : 630-
[ 27] 吴大庆等. 中国生化药物杂志, 1993; ( 2) : 37 [ 28] 周祖荫等. 中国生化药物杂志, 1992; ( 3) : 33
( 上接 39 页)
[ 4] 三菱油 化株式 公社, L -
! ( 丙氨 酸) 的制
造法. 日本公开特许, 平 4- 197190, 1992- 09-
由于该酶反应为脱羧反应, 涉及 CO2 释 放, 若在常压下进行, 生成的 CO 2 气体散失, 因而使反应液的 pH 偏向碱性, 离开反应的 最适 pH( 6. 0～6. 5) , 又由于是固、液、气三相 反应, 把固定化细胞装柱进行反应, 基质溶液 的流动不能形成活塞流, 反应效率低下。 1. 2 酶活性问题
27Байду номын сангаас.
[ 5] 三菱油 化株式 公社, L -
! ( 丙氨 酸) 的制
造法. 日本公开特许, 平 5- 038292, 1993- 02-
20 .
[ 6 ] M itsubishi P etr ochemicat co L td. P ro cess of
culturing micro or ganisms of the g enus pseu-
度, 生产一吨 L -Ala 消耗在 PL P 上的费用为 2 万元左右。
K O ZO 等人报道[ 8] , 用卡拉胶包埋假单 胞菌, 经戊二醛处理后固定化细胞的酶活性 是游离细胞的 52% , 当含有 0. 1 mM P L P 的 2M L 天冬 氨酸铵( pH6. 2) 底物溶液通 过固 定化柱, 37 °C保持 8 h 后, L -Asp 完全转化为 L -Ala, 半衰期为 46 天。根据试验结果, 每克 湿细胞制得的固定化细胞共转化 L -Asp 50 g 左右。该结果尚是小试结果, 可以想象, 如 果扩大生产, 在气温较高、湿度较大、无菌程 度不够理想等情况下, 该半衰期则更短, 转化 率更低。
从每克菌体对 L -Asp 转化率比较 可以 看出, 游离细胞法较固定化细胞法高。从操作 复杂性而言, 固定化细胞法较游离细胞法多 出高速离心和细胞固定制作工序。在国内, 卡 拉胶包埋, 切成凝胶块尚需手工操作。根据我 们实践, 游离细胞法生产操作比较简单, 工艺 控制较为粗放。
2 提取和产品质量
固定化细胞法由于菌体不混入到产物, 可精简产物分离工序。但是由于固定化细胞 的内、外扩散阻力较大, 加上丙氨酸溶解度较 低( 25°C 时 溶解度 为 15% ) , 若底 物浓度 过 高, 形成的产物在固定化柱内析出影响流动, 故底物浓度一般选择在 1 M ～2 M 浓度, 这
天冬氨 酸( 简称 L -Asp ) , 酶 法转化 生成 L -
Ala, 反应式为:
CO OH L -A sp- -脱羧酶 CH3
+ CO2
CH2
CH N H2
CH NH2
CO O H
CO OH
具体做法有游离细胞法[ 1-6] ( 菌体培养液作酶 源, 直接加底物转化) 和固定化细胞法[ 7, 8] 两 种。本文就这两种方法在酶对底物的转化率、 生产工艺、提取收率和生产成本等方面作一 分析比较。
[ 8] Y amamo ta K . , T o ea T . and Ichino C. , Continuo usly pro duction of L -A lanine by immo bilizoed Pseudomonas w ith car r ageenan, Bio tech. and Bioeng. 1980; 22( 10) : 2045- 2049
1 生产工艺、转化率
游离细胞法生产 L -Ala 工艺流程如下:
Asp 固体
菌体培养
酶转化
抽滤
L -Ala 粗品 母液
稀释
脱色过滤 真空浓缩 干燥
固定化 细胞法生 产 L -Ala 工艺流程 如
下: L -天冬氨酸铵
PLP( 磷酸吡哆醛)
菌体培养 离心 固定化 酶转化 脱色、 浓缩、结晶 干燥
domo nas and pr ocess fo r pro ducting L -a lanine
using said micr oo rg anism. Eur opean P atent
045170A 2, 1991- 04- 26
[ 7] T akamatsu. S, Y amamot o. K . and T o sa T et
P 215 [ 20] 颜子颖, 关 国雄等. 微 生物 学报, 1995; 35( 1) :
50- 57 [ 21] 关 国 雄, 颜 子 颖 等. 生 物 化 学 杂 志, 1994; 10
al, Stabilizatio n of L -A spar dta te- -decarbo xy -
lase activity of P seudomonas dacunhae immo bi-
lized with carr ag eenan. J. Fer ment T echnol 1981, 59( 6) : 489- 493.
关键词: L-丙氨酸, 游离细胞法, 固定化细胞法, 比较
L -丙氨酸( L -Al anine, 以下简称 L -Ala)
作为一种带有特殊甜味的氨基酸, 在医药、食
品工业上的应用相当广泛。目前, L -丙氨酸
生产最有效的方法是酶法转化, 即利用培养
假单胞菌产生的 L -天冬氨酸- -脱羧酸从 L -
( 5) : 521- 525 [ 22] M ahendr a K . et al. Infect. I mmu. , 1985; 50:
534- 540
[ 23] T sai Y ch: et al. Bio chem. Bio phy l. A ct a, 1986; 883: 439
[ 24] M o hinder K . et al. Can J. M icr obial. , 1988; 34: 855
采用游离细胞法生产 L -Ala 不会面临上 述问题, 我们将含高酶活 L -Asp- -脱羧酶的 假单胞菌 30 °C, 24 h 培养后, 将培养液作为 酶源直接加固体 L -Asp 转化, 转化 7 天, 每 升酶液可转化 L -Asp 2 kg, 最高达 2. 5 kg 。 若菌体浓度按 3% 计算, 则每克菌 体可转化 L -A sp 67 g ～83 g[ 9, 10] 。可能是培养基中玉米 浆等成分中已含有足够的 P L P, 反应时勿需 另加 P L P 作辅酶。
为了保证主反应进行, L -Asp- -脱羧酶 反应中, 需在 基质 中流 加 低浓 度( 0. 1 mM
第一作者简介: 徐 虹, 女, 1964 年生, 博士, 副教授。
1998 年 第 28 卷 第 1 期
工 业 微 生 物
— 39 —
PL P ) 辅酶, 以保持酶活性。 PL P 价格 昂贵, 为 150 元/ g , 按上述 浓
4 结论
从上述生产工艺, 每克菌体对底物的转 化率, 提取收率和生产成本等方面比较来看, L -Ala 生产采用游离细胞法较固定化细胞法 更为有利。从所收集资料来看, 日本等国对 L -Ala 生产早期研究集中在固定化方法上, 而近几年来, 用游离细胞法生产 L -Ala 的研 究越来越多。
参 考文 献
在生产实践中发现, 每升转化液生成 L Ala 量达 1. 2 kg ～1. 7 kg , 大量 L -Ala 结晶 析出, 分离后即为 L -Al a 粗品, 经过简单脱色 重结晶, 产品即符合美国药典ⅩⅩⅡ版标准。 L -Ala 提取收率达 90% 以上。
3 生产成本
游离细 胞法每克菌体 对底物转化 率更 高, 且较固定化细胞法, 省去了固定化材料、 辅酶 PL P , 故原材 料消耗更少, 提取收 率也 较固定化方法高。毫无疑问, 游离细胞法 L Ala 生产成本较固定化细胞法低得多。
就决定了目的产物含量不会高。相反, 游离细 胞法生产 L -Ala 时, 随着 L -Asp 不断消 耗, L -Ala 不断生成, L -Ala 从反应液中结晶, 消 除了产物的抑制, 故大大提高目的产物含量。 根据 James Baily 的研究[ 11] , 分离起始 浓度 与产品价格几乎成线性关系, 分离起始浓度 提 10 倍, 生产成本可能降低至近 1/ 10。
[ 11] 俞俊 棠、唐孝宣. 生 物工 艺学 ( 上册) , 上海: 华 东化工学院出版社, 1991, 12: 244
64 5
[ 2] 三菱油 化株式 公社, L -
! ( 丙氨 酸) 的制
造法. 日本公开 特许, 平 2- 79989, 1990- 03-
20 .
[ 3] 三菱油 化株式 公社, L -
! ( 丙氨 酸) 的制
造法. 日本公开特许, 平 2- 242690; 1990- 09-
27 .
( 下转第 44 页)
[ 25] Ying - Chieh T . et al. A pplied and Envir nm ent al M icr obio lo gy , 1988; 54 ( 12 ) : 3156 31 61
[ 26 ] Hiro shi T . Y ing-Chieh T . et al. Bio sci, Biotech. Biochem. , 1995; 59 ( 8) : 1591 15 92
— 44 —
工 业 微 生 物
1998 年 第 28 卷 第 1 期
[ 15] CA 77: 46739, Br it, 1972; 1274425 [ 16] CA 92: 53987, Bio khimya , 1979; 44: 1972 [ 17] CA 83: 92954, Bio or g , khim. , 1975; 1: 554 [ 18 ] CA 100: 152864, L iet , T SR M okslu, A cad.
[ 9] 徐 虹、王雪 根、刘 济瑞等, 利用 假单胞 菌 L -天 冬氨酸- -脱酸酶高效 生产 L -丙 氨酸. 南京化工 学院学报. 1995; 17( 1) : 1- 6.
[ 10] 徐 虹、王雪根、朱建良等. L -丙氨酸 酶法工业 生产的研究, 1997; 27( 2) : 17- 20
— 38 —
工 业 微 生 物
1998 年 第 28 卷 第 1 期
游离细胞法与固定化细胞法生产 L -丙氨酸的比较
徐 虹 王雪根 范伟平 欧阳平凯
( 南京化工大学生物工程与科学系, 南京 210009)
摘 要
利用假单胞菌的 L -天冬氨酸- -脱羧酶从 L -天冬氨酸生产 L -丙氨酸, 具体方法 有两种, 一种为游离细胞法, 另一种为固定化细胞法。本文比较这二种方法的生产工 艺、转化率、提取收率和生产成本后得出结论: 采用游离细胞法生产 L -Ala 优于固定 化细胞法。
70 年代以来, 固定化技术的优越性不断 被人们认识, 也越来越多地应用于生产, 它的 最大的优势在于连续化生产。但对一种特定 的酶促反应而言, 究竟应选用游离酶法还是 固定化细胞法, 则应根据酶的成本、酶的稳定 性以及转化过程的特性等因素而定。
对于 L -Ala 生产, 若采用固定化法, 则需 解决下面二个问题。 1. 1 反应器的加压问题
[ 1] Chibata I , K akimo to . T , and K ato . Enzy matic
pr oduction of L -A lanine by Pseud omonas da-
cunhae, J. A ppl M icr obio . , 1965; 13( 5) : 630-
[ 27] 吴大庆等. 中国生化药物杂志, 1993; ( 2) : 37 [ 28] 周祖荫等. 中国生化药物杂志, 1992; ( 3) : 33
( 上接 39 页)
[ 4] 三菱油 化株式 公社, L -
! ( 丙氨 酸) 的制
造法. 日本公开特许, 平 4- 197190, 1992- 09-
由于该酶反应为脱羧反应, 涉及 CO2 释 放, 若在常压下进行, 生成的 CO 2 气体散失, 因而使反应液的 pH 偏向碱性, 离开反应的 最适 pH( 6. 0～6. 5) , 又由于是固、液、气三相 反应, 把固定化细胞装柱进行反应, 基质溶液 的流动不能形成活塞流, 反应效率低下。 1. 2 酶活性问题
27Байду номын сангаас.
[ 5] 三菱油 化株式 公社, L -
! ( 丙氨 酸) 的制
造法. 日本公开特许, 平 5- 038292, 1993- 02-
20 .
[ 6 ] M itsubishi P etr ochemicat co L td. P ro cess of
culturing micro or ganisms of the g enus pseu-
度, 生产一吨 L -Ala 消耗在 PL P 上的费用为 2 万元左右。
K O ZO 等人报道[ 8] , 用卡拉胶包埋假单 胞菌, 经戊二醛处理后固定化细胞的酶活性 是游离细胞的 52% , 当含有 0. 1 mM P L P 的 2M L 天冬 氨酸铵( pH6. 2) 底物溶液通 过固 定化柱, 37 °C保持 8 h 后, L -Asp 完全转化为 L -Ala, 半衰期为 46 天。根据试验结果, 每克 湿细胞制得的固定化细胞共转化 L -Asp 50 g 左右。该结果尚是小试结果, 可以想象, 如 果扩大生产, 在气温较高、湿度较大、无菌程 度不够理想等情况下, 该半衰期则更短, 转化 率更低。
从每克菌体对 L -Asp 转化率比较 可以 看出, 游离细胞法较固定化细胞法高。从操作 复杂性而言, 固定化细胞法较游离细胞法多 出高速离心和细胞固定制作工序。在国内, 卡 拉胶包埋, 切成凝胶块尚需手工操作。根据我 们实践, 游离细胞法生产操作比较简单, 工艺 控制较为粗放。
2 提取和产品质量
固定化细胞法由于菌体不混入到产物, 可精简产物分离工序。但是由于固定化细胞 的内、外扩散阻力较大, 加上丙氨酸溶解度较 低( 25°C 时 溶解度 为 15% ) , 若底 物浓度 过 高, 形成的产物在固定化柱内析出影响流动, 故底物浓度一般选择在 1 M ～2 M 浓度, 这
天冬氨 酸( 简称 L -Asp ) , 酶 法转化 生成 L -
Ala, 反应式为:
CO OH L -A sp- -脱羧酶 CH3
+ CO2
CH2
CH N H2
CH NH2
CO O H
CO OH
具体做法有游离细胞法[ 1-6] ( 菌体培养液作酶 源, 直接加底物转化) 和固定化细胞法[ 7, 8] 两 种。本文就这两种方法在酶对底物的转化率、 生产工艺、提取收率和生产成本等方面作一 分析比较。
[ 8] Y amamo ta K . , T o ea T . and Ichino C. , Continuo usly pro duction of L -A lanine by immo bilizoed Pseudomonas w ith car r ageenan, Bio tech. and Bioeng. 1980; 22( 10) : 2045- 2049
1 生产工艺、转化率
游离细胞法生产 L -Ala 工艺流程如下:
Asp 固体
菌体培养
酶转化
抽滤
L -Ala 粗品 母液
稀释
脱色过滤 真空浓缩 干燥
固定化 细胞法生 产 L -Ala 工艺流程 如
下: L -天冬氨酸铵
PLP( 磷酸吡哆醛)
菌体培养 离心 固定化 酶转化 脱色、 浓缩、结晶 干燥
domo nas and pr ocess fo r pro ducting L -a lanine
using said micr oo rg anism. Eur opean P atent
045170A 2, 1991- 04- 26
[ 7] T akamatsu. S, Y amamot o. K . and T o sa T et